Summary
Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.
Abstract
Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten für Fortgeschrittene und wiederkehrende Kopf- und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) umschließen Strahlen- und Chemo-Bestrahlung Ansätze mit oder ohne Operation. Während Platin-basierten Chemotherapie-Regimen derzeit stellen den Gold Standard in Bezug auf die Wirksamkeit und sind in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle, neue Chemotherapie-Regimen gegeben nämlich Immuntherapie entstehen. Die Response-Raten und Therapie Resistenzmechanismen für entweder Chemo-Therapie sind jedoch schwer zu prognostizieren und bleiben nur unzureichend verstanden. Breitere Variationen von Chemo- und Strahlentherapie Resistenzmechanismen sind bisher bekannt. Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, Hochdurchsatz- in-vitro- Assays als zukünftige Werkzeug für personalisierte Tumor lokal Zelllinie Reaktion auf verschiedene Therapie-Schemata, und hoffentlich auf Primärzellen von einzelnen Patienten einzuschätzen Therapie. Der Test wurde entwickelt, um die qualitätsgesicherte Standardalgorithmus für lokal Patienten in unserem Center tertiäre Versorgung integriert wird; Dies wird jedoch Gegenstand zukünftiger Studien sein. Technischer Machbarkeit sieht vielversprechend aus für primäre Zellen vom Tumor Biopsien von tatsächlichen Patienten. Proben werden dann in das Labor übertragen. Biopsien werden mechanisch getrennt, gefolgt von enzymatischen Verdauung. Zellen werden dann in extrem niedrige Adhäsion Zelle Kultur Fläschchen kultiviert, die reproduzierbare, standardisierte und spontane Bildung von dreidimensionalen, Sphäroid-förmige Zelle Konglomerate zu fördern. Sphäroide sind dann bereit, Chemo-Bestrahlung Protokolle und Immuntherapie Protokolle nach Bedarf ausgesetzt werden. Die endgültige Zellengröße Lebensfähigkeit und Sphäroid sind Indikatoren für Therapie-Anfälligkeit und konnte daher in Betracht in Zukunft zu beurteilen, die Patienten wahrscheinlich therapieantwort gezogen werden. Dieses Modell könnte eine wertvolle, kostengünstige Instrument für personalisierte Therapie bei Kopf-Hals-Tumoren.
Introduction
Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) ist die sechsthäufigste Krebsart weltweit mit einer steigenden Inzidenz von Schleimhaut human Papilloma Virus (HPV) Infektion-assoziierten Pathogenese, neben den meisten Fällen verursacht durch übermäßigen Nikotin- und Alkoholkonsum Verbrauch 1,2. Während kleinere Tumoren und vor invasiven Stadien in der Regel gut behandelbar mit chirurgische Exzision sind, in der Regel kombiniert mit zervikalen Lymphknoten Dissektion, bleibt die Behandlung für fortgeschrittenen und wiederkehrende lokal schwierig wegen aggressiven Tumorinvasion mit Metastasierung und Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie-Protokolle3,4,5,6,7,8. Neuere Studien legen nahe, eine hohe Variabilität des zellulären Phänotyps und Sub-Charakterisierung von zirkulierenden und disseminierter Tumorzellen hat gerade erst begonnen,9,10. Der frühere glaube eines festen, einheitlichen Tumors Masse musste in der Vergangenheit im Lichte der jüngsten Studien revidiert werden Jahre11,12,13,14. Aktuelle Ansätze zur Tumor-Charakterisierung und Identifizierung der wichtigsten Mutationen konnten mehrere Gene identifizieren, die scheinen zu Therapieresistenz zugeordnet werden, sondern bleiben eine kostenintensive Ansatz. Kenntnisse des Genotyps ermöglicht darüber hinaus nicht notwendigerweise eine zuverlässige Vorhersage der Phänotyp und den Behandlungserfolg.
