Summary
Beskriver vi utvecklingen av en sfäroid-baserade, tredimensionella i vitro -modell som gör det möjligt för oss att testa den nuvarande standarden av experimentell terapi behandlingsregimer för huvud och hals skivepitelcancer på cellinjer, syftar till att utvärdera terapi känslighet och resistens på primära celler från mänskliga prover i framtiden.
Abstract
Aktuella behandlings-alternativ för avancerade och återkommande huvud och hals skivepitelcancer (SCHH) bifoga strålning och cellgifter-strålning metoder med eller utan operation. Medan platinabaserad kemoterapi behandlingsregimer för närvarande representerar gold standard vad gäller effekt och ges i de allra flesta fall, nya kemoterapiregimer, nämligen immunterapi växer fram. Den svarsfrekvens och terapi resistensmekanismer för antingen chemo regim är dock svårt att förutsäga och förbli otillräckligt förstådda. Breda varianter av cellgifter och strålning resistensmekanismer är kända hittills. Denna studie beskriver utvecklingen av ett standardiserat, hög genomströmning i vitro assay att bedöma SCHH cell line's svar till olika terapi-regimer, och förhoppningsvis på primära celler från enskilda patienter som ett framtida verktyg för personlig tumör terapi. Analysen är utformad för att integreras i den kvalitetskontrollerade standard algoritmen för SCHH patienter på våra eftergymnasial vård center. men kommer att detta vara föremål för framtida studier. Teknisk genomförbarhet ser lovande ut för primära celler från tumör biopsier från riktiga patienter. Exemplaren överförs sedan till laboratoriet. Biopsier är maskinurbenat följt av enzymatisk nedbrytning. Celler odlas sedan i ultra-låg vidhäftning cell kultur injektionsflaskor som främjar reproducerbara, standardiserade och spontana bildandet av tredimensionella, sfäroid-formade cell konglomerat. Spheroids är sedan redo att utsättas för kemo-strålning och immunterapi protokoll som behövs. Den slutliga cellstorleken livskraft och sfäroid är indikatorer på terapi känslighet och därför kunde dras hänsyn i framtiden att bedöma patienternas sannolikt terapi svar. Denna modell skulle kunna vara en värdefull och kostnadseffektiva verktyg mot personlig terapi för huvud-och halscancer.
Introduction
Huvud och hals skivepitelcancer (SCHH) är den sjätte vanligaste cancerformen i världen med en stigande incidens av slemhinnor humant papillomvirus (HPV)-infektionsassocierad patogenes, bredvid en majoritet av fallen orsakas av överdriven nikotin och alkohol förbrukning 1,2. Medan mindre tumörer och pre invasiva stadier är oftast väl behandlingsbara med kirurgisk excision, oftast kombinerat med cervikal lymfkörtel dissektion, förblir behandling för avancerad-steg och återkommande SCHH utmanande på grund av aggressiv tumör invasion med metastasering och motståndskraft mot strålning och kemoterapi protokoll3,4,5,6,7,8. Nyligen genomförda studier tyder på en hög variabilitet av cellulära fenotyp, och sub karakterisering av cirkulerande och disseminerad tumörceller har bara börjat9,10. Tidigare uppfattningen av en solid och enhetlig tumör massa hade revideras mot bakgrund av nyligen genomförda studier tidigare år11,12,13,14. Nuvarande metoder för tumör karakterisering och identifiering av viktiga mutationer kunde identifiera flera gener som tycks vara associerad med terapimotstånd men förblir en kostnadsintensiv strategi. Kunskap om genotyp tillåter dessutom inte nödvändigtvis en tillförlitlig prognos fenotyp och dess behandlingssvar.
