Summary
Descriviamo l'evoluzione di un modello tridimensionale, basato su sferoide in vitro che permette di testare l'attuale standard di regimi di terapia sperimentale per testa e collo carcinoma di cellule squamous su linee cellulari, che mira a valutare la terapia suscettibilità e resistenza su cellule primarie dagli esemplari umani in futuro.
Abstract
Opzioni correnti di trattamento per avanzati e ricorrente di testa e collo carcinoma di cellule squamous (HNSCC) racchiudono radiazione e approcci chemio-radioterapia con o senza la chirurgia. Mentre i regimi di chemioterapia platino-basata attualmente rappresentano il gold standard in termini di efficacia e sono indicati nella maggior parte dei casi, i nuovi regimi di chemioterapia, vale a dire l'immunoterapia stanno emergendo. Tuttavia, i tassi di risposta e meccanismi di resistenza di terapia per entrambi il regime chemio sono difficili da prevedere e rimangono insufficientemente capiti. Ampie variazioni dei meccanismi di resistenza di chemio e radiazioni sono noti fino ad oggi. Questo studio descrive lo sviluppo di un test standardizzato, ad alta produttività in vitro per valutare la risposta di linea HNSCC cellulare ai vari regimi di terapia e, auspicabilmente, su cellule primarie da singoli pazienti come un futuro strumento per tumore personalizzato terapia. Il dosaggio è stato progettato per essere integrato nell'algoritmo standard di qualità controllata per pazienti HNSCC presso il nostro centro di cura terziario; Tuttavia, questo sarà oggetto di futuri studi. Fattibilità tecnica sembra essere molto promettente per cellule primarie da biopsie del tumore dai pazienti reali. I campioni sono poi trasferiti in laboratorio. Le biopsie sono separate meccanicamente seguita da digestione enzimatica. Le cellule vengono poi coltivate in flaconi di coltura cellulare ultra-bassa adesione che promuovono la formazione riproducibile, standardizzata e spontanea dei conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Sferoidi sono pronti per essere esposti a protocolli di chemio-radioterapia e protocolli di immunoterapia come necessario. La dimensione di vitalità e sferoide di cella finale sono indicatori di suscettibilità di terapia e di conseguenza potrebbe essere disegnato in considerazione in futuro, per valutare la risposta probabile terapia dei pazienti. Questo modello potrebbe essere uno strumento prezioso, costo-efficiente verso una terapia personalizzata per il cancro del collo e della testa.
Introduction
Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è il sesto più comune cancro in tutto il mondo con un'incidenza aumentante della patogenesi associata a infezione mucosa papillomavirus umano (HPV), accanto a una maggioranza dei casi causati dall'alcol e nicotina eccessiva consumo di 1,2. Mentre più piccoli tumori e fasi pre-invasive sono di solito ben curabile con l'asportazione chirurgica, di solito combinata con la dissezione di linfonodo cervicale, trattamento per stadio avanzato e ricorrenti HNSCC rimane impegnativo a causa dell'invasione del tumore aggressivo con la diffusione metastatica e resistenza alla radiazione e chemioterapia protocolli3,4,5,6,7,8. Gli studi recenti suggeriscono un'alta variabilità del fenotipo cellulare e sub-caratterizzazione di circolazione e le cellule del tumore diffuso è appena iniziata9,10. La precedente convinzione di un tumore solido, uniforme massa ha dovuto essere rivisto alla luce di recenti studi in passato anni11,12,13,14. Approcci attuali per la caratterizzazione del tumore e l'identificazione di mutazioni chiave potrebbero identificare numerosi geni che sembrano essere associati con resistenza di terapia ma rimangono un approccio costo elevato. Inoltre, conoscenza del genotipo non consente necessariamente una previsione affidabile del fenotipo e la sua risposta al trattamento.