Es wurden einige Fortschritte bei der Verbesserung der allgemeinen und krankheitsfreien Überleben für die fortgeschrittenen und wiederkehrende Krankheit. Für Nikotin - sowie Virus-assoziierten Karzinomen beilegen aktuelle Behandlungsoptionen neben Chirurgie aggressive Strahlung und Platin-basierten Chemotherapie-Regimen. Es wurden Auswirkungen auf die verschiedenen Response-Raten zwischen HPV-negativen und positiven Karzinom; aber dies ist noch nicht führen zu einer Veränderung im allgemeinen Therapierichtlinien. Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie ist ein weit verbreitetes Phänomen in allen Tumorstadien und existiert für Platin-basierten Chemotherapie sowie zielgerichtete Therapie (Anti-EGFR; epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor) und vor kurzem neue Checkpoint Hemmung15. Unwirksame Strahlen- und Chemotherapie kommen zu einem hohen Preis von erheblichen geduldigen Morbidität bei Dysphagie, Mukositis, Mundtrockenheit und Risiko der Abnahme der Nieren- oder kardiale Funktion unter anderem. Vorhersage der Reaktion vor der Therapie scheint die Entscheidung des allgemeinen Therapiekonzept für jeden einzelnen Patienten das entscheidende Ziel, verhindern unnötige Behandlungskonzepte, Nebenwirkungen und Kosten.
Wir versuchten, ein Modell des einzelnen Patienten Behandlung Anfälligkeit gegenüber aktuellen standard Chemo-Bestrahlung zu testen, der in der regulären und qualitätskontrollierten onkologischen Behandlung Algorithmus von einem technischen Stand Punkt integriert werden konnte. Ferne Ziel war es, das Modell ohne verwenden stark verändert und im Alter von Zelllinien, wie schlecht sie tatsächlichen menschlichen Tumorzellen ohne ihre Variabilität vertreten und Heterogenität wie wir jetzt, während der Einrichtung des Protokolls Wissen in verschiedenen Zelllinien erfolgte. Um nur von im Handel erhältlichen Zelllinien unabhängig zu sein, erzielten wir kürzlich erfolgreich eine mittlere Zell-Linie namens "PiCa" aus primären lokal Zellen aus menschlichen Tumor Proben mit konservierten zellulären Marker auf seine Oberflächen und begrenzte Passagen 16. this PiCa-Zell-Linie soll dazu dienen als Vorbereitung für die Entwicklung des Modells auf die Straße, dann später nach Prozessen mit frischem menschlichen Krebszellen vom Tumor Biopsien. Es hat sich gezeigt, dass Zellen in dreidimensionale Zelle Kulturen unterschiedlich reagieren und mehr in-Vivo-gerne Verwaltung von Krebs-Medikamente als die wachsende Monolagen17,18,19,20 ,21, vor allem auf Erhaltung der wandernden und Sub Differenzierung Eigenschaften von bestimmten Zelle Teilmengen22,23,24. Hier beschreiben wir das Protokoll ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales Modell von intermediate Zelllinien und primären menschlichen Plattenepithelkarzinom Zellen und Möglichkeiten wie ein solches Modell in Krebsbehandlung von Kopf-Hals-Chirurgen und Onkologen ( integrieren Abbildung 1).
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Protocol
Alle Studien, die in dieser Handschrift, nämlich die Verwendung von menschlichen Tumor Proben dargestellt sind unter und in Zustimmung mit früheren Entscheidungen von Universität Medizin der Universität Mainz/Munich Medical Center Ethikkommission geschützt. Patienten erhielten Einwilligung gemäß nationalen gesetzlichen Bestimmungen, die Zustimmung zur wissenschaftlichen Nutzung der überschüssigen biologisches Material, das im Laufe ihrer Behandlung abgerufen wurde. Forschung wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationale und internationale Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt.
1. nehmen eine Tumor-Biopsie von Kopf und Heck Squamous Zelle Krebsgeschwür
- Allgemein (Propofol und/oder Sevofluran, Muskel entspannende Agent) oder lokale Infiltration (2 % Ultracaine, Adrenalin) ausführen / surface (Xylocain) Anästhesie im OP-Saal oder HNO Untersuchungsstuhl. Visualisieren Sie die Tumor-Masse in mündlichen Hohlraum/Rachen/Kehlkopf/andere Teile des oberen Verdauungs- und Atemwege Trakt mit normalen Betrieb Instrumente und ggf. unter die Lupe genommen.
- Nehmen Sie eine frische Tumor-Biopsie von der Peripherie der Krebsartigen Läsion mit stumpfen oder Spitzen Instrumenten. Vermeiden Sie das Zentrum der Läsion durch reichlich Nekrose in diesem Bereich. Setzen Sie die erhaltenen Gewebe in einen sterilen Behälter mit isotonische Natriumchlorid-Lösung.