Det har varit några framsteg i att förbättra övergripande och Sjukdomsfri överlevnad för avancerad-steg och återkommande sjukdom. För nikotin - samt virus-associerade carcinom bifoga aktuella behandlingsalternativ förutom kirurgi aggressiva strålning och platinabaserad kemoterapiregimer. Det har konsekvenser för olika svarsfrekvenser mellan HPV-negativa och positiva karcinom; men detta har ännu inte leda till en förändring i allmänhet terapi riktlinjer. Motstånd mot strålning och kemoterapi är en utbredd företeelse i alla tumör stadier och finns för platinabaserad kemoterapi samt när det gäller riktad terapi (Anti-EGFR; epidermal tillväxtfaktor-receptorn) och nyligen nya checkpoint hämning15. Ineffektiva strålning och kemoterapi kommer till en hög kostnad av betydande patientens sjuklighet i form av dysfagi, mukosit, muntorrhet och risk för minskning av njur- eller hjärtats funktion bland annat. Förutsäga terapi svar före verkar beslutet av en allmän terapikoncept för varje enskild patient vara det avgörande målet, att förhindra onödig behandling begrepp, biverkningar och kostnader.
Vi försökt att etablera en modell för att testa patientens behandling känslighet mot nuvarande standard chemo-strålning som skulle kunna integreras i regelbunden och kvalitetskontrollerade onkologiska behandlingen algoritmen från en teknisk stående punkt. Långt målet var att använda modellen utan att använda kraftigt förändrad och äldre cellinjer, som de dåligt representerar faktiska mänskliga tumörceller utan deras variabilitet och heterogenitet som vi vet nu, medan inrättandet av protokollet gjordes i olika cellinjer. För att vara oberoende endast från kommersiellt tillgängliga cellinjer, genererade vi nyligen framgångsrikt en mellanliggande cellinje som kallas ”PiCa” från primära SCHH celler från mänskliga tumör prover med bevarade cellulära markörer på dess yta och begränsad passager 16. Detta PiCa cellinje bör tjäna som en förberedelse för utvecklingen av modellen på vägen till sedan senare efter rättegångar med färska mänskliga cancerceller från tumör biopsier. Det har visats att celler i tredimensionella cell kulturer reagerar olika och mer i vivo-vilja administrering av cancerläkemedel än de som växer i enskiktslager17,18,19,20 ,21, främst på grund av bevarande av flyttande och sub differentiering egenskaper vissa cell delmängder22,23,24. Här beskriver vi protokollet av en sfäroid-baserade, tredimensionell modell från mellanliggande cellinjer och primära mänskliga Skivepitelcancer celler och sätt hur integrera sådan modell i cancerbehandling av huvud och hals kirurg och onkolog ( Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier visat i detta manuskript, nämligen användningen av humana tumör exemplar, är skyddade under och i samtycke med tidigare beslut från medicin av Mainz/universitetaruniversitetar av Munich medicinsk Center etikkommitté. Patienter har gett ett informerat samtycke enligt nationella rättsliga riktlinjer godkänner du vetenskaplig användning av biologiska överskottsmaterial som erhölls under deras behandling. Forskningen har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd.
1. ta en tumör biopsi från huvudet och sjutton skivepitelcancer
- Utför allmänna (propofol eller sevofluran, muskel avslappnande agent) eller lokal infiltration (2% ultracaine, adrenalin) / ytvatten (Xylocain) anestesi i fåtöljen operationssalen eller ÖNH-undersökning. Visualisera tumören massan i orala kaviteten och svalget/struphuvudet/andra delar av övre mag- och respiratoriska tarmkanalen med standarden fungerar instrument och, om så behövs, under lupp.
- Ta en färsk tumör biopsi från peripheryen av cancerogena lesionen med trubbiga eller skärande instrument. Undvik mitten av lesionen på grund av riklig nekros i detta område. Sätta den erhållna vävnaden till en steril behållare med isoton natriumkloridlösning.
- Efter biopsi, utföra hemostas som behövs, t.ex., med en bipolär eller monopolär koagulering enhet utöver användningen av kärlsammandragande ämnen.
- Ta tumör biopsi avsedda att användas för cell kultur experiment direkt till den intilliggande laboratorium tarmkanalen. Skicka andra tumör biopsier till patologen som vanligt för att utesluta cancer.
- Kontrollera att en laboratorietekniker är klar att bearbeta preparatet direkt.
2. bearbetning tumör preparatet
- Placera tumör preparatet på en lämplig och steril yta och skär den grundligt med en steril skalpell för engångsbruk i så lite som möjligt bitar.