Ci sono stati pochi progressi nel miglioramento della sopravvivenza globale e libera da malattia per malattia in stadio avanzato e ricorrente. Per nicotina - così come carcinoma virus-collegato, le opzioni correnti di trattamento oltre ambulatorio racchiudono aggressivo radiazione e chemioterapia platino-basata. Ci sono state conseguenze per i tassi di risposta diversa fra carcinoma HPV-negativi e positivo; Tuttavia, questo non ha ancora portare a un cambiamento in generale le linee guida di terapia. Resistenza nei confronti di radiazione e la chemioterapia è un fenomeno diffuso in tutte le fasi del tumore ed esiste per chemioterapia platino-basata anche per quanto riguarda la terapia mirata (Anti-EGFR; ricevitore di fattore di crescita epidermico) e recentemente emergenti checkpoint inibizione15. Chemioterapia e radioterapia inefficace hanno un costo elevato di morbosità significativa paziente in termini di disfagia, mucosite, secchezza delle fauci e rischio di diminuzione della funzione renale o cardiaca, tra gli altri. Prima risposta di terapia di predizione della decisione di un concetto di terapia generale per ogni singolo paziente sembra essere l'obiettivo cruciale, impedire il trattamento inutile concetti, effetti collaterali e costi.
Abbiamo cercato di stabilire un modello per testare SUSCETTIBILITA trattamento del singolo paziente attuale chemio-radioterapia standard che poteva essere integrata nell'algoritmo di trattamento oncologico regolari e qualità controllata da un punto di tecniche in piedi. L'obiettivo lontano era quello di utilizzare il modello senza utilizzare linee cellulari pesantemente alterato e invecchiato, come scarsamente rappresentano le cellule di tumore umano effettivo senza loro variabilità ed eterogeneità come la conosciamo ora, mentre l'istituzione del protocollo è stato fatto in varie linee cellulari. Per essere indipendente solo da linee cellulari disponibili in commercio, abbiamo generato recentemente con successo una linea di cella intermedio chiamata "PiCa" da cellule primarie di HNSCC da esemplari del tumore umano con markers cellulari conservato il suoi passaggi superficiale e limitate 16. linea cellulare questo PiCa dovrebbe servire come preparazione per lo sviluppo del modello sulla strada per poi successivamente seguendo studi con cellule tumorali umane fresche da biopsie del tumore. È stato dimostrato che cellule nella cellula tridimensionale culture reagiscono in modo diverso e più in vivo-come per la somministrazione di farmaci di cancro rispetto a quelli che crescono in strati monomolecolari17,18,19,20 ,21, principalmente a causa della conservazione dei migratori e proprietà Sub-differenziazione di alcune cellule sottoinsiemi22,23,24. Qui, descriviamo il protocollo di un modello tridimensionale, basato su sferoide da linee cellulari intermedi e modi e cellule di carcinoma di cellule squamous umano primario come integrano tale modello nel trattamento del cancro del collo e della testa chirurgo e oncologo ( Figura 1).
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Protocol
Tutti gli studi indicati in questo manoscritto, vale a dire l'uso degli esemplari del tumore umano, sono protetti sotto e nel consenso con decisioni precedenti da Università di medicina di Mainz/Università di Monaco di Baviera, centro medico etico. I pazienti hanno dato il consenso informato secondo le linee guida legali nazionali, accettando di uso scientifico degli eccessi di materiale biologico che è stato ottenuto nel corso del loro trattamento. Ricerca è stata eseguita nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali ed internazionali per il benessere umano.
1. prendere una biopsia del tumore dalla testa e Carcinoma di cellule Squamous Heck
- Eseguire generale (propofol e/o sevoflurane, agente di rilassamento muscolare) o infiltrazione locale (2% ultracaine, adrenalina) / superficie (xylocaine) anestesia in sala operatoria o otorinolaringoiatria sedia esame. Visualizzare la massa tumorale in orale cavità/faringe/laringe/altre parti del tratto digerente e respiratorio superiore con strumenti di funzionamento standard e, se necessario, sotto il microscopio.