- Nach der Biopsie durchführen Blutstillung nach Bedarf, zB., mit einem bipolaren oder monopolaren Koagulation Gerät neben dem Einsatz von vasokonstriktorische Substanzen.
- Bringen Sie die Tumor-Biopsie für Zellexperimente Kultur direkt mit dem angrenzenden Labor-Trakt verwendet werden soll. Senden Sie anderen Tumor Biopsien an der Pathologe wie üblich um Krebs auszuschließen.
- Stellen Sie sicher, dass ein Labortechniker bereit, die Probe direkt zu verarbeiten ist.
2. Verarbeitung der Tumor-Probe
- Die Tumor-Probe auf eine geeignete und sterile Oberfläche legen und gründlich mit einem sterilen Einweg-Skalpell in möglichst wenig Stücke schneiden.
Achtung: Achten Sie darauf, der Status der Infektions- und Blut übertragbare Krankheiten ist gut dokumentiert und der Techniker ist in der Aufmerksamkeit der Institutionen standard Protokolle zu verhindern, dass Nadel-Stick oder schneiden Verletzungen mit potenziell Biohazard Patientenmaterial und die Protokolle, nach Verletzungen zu folgen. - Nach ausreichende mechanische Trennung der primäre Gewebe, das Gewebe in ein Fläschchen mit Collagenase genommen ich / II und 1 h bei 37 ° c inkubieren Durch ein Sieb durch ein 70 µm Falcon Zelle Sieb und waschen Sie die Suspension mit Hanks' Balanced Salzlösung (HBSS).
-
Legen Sie nach der erfolgreichen Trennung und anschließende waschen die Aussetzung mit 1 – 2 × 106 Zellen in einem T75 Zellkulturflaschen (75 cm2), Sub-Konfluenz bei 5 % CO2 und Temperatur von 37 ° c zu wachsen Dieser Schritt kann bis zu 10 Tage dauern.
- Verwenden Sie spezielle Keratinozyten Kulturmedium bestehend aus den folgenden: 125 mL Dulbecco modifizierten Adler Medium (DMEM), 250 mL von Keratinozyten ergänzt Medium (ergänzt Medium bestehend aus 500 mL Keratinozyten SF Medium, 15 mg bovine Hypophyse Auszug (BPE), 2,5 mL Penicillin/Streptomycin, 150 ng rekombinanten menschlichen epithelialen Wachstumsfaktor (EGF), 516 µL von 300 mM CaCl2, Lager Mix im Voraus vorbereitet werden), 125 mL F12 Nährstoff-Mix, 10 mg BPE (0,75 mL), 75 ng rekombinanten menschlichen EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mm L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (Tabelle der Materialien).
(3) Aussaat die Zellen in ultra-geringe Haftung Zellplatten Kultur
- Zelle Wachstum des Tumors unter dem Mikroskop zu bestätigen. Zählen der Zellen in der Kultur (primäre oder Zellkultur) und Samen 5.000 Primärtumor oder 1.000-2.000 Zellen der mittleren Zelllinie / andere Zellinie in 200-300 µL der Medien (Schritt 3.2.) in eine extrem niedrige Adhäsion Platte mit konkaven, Runde Böden (96-Well).
-
Kultur der Zellen um 5 % CO2 bei 37 ° C und in gleichen Teilen DMEM und Atemwege Epithelzelle Medium (BEGM), fetale Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Natrium Pyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % L-Glutamin (Schritt 2.3.). Zell-Linien verwendet werden, reicht Medien auf der Grundlage von DMEM.
- Führen Sie Medien Änderungen jeden zweiten Tag. Achten Sie nicht auf das Sphäroid mit der Pipette während Medien Änderungen Aspirieren. Kultur der Sphäroide bis das Niveau des Wachstums, wie beschrieben in 3.3 (ca. 7-10 Tage) erreicht ist.
- Bestätigen Sie spontane Sphäroid Bildung unter dem Mikroskop durch dreidimensionale, Sphäroid-förmige Zelle Konglomerate suchen. Der Brunnen mit unregelmäßigen und/oder mehrere Sphäroid Bildung von weiteren Untersuchung ausschließen.
Hinweis: Sphäroide sollte mit dem bloßen Auge sichtbar sein, Erleichterung der Weiterverarbeitung und Medien Änderungen wie unten beschrieben.