Försiktighet: Kontrollera status för infektions- och blodburna sjukdomar är väldokumenterad och teknikern i institutionerna standard protokoll att förhindra nål sticka eller skärskador med potentiellt biohazard patientmaterial och protokoll att följa efter eventuell skada. - Efter tillräcklig mekanisk separation av primära vävnad, sätta vävnaden i en injektionsflaska som innehåller kollagenas jag / II och inkubera i 1 timme vid 37 ° C. Sikten genom en 70 µm falcon cell sil och tvätta fjädringen med Hanks balanserad saltlösning (HBSS).
-
Efter lyckade separation och efterföljande tvättning, placera suspensionen som innehåller 1-2 × 106 celler i en T75 cell kultur kolvar (75 cm2) att växa till sub-konfluens på 5% CO2 och temperatur av 37 ° C. Det här steget kan ta upp till 10 dagar.
- Använda särskilda keratinocyter odlingsmedium som består av följande: 125 mL Dulbecco ändrade eagles medium (DMEM), 250 mL av keratinocyter kompletteras medium (kompletteras medium bestående av 500 mL keratinocyter SF Medium, 15 mg nötkreatur hypofysen extrahera (BPE), 2,5 mL penicillin/streptomycin, 150 ng rekombinant humant epitel tillväxtfaktor (EGF), 516 µL av 300 mM CaCl2, lager blandning förberedas i förväg), 125 mL av F12 näringsämne blandning, 10 mg BPE (0,75 mL), 75 ng rekombinant humant EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-dipeptid (tabell material).
3. sådd cellerna i ultra-låg vidhäftning Cell kultur plattor
- Bekräfta tumör celltillväxt under ett mikroskop. Räkna celler i kultur (primära eller cellodling) och utsäde 5.000 primärtumör celler eller 1,000-2,000 celler av mellanliggande cellinje / andra cellinje i 200-300 µL av media (steg 3,2.) i en ultra-låg vidhäftning plattan med konkav, runda bottnar (96 brunnar).
-
Odla cellerna på 5% CO2 vid 37 ° C och i lika delar DMEM och luftvägarna epitelial cell medium (BEGM), 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, 1% natrium pyruvat, 1% icke-essentiella aminosyror, 1% L-glutamin (steg 2.3.). Om cellinjer som används, är media på grundval av DMEM tillräcklig.
- Göra förändringar i media varannan dag. Uppmärksamma inte aspirera på sfäroid med pipetten under byte av media. Kultur spheroids tills nivån på tillväxt som beskrivs i punkt 3.3 är nådd (cirka 7-10 dagar).
- Bekräfta spontana sfäroid bildandet under mikroskopet genom letar tredimensionella, sfäroid-formade cell konglomerat. Utesluta brunnarna med oregelbundna och/eller flera sfäroid formation från vidare utredning.
Obs: Spheroids bör vara synlig med blotta ögat, alltför, att underlätta vidare bearbetning och media ändringar som beskrivs nedan.
4. utsätta Spheroids till multimodala Standard eller experimentella tumör terapi
- Välj en önskad behandlingsregim. Design tillräckligt stor kontrollgrupper som tillåter jämförelser av behandlingar till obehandlade spheroids eller spheroids får endast partiell behandlingsregimer, t.ex. strålning ensam. Storleken på kontrollgrupper beror på den experimentella grupp designen och kan inte definieras allmänt.
- Utbyta media till media med tillsatser, menande media med kemoterapeutika eller monoklonala antikroppar vid önskad koncentrationer. Lägg till Cisplatin på koncentrationerna av 2,5/5/10 µM eller 5-fluoruracil (5FU) vid 30 µM.
Obs: För hög genomströmning experiment eller stor grupp storlekar/stort antal grupper, kan man använda en automatiserad pipettering robot som vi etablerar ytterligare i experimenten. - Alternativt kan utstråla cell kultur plattorna med spheroids på 2 Gy med hjälp av en lämplig strålning anläggning.
Försiktighet: Respektera institutets protokoll angående förebyggande av skadlig strålningsexponering av anställda. Fungerar bara med utsedda och utbildade tekniker enligt strålning skydd riktlinjer. Om så önskas, tillsätt kemoterapeutika som beskrivs under 4.2. efteråt. - Inkubera cellerna för 24 h i tidigare beskrivna odlingsbetingelser (37 ° C, steg 3,2).