(4) freilegen Sphäroide zu multimodalen Standard- oder experimentelle Tumortherapie
- Wählen Sie eine gewünschte Therapie Therapie. Ausreichend große Kontrollgruppen, die Vergleiche von Behandlungen zu unbehandelten Sphäroide oder Sphäroide empfangen nur teilweise Therapie-Schemata, z.B.zu entwerfen. Bestrahlung allein. Die Größe der Kontrollgruppen hängt vom experimentellen Gruppe Entwurf und nicht allgemein definiert werden.
- Tauschen Sie die Medien Medien mit Zusätzen, Bedeutung Medien mit Chemotherapeutika und/oder monoklonalen Antikörpern bei gewünschten Konzentrationen. Fügen Sie Cisplatin in den Konzentrationen von 2,5/5/10 µM oder 5-Fluoruracil (5FU) auf 30 µM.
Hinweis: Für Hochdurchsatz Experimenten oder große Gruppe Größen/große Anzahl von Gruppen, eine eine automatisierte Pipettierroboter können wie wir sind weiter in den Experimenten zu etablieren. - Alternativ Strahlen Sie Kultur Zellplatten mit Sphäroide bei 2 Gy mit einer geeigneten Strahlung-Anlage.
Achtung: Respektiere die Institution Protokolle zur Vermeidung von schädlichen Strahlenbelastung der Mitarbeiter. Arbeiten Sie nur mit ausgewiesenen und geschulte Techniker nach Strahlung-Datenschutz-Richtlinien. Falls gewünscht, fügen Sie Chemotherapeutika wie unter 4.2 beschrieben. danach. - Inkubieren Sie die Zellen für 24 h im zuvor beschriebenen Kulturbedingungen (37 ° C, Schritt 3.2).
- Nach der Inkubation weiter die Zellkultur für mindestens 6 Tage mit Medien Änderungen jeden zweiten Tag.
5. Bewertung der Sphäroid Umfang und Ausmaß der Zellproliferation für Assay auslesen
- Messen Sie die Sphäroid Größe flächenmäßig nach digitale Fotodokumentation am 6. Tag (Tag 10, 16. Tag) mit einer Grafik-Software (Parameter 1).
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation bei 520 X g 2,5 min der Platte des Überstands. Waschen Sie die Zellen mit ausreichender Menge 1 x PBS und Zentrifuge, die die Platte wieder wie beschrieben, gefolgt von der Überstand (PBS) entfernen.
- Jedes Fläschchen erlauben die Sphäroide auflösen fügen Sie 100 µL der enzymatischen Zelle Ablösung Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 8 min bei 37 ° c
- Überprüfen Sie für die erfolgreiche Auflösung des sphäroids unter die Lupe genommen. 100 µL DMEM hinzufügen. Zentrifugieren der Platte bei 520 X g 2,5 min. Entfernen des Überstands und Zellen in 100 µL DMEM auszusetzen.
- Führen Sie einen handelsüblichen farbmetrischen Verbreitung-Assay im Beispiel WST-8 Assay auf jedes Fläschchen gemäß des Herstellers Anweisungen25. Der Test in einem Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Reader (Parameter 2) ausgelesen.
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Representative Results
Wir konnten reproduzierbar Sphäroide aus einzelnen Zellsuspensionen, zuerst aus verschiedenen Zelllinien, die proprietäre PiCa-Zelllinie, später aus primären menschlichen Krebszellen, die aus frischen Tumor Biopsien abgeleitet, wie in Hagemann Et al. beschrieben einschließlich generieren . 26. wir werteten zwei bewährte Methoden für Sphäroid Generation; die zwei sind die so genannten hängenden Tropfen (HD) und der extrem niedrige Adhäsion (ULA) Methode, wobei diejenige wirksame und sichere. Wir waren in der Lage, die Vorteile der ULA-Methode im Vergleich zu HD, einschließlich schnelleres Sphäroid Wachstum, weniger Probleme mit der Handhabung, Verlust der Sphäroide mit starken Vibrationen und reproduzierbare Sphäroid Wachstum in Bezug auf Gleichmäßigkeit ( Platte Abbildung 2). Das Auftreten von mehreren Sphäroide pro Fläschchen war häufiger in der HD-Methode. Wir checkten für eine deutlichere Charakterisierung der Sphäroid Morphologie. Abbildung 3 zeigt eine Immundiagnostik Färbung für Ki67, eine Verbreitung Marker, der ein Sphäroid von PiCa Zellen. Wie in der Literatur beschrieben, bestehen Sphäroide weniger wuchernden Kern mit einer wuchernden Außenschicht, Nachahmung von verschiedenen Regionen der Proliferation von soliden lokal beim Menschen. In Vitro wie in Vivo, verursacht dies angeblich durch einen Farbverlauf mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt von Zellkulturmedien, was zu einer Abnahme von der Peripherie ins Zentrum des Tumors.
Dann wollten wir zeigen, dass die Probe Variationen in der Sphäroid Größe nach der Inkubation mit Chemotherapeutika oder Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu erkennen ist und hier zwei gemeinsamen standard Behandlungsschemata für lokal vertreten. Bevor der Test möglicherweise in eine Vorbehandlung Routine integrieren, wäre die Validierung der Empfindlichkeit des Tests eine Voraussetzung. Zwei Parameter wurden als Endpunkt des Tests zur Verfügung: Sphäroid Größe (Fläche, Parameter 1 aus Schritt 5.1.) und Verbreitung (siehe Parameter 2 aus Schritt 5.4), wird ein Surrogat-Marker für die Zellviabilität und Wachstumspotenzial nach der Therapie. Die Ergebnisse der Behandlungsstudien mit gemeinsamen chemotherapeutischen und Chemo-Bestrahlung Protokolle sind in Abbildung 4dargestellt. Belichtung und Inkubation von Sphäroide mit Cisplatin und 5FU führte zu einem deutlichen Rückgang der Wachstumsgeschwindigkeit im Laufe der Zeit im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollgruppe (p< 0,001). Strahlung mit 2Gy konnte Wachstumsgeschwindigkeit in signifikanter Weise zu reduzieren (p< 0,01). Überleben-Assay (WST-8) war in der Lage, einen weiteren, bedeutenderen Wert von Chemo-Bestrahlung mit Cisplatin im Vergleich zur Bestrahlung allein zu erkennen (p = 0,017), ein Unterschied bei der Beurteilung der Sphäroid Größe bisher unentdeckt. Dies unterstreicht seine Bedeutung für den Assay als Ganzes, seine Empfindlichkeit für kleine Änderungen therapieantwort vermehren.
Abbildung 1: Konzept eines Modells auf dem Weg zum zukünftigen personalisierten Therapie. Patienten mit entweder Hintergrund der Schleimhaut HPV-Infektion und/oder Geschichte von Tabak und Alkohol Missbrauch anwesend, um unsere tertiäre Versorgung Referenzzentrum für die Verdachtsdiagnose des Kopf-Hals-Tumoren. Biopsien von Schleimhaut verdachtsbereiche oder makroskopischen Tumormassen sind unter Narkose getroffen, um Diagnose zu sichern. Darüber hinaus nehmen wir Tumor Biopsien, dreidimensionale Sphäroid-förmigen Zellkulturen im Labor zu erzeugen. Auf ausreichende Wachstum der Primärzelle basierte Sphäroide setzen wir ihnen aktuelle standard oder experimentelle Behandlungsschemata für Einzeltherapie Reaktion zu testen. Weitere Analysen der genetischen und molekularen Veränderungen können nach der Analyse der Therapieergebnisse hinzugefügt werden. Therapie Ergebnisse in Vitro können in Betracht für den Prozess der Planung THERAPIEKONZEPTE für den Patienten gezogen werden. Diese Zahl ist aus Hagemann, J. Et Al. abgedruckt. 26, mit Erlaubnis von Autoren und Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: alle Zelllinien zuverlässige Sphäroide erzeugen könnte, Unterschiede in Größe und Dauer des Auslesen sind entsprechend Abbildung 1. In Vorversuchen bildeten Primärzellen nicht reproduzierbare Sphäroide in HD aber ULA Teller (unten links). Weitere Studien sollen durchgeführt werden, um Sphäroid wuchsmerkmalen von Primärzellen zu bewerten. Die Anzahl der Zellen auf der rechten Seite ist die ursprüngliche Anzahl der Zellen in der Flasche ein Sphäroid zu bilden. Diese Zahl ist aus Hagemann, J. Et Al. abgedruckt. 