- Efter inkubering, fortsätta cellkulturen i minst 6 dagar med media förändringar varannan dag.
5. bedömning av sfäroid storlek och omfattning av cellulär Proliferation för Assay avläsningssystem
- Mät den sfäroid storleken när det gäller området efter digital fotodokumentation på dag 6 (dag 10, dag 16) med en grafisk programvara (parameter 1).
- Efter centrifugering vid 520 x g för 2,5 min av plattan, ta bort supernatanten. Tvätta cellerna med tillräcklig mängd 1 x PBS och centrifugera plattan igen enligt beskrivningen, följt av att ta bort supernatanten (PBS).
- Tillsätt 100 µL av enzymatisk cell avlossning lösning till varje injektionsflaska att tillåta spheroids att upplösa. Inkubera plattan för 8 min vid 37 ° C.
- Kontrollera om framgångsrika upplösning av sfäroid under mikroskopet. Tillsätt 100 µL av DMEM. Centrifugera plattan vid 520 x g för 2,5 min. ta bort supernatanten och avbryta cellerna i 100 µL av DMEM.
- Utföra en kommersiellt tillgänglig kolorimetriska proliferation assay, i exempel WST-8 test på varje injektionsflaska enligt tillverkarens instruktioner25. Läs analysen i en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) läsare (parameter 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har kunnat generera reproducibly spheroids från enda cellsuspensioner, först från olika cellinjer inklusive egenutvecklade PiCa cell-linjen, senare från primära mänskliga cancerceller som härrör från färsk tumör biopsier som beskrivs i Hagemann et al . 26. vi utvärderat två etablerade metoder för sfäroid generation; de två är den så kallade hängande drop (HD)-metoden och metoden ultra-låg vidhäftning (ULA), den sistnämnda är en mer effektiv och säker. Vi skulle kunna lyfta fram fördelarna med metoden ULA jämfört med HD, inklusive snabbare sfäroid tillväxt, färre problem med platta hantering, påföljande förlust av spheroids med tunga vibrationer och fler reproducerbara sfäroid tillväxt mätt i likformighet ( Figur 2). Förekomsten av flera spheroids per injektionsflaska var vanligare i metoden HD. Vi kollade för en mer distinkt karakterisering av sfäroid morfologi. Figur 3 visar en immunkemi färgning för Ki67, en markör för spridning av en sfäroid från PiCa celler. Som beskrivs i litteratur, består spheroids av en mindre frodas kärna med ett prolifererande yttre lager, härma olika regioner för spridning av fast SCHH hos människor. In vitro som in vivo, Detta orsakas förmodligen av en gradient av näringsämnen och syre från cell kultur media orsakar en minskning från periferin till centrum av tumören.
Vi försökte då Visa att analysen ska kunna upptäcka variationer i sfäroid storlek efter inkubering med cellgifter eller exponering för joniserande strålning, som här representerar två gemensamma standard behandlingsregimer för SCHH. Innan eventuellt integrera analysen i en förbehandling rutin, skulle validering av analysens känslighet vara en förutsättning. Två parametrar var tillgängliga som slutpunkt för analysen: sfäroid storlek (område, parameter 1 från steg 5.1.) och spridning (se parameter 2 från steg 5,4.), som en surrogatmarkör för cellernas viabilitet och tillväxtpotential efter terapi. Resultaten av behandling studierna med gemensamma kemoterapeutiska och kemo-strålning protokoll visas i figur 4. Exponering och inkubering av spheroids med cisplatin eller 5FU ledde till en betydande minskning i tillväxt hastighet över tiden jämfört med en obehandlad kontrollgrupp (p< 0,001). Strålning med 2Gy lyckades minska tillväxt hastighet på ett betydande sätt (p< 0,01). Överlevnad analysen (WST-8) kunde upptäcka en ytterligare, betydande värde av chemo-strålning med cisplatin jämfört med strålning ensam (p = 0,017), en tidigare oupptäckt skillnad i bedömningen av sfäroid storlek. Detta understryker dess betydelse för analysen som helhet, utöka dess känslighet för små förändringar terapi svar.
Figur 1: begreppet en modell på väg till framtida personlig terapi. Patienter med antingen bakgrund av slemhinnor HPV-infektion och/eller historia av tobak och alkohol missbruk presentera våra tertiär remiss vårdcentral för misstänkt diagnos av huvud och hals cancer. Biopsier av misstänkta mucosal områden eller makroskopisk tumör massorna tas under anestesi till säker diagnos. Dessutom tar vi tumör biopsier att generera tredimensionella sfäroid-formade cellodlingar i laboratoriet. Vid tillräcklig tillväxt av primär-cellen baserat spheroids utsätter vi dem för nuvarande standard eller experimentella behandlingsregimer att testa för individuell terapi svar. Ytterligare analyser av genetiska och molekylära variationer kan läggas efter analys av terapi resultat. Terapi resultat i vitro kan dras i beaktande för processen av planering terapi begrepp för patienten. Denna siffra är omtryckt från Hagemann, J. et al. 26, med tillstånd som beviljats av författarna och tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: alla cellinjer kan generera tillförlitliga spheroids; skillnader i storlek och tidpunkten för avläsning är enligt figur 1. I preliminära experiment, primärceller inte bildar reproducerbara spheroids i HD men ULA plattor (nederst till vänster). Ytterligare studier ska genomföras för att utvärdera sfäroid tillväxt egenskaper från primära celler. Antalet celler till höger är det ursprungliga antalet celler i injektionsflaskan med att bilda en sfäroid. Denna siffra är omtryckt från Hagemann, J. et al. 26, med tillstånd som beviljats av författarna och tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ki67 immunkemi färgning sfäroid bitens (PiCa). Peripheryen av kulturen visar mycket högre spridning än central celler, härma näringsämnen distribution i solid slemhinnor tumörer som visar ofta nekrotisk kärnor. Denna siffra är omtryckt från Hagemann, J. et al. 26, med tillstånd som beviljats av författarna och tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: terapi studier. (A) PiCa celler odlades att generera spheroids (n = 12 per grupp) i ULA plattor. Cellerna stimuleras enligt protokollet med antingen PBS som kontroll, cisplatin vid 5 µM eller 5FU på 30 µM. storlekar av spheroids bestämdes på dag 6, 10 och 16 enligt standardprotokoll. Cisplatin och 5FU behandling ledde till en avsevärd minskning i storlek (p-värden ges längst vänster i avsnitt (B) identiska experimentell design som i (A) (n = 12), men med ytterligare strålning av 2Gy. (C) handlingen visar min till max. Enligt p-värden som anges i (C), tidigare strålbehandling med 2Gy ledde till en signifikant minskning sfäroid storlek i kontrollgruppen, imitera strålbehandling och visar strålning känslighet av PiCa celler. Strålning i kombination med cisplatin behandling inte lett till en ytterligare signifikant minskning i storlek sfäroid (p> 0,05). Handlingen visar min till max. (C) beräknas p-värden från 2-vägs ANOVA analys från experiment A och B. (D) WST8-analysen görs på dag 16 som ett alternativ för planimetriskt (område) analys av spheroids. WST8 analyser skulle kunna upptäcka en avsevärd minskning i levande celler efter chemo-strålning (2Gy strålning och cisplatin) jämfört med enbart cisplatin (p = 0,017), därmed visar fördelen med att kombinera både planimetriskt analys och WST8 kolorimetriska analys vid tiden för analysen avläsning. Handlingen visar min till max. Denna siffra är omtryckt från Hagemann, J. et al. 26, med tillstånd som beviljats av författarna och tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har kunnat upprätta ett protokoll för att generera reproducerbara spheroids från cellsuspensioner, för både cellinjer och i preliminära experiment, primära mänskliga tumörceller. Vi först bedömas två tidigare beskrivna metoder och identifierade ULA-metoden, en metod där kultur plattor med ytor med extremt låg friktion används, ska vara säkrare och mer tillförlitlig för generering av enhetliga tredimensionella spheroids. Genom att kombinera två separata metoder för analys avläsningssystem (storlek/områdes- och cellinformation livskraft), är denna multimodal analys tillräckligt känslig att identifiera små skillnader mellan grupperna. Detta är det första steget mot motståndskraftigt av teknisk genomförbarhet för senare integrering av analysen i den kliniska vägen på vår eftergymnasial vård center. I framtiden, det skulle kunna användas till (i) utvärdera enskilda tumören känslighet för gemensamma första - eller andra-/ tredje linjens terapi protokoll (kemo-reagens, strålning) och experimentell terapi protokoll, (ii) ytterligare karakterisera tumörcellerna från färska prover och korrelera molekylära ytan eller cytoplasmisk mönster till terapi svar. Spheroids från prover kommer från olika tumör lokaliseringar, t.ex., primär och lymfkörtel metastaser, är tänkbara.