26, mit Erlaubnis von Autoren und Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Ki67 Immunchemie Färbung ein Sphäroid Slice (PiCa). Die Peripherie der Kultur zeigt Verbreitung wesentlich höher als zentrale Zellen, imitiert nährstoffverteilung in soliden Schleimhaut-Tumoren, die oft nekrotische Kerne zeigen. Diese Zahl ist aus Hagemann, J. Et Al. abgedruckt. 26, mit Erlaubnis von Autoren und Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Therapiestudien. (A) PiCa Zellen wurden angebaut, Sphäroide zu generieren (n = 12 pro Gruppe) in ULA Platten. Zellen wurden gemäß dem Protokoll mit entweder PBS stimuliert, wie Steuerung, Cisplatin bei 5 µM oder 5FU bei 30 µM. Größen der Sphäroide am Tag 6, 10 und 16 nach Standardprotokollen ermittelt wurden. Cisplatin und 5FU Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme der Größe (p-Werte sind Links unten im Abschnitt (B) identisch experimentelles Design wie in (A) angegeben (n = 12), aber mit zusätzlichen Strahlung von 2Gy. (C) Plot zeigt min bis max. Nach der p-Werte in (C), vorherige Bestrahlung mit 2Gy führte zu eine signifikante Abnahme der Sphäroid Größe in der Kontrollgruppe, Strahlentherapie zu imitieren und Strahlenempfindlichkeit von PiCa Zellen zeigen. Strahlung in Kombination mit Cisplatin Behandlung führte zu einen weiteren deutlichen Rückgang der Größe des sphäroids (p> 0.05). Plot zeigt min max. (C) berechnet p-Werte aus 2-Way ANOVA Analyse von Experimenten A und B. (D) WST8-Assay durchgeführt am 16. Tag als Alternative für planimetrischen (Bereich) Analyse der Sphäroide. WST8 Analysen konnten eine signifikante Abnahme der lebenden Zellen nach Chemo-Bestrahlung (2Gy Strahlung und Cisplatin) gegenüber Cisplatin allein zu erkennen (p = 0,017), daher zeigt den Vorteil der Kombination von planimetrischen Analyse und WST8 kolorimetrischen Probe zum Zeitpunkt der Assay auslesen. Plot zeigt min bis max. Diese Zahl ist aus Hagemann, J. Et Al. abgedruckt. 26, mit Erlaubnis von Autoren und Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir waren in der Lage, ein Protokoll, um reproduzierbare Sphäroide aus Zellsuspensionen, für beide Zelllinien und in Vorversuchen, primären menschlichen Tumorzellen zu generieren. Wir zunächst zwei zuvor beschriebene Methoden bewertet und identifiziert die ULA-Methode, eine Methode wo Kultur Platten mit ultraniedriger Klebeflächen verwendet werden, um für die Generation der einheitlichen dreidimensionalen Sphäroide die sicherer und zuverlässiger ist. Durch die Kombination von zwei separate Methoden für Assay auslesen (Größe/Fläche und Zelle Tragfähigkeit), ist diese multimodale Assay ausreichend empfindlich auf kleine Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren. Dies ist der erste Schritt zum Nachweis der technischen Machbarkeit für die spätere Integration des Tests in der klinischen Weg in unserem Center tertiäre Versorgung. In Zukunft könnte es verwendet werden, zu beurteilen (i) individuellen Tumor Anfälligkeit für gemeinsame erste oder zweite/dritte-Line Therapie-Protokolle (Chemo-Reagenzien, Strahlung) und experimentelle Therapie-Protokolle, (Ii) weiter charakterisieren die Tumorzellen aus frischen Proben und molekulare Oberfläche oder zytoplasmatischen Muster therapieantwort korrelieren. Sphäroide von Proben aus verschiedenen Tumor Lokalisierungen, z.B.Grund- und Lymphknoten-Metastasen, sind denkbar.