Under etableringen av protokollet och metod använde vi olika kända cellinjer, några är väl etablerad i årtionden. Enbart ålder av cellinjer väcker tvivel om deras anslutning och jämförbarhet att nuvarande faktiska mänskliga tumörceller, förmodligen efter att ha förlorat flera boenden och hallmark molekylära markörer. Resultat från in vitro- försök var svåra att återge i mänskliga eller in-vivo studier27. Därför fokuserade vi på en cellinje som nyligen genererade från människans primära tumörceller i vår anläggning som är väl karakteriserade16. Med denna cellinje PiCa, vi skulle kunna genomföra behandling experiment i större skala och bekräftade nuvarande terapi förväntningar. Detta stöder teorin att PiCa celler återspeglar faktiska mänskliga tumör beteende bättre än andra, mer åldern och anpassade cellinjer som genomgick många passager. Celler som kan genomgå icke-fysiologiskt urval på grund av långsiktiga in vitro- betingelser kan bias chemo-strålning känslighet. I senaste experiment bekräftade vi möjligheterna med primära celler när det gäller tillförlitlig sfäroid bildning; dock har ytterligare och större experiment som ska utföras innan man kan genomföra analysen i klinisk rutin.
Det antas att spheroids och tredimensionella cellkultur i allmänhet reagerar annorlunda jämfört med konventionella 2D-kultur när de utsätts för cellgifter eller strålning 28. Arkitekturen av spheroids leder till en gradient av syre och näring leverans från utsidan till core, och senare studier har visat att också drogen leverans till olika delar av tredimensionella cell klustret inte enhetlig29. Dessutom verkar celler i sfäroid kultur att bevara vissa gen uttrycksmönster som är associerade med resistens hos djur modeller 30. Vi föreslår att även så kallade strålning motstånd, en funktion som har kopplats till huvud och hals cancer hos många patienter, är ett resultat av cell-cell interaktioner och distinkta mikromiljö leder till variationer i syretillförsel och metabolisk aktivitet. Detta fenomen kunde vara härmade i spheroids på grund av en ökad in-vivo -funktionalitet. Sammanfattningsvis, möjliggör användning av primära celler och generering av spheroids oss att bevara så många som möjligt som kännetecknar i vivo tumörtillväxt i kombination med en kostnadseffektiv analys för att studera individuell terapi svar.
Visst finns det begränsningar för metoden. Hittills, är det okänt hur celler från olika enskilda patienter kommer att utföra i analysen att utsättas för tumörbehandling, och hur förutsägande analysen är när det gäller korrelation med senare terapi resultatet. Överdriven studier är nödvändiga för att helt enkelt jämföra prestanda i vitro vs. kliniska förloppet. Bland andra, nämligen två faktorer bidrar till denna osäkerhet: tumör heterogenitet och bristen på samarbete kultur med stromaceller och immuna celler. Tumör heterogenitet är ett inte helt förstådd fenomen och finns mellan olika underwebbplatser i primärt, liksom mellan primär och metastaserande lokalisering12. Sedan senaste studier, finns det en tredje anläggning där mycket distinkt och specialiserade tumörceller kan existera och råda i nischer: blod och benmärg kan hus cirkulerande och disseminerad tumör celler9,10. Avsaknaden av andra celltyper som stromaceller och T-celler (som representant för immunförsvaret) i cellkultur är inte begränsat till analysen, men en giltig nackdel med de flesta i vitro analyser studera tumör terapi känslighet. Mot bakgrund av nyligen drog godkännanden och pågående studier som påverkar T-cellssvar, måste framtida experiment för läkemedelsutveckling utföras i en kombination av olika analyser och metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet finansierades genom ett bidrag på universitetar av Munich (FöFoLe projekt-nr: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