In der gesamten Anlage des Protokolls und der Methode haben wir verschiedene bekannte Zell-Linien, ein paar wird seit Jahrzehnten etabliert. Jahren die Zelllinien wirft Zweifel an ihrer Verbindung und Vergleichbarkeit zu aktuellen tatsächlichen menschlichen Tumorzellen, angeblich nach dem Verlust mehrerer Eigenschaften und Kennzeichen molekulare Marker. Ergebnisse aus in-vitro- Experimenten waren schwer zu reproduzieren in Mensch oder in Vivo Studien27. Daher konzentrieren wir auf eine Zelllinie, die vor kurzem aus menschlichen primären Tumorzellen in unserer Einrichtung, die gut charakterisierten16erzeugt. Mit dieser Zelllinie PiCa wir konnten Behandlung Experimente in einem größeren Maßstab und aktuellen Therapie-Erwartungen bestätigt. Dies unterstützt die Theorie, dass PiCa Zellen tatsächlichen menschlichen Tumor Verhalten besser als andere, im Alter und passagiert Zelllinien widerzuspiegeln, die zahlreiche Passagen unterzogen. Zellen, die unphysiologischen Auswahl aufgrund der langfristigen in-vitro- Bedingungen unterworfen sein können möglicherweise Chemo Strahlenempfindlichkeit bias. In den letzten Experimenten bestätigt wir die Machbarkeit mit Primärzellen in Bezug auf zuverlässige Sphäroid Bildung; Allerdings müssen weitere und größere Experimente durchgeführt werden, bevor Sie die Probe in die klinische Routine implementieren.
Es wird angenommen, dass Sphäroide und dreidimensionale Zellkultur im allgemeinen reagieren anders im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kultur als Chemotherapeutika oder Strahlung 28ausgesetzt. Die Architektur der Sphäroide führt zu einer Steigung von Sauerstoff und Nahrung Lieferung von Außenfläche zum Kern, und neuere Studien haben gezeigt, dass auch Drug-Delivery auf verschiedene Teile des Clusters dreidimensionale Zelle nicht einheitlich29. Darüber hinaus scheinen Zellen in Sphäroid Kultur bestimmte gen-Expressionsmuster, die Resistenzen in Tier zugeordnet sind Modelle 30zu bewahren. Wir empfehlen, dass auch so genannte Strahlenbeständigkeit, ein Feature, das mit Kopf-Hals-Tumoren bei zahlreichen Patienten verbunden worden ist ein Ergebnis der Zell-Zell-Interaktion und unterschiedliche Mikroumgebungen führt zu Schwankungen der Sauerstoffversorgung und Stoffwechselaktivität. Dieses Phänomen konnte in Sphäroide aufgrund einer erhöhten in Vivo -Funktionalität nachgeahmt werden. Die Verwendung von Primärzellen und die Generation der Sphäroide könnte so viele wie mögliche Merkmale in Vivo Tumorwachstum in Kombination mit eine kosteneffiziente Assay für das Studium Einzeltherapie Antwort erhalten abschließend.
Sicherlich gibt es Einschränkungen für den Ansatz. Bisher ist es unbekannt, wie Zellen aus verschiedenen einzelnen Patienten in der Tumorbehandlung ausgesetzt Probe durchführt, und wie vorausschauende Assays in Bezug auf die Korrelation mit der späteren Therapie-Ergebnis ist. Übermäßige Studien sind notwendig, um einfach die Leistung in Vitro vs. klinischen Verlauf zu vergleichen. Unter anderem nämlich zwei Faktoren tragen zu dieser Ungewissheit: Tumor Heterogenität und mangelnde kokultur mit Stromazellen und immune Zellen. Tumor-Heterogenität ist ein Phänomen, nicht völlig verstanden und besteht zwischen verschiedenen Unterseiten der primären, sowie zwischen primären und metastatischen Lokalisierung12. Seit den letzten Studien gibt es eine dritte Website wo sehr verschieden und spezialisierte Tumorzellen existieren und in Nischen durchsetzen können: Blut und Knochenmark sind in der Lage, Haus im Umlauf und disseminierter Tumorzellen9,10. Der Mangel an anderen Zelltypen wie Stromazellen und T-Zellen (als Vertreter für das Immunsystem) in der Zellkultur ist nicht beschränkt auf die Probe, sondern ein gültige Nachteil von den meisten in-vitro- Assays Tumor Therapie Anfälligkeit zu studieren. Im Lichte der jüngsten Arzneimittelzulassung und laufende Studien, die T-Zell-Antwort zu beeinflussen, müssen zukünftige Experimente für die Arzneimittelforschung in einer Kombination aus verschiedenen Tests und Methoden durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde gefördert durch ein Stipendium von der Universität München (FöFoLe Projekt-Nr.: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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