- Prendere una biopsia del tumore fresco dalla periferia della lesione cancerogena con strumenti contundenti o taglienti. Evitare il centro della lesione dovuto necrosi abbondante in questa zona. Mettere il tessuto ottenuto in un contenitore sterile con soluzione salina isotonica.
- Dopo la biopsia, eseguire l'emostasi come necessario, ad es., con un dispositivo di coagulazione monopolare o bipolare oltre all'uso di sostanze vasocostrittori.
- Portare la biopsia del tumore può essere utilizzato per esperimenti di coltura cellulare direttamente al tratto di laboratorio adiacente. Invia altre le biopsie del tumore per il patologo come al solito per escludere il cancro.
- Assicurarsi che un tecnico di laboratorio è pronto a trattare il campione direttamente.
2. trattamento del campione di tumore
- Posizionare l'esemplare del tumore su una superficie adatta e sterile e tagliare accuratamente con un bisturi monouso sterile in pezzi il meno possibile.
Attenzione: Assicurarsi che lo stato di malattie infettive ed ematica è ben documentato e il tecnico è in attenzione delle istituzioni standard protocolli per impedire ad aghi bastone o lesioni di taglio con potenzialmente materiale paziente di rischio biologico e la protocolli da seguire dopo possibili lesioni. - Dopo una separazione meccanica sufficiente del tessuto primario, mettere il tessuto in un flaconcino contenente collagenasi I / II e incubare per 1h a 37 ° C. Passare al setaccio attraverso un colino di cella di 70 µm falcon e lavare la sospensione con soluzione salina bilanciata Hanks' (HBSS).
-
Dopo la riuscita separazione e lavaggio successivo, posizionare la sospensione contenente 1-2 × 106 cellule in un matracci di cultura di cellule (75 cm2) T75 a crescere a sub-confluency 5% CO2 e temperatura di 37 ° C. Questo passaggio potrebbe richiedere fino a 10 giorni.
- Utilizzare speciali dei cheratinociti terreno di coltura costituito da quanto segue: 125 mL di Dulbecco modificato medio eagles (DMEM), 250 mL di Keratinocyte completato medio (medio integrato composto da 500 mL di Medium di SF del Keratinocyte, 15 mg di ipofisi bovina estrarre (BPE), 2,5 mL di penicillina/streptomicina, 150 ng umano ricombinante fattore crescita epiteliale (EGF), 516 µ l di 300 mM CaCl2, stock mix per essere preparati in anticipo), 125 mL di miscela nutriente di F12, 10 mg di BPE (0,75 mL), 75 ng EGF umano ricombinante (2 µ l) , 3,75 mL 200 mm L-alanil-L-Glutamin-Dipeptide (tabella materiali).
3. le cellule di semina in piastre per colture cellulari ultra-bassa adesione
- Confermare la crescita delle cellule tumorali al microscopio. Contare le celle in cultura (primaria o colture cellulari) e seme 5.000 cellule primarie del tumore o 1.000-2.000 cellule della linea cellulare intermedio / altra linea cellulare a 200-300 µ l di media (punto 3.2.) in un piatto ultra-bassa adesione concavo, rotondo bottoms (96-well).
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1% della coltura le cellule al 5% CO2 a 37 ° C e in mezzo a parti uguali DMEM e delle vie respiratorie delle cellule epiteliali (BEGM), 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, piruvato di sodio 1%, 1% non essenziali aminoacidi, L-Glutammina (punto 2.3.). Se vengono utilizzate linee cellulari, media sulla base di DMEM è sufficiente.
- Eseguire modifiche di supporto ogni altro giorno. Prestare attenzione a non aspirare la sferoide con la pipetta durante i cambi di mezzi. Fino a quando il livello di crescita della coltura sferoidi come descritto al punto 3.3 è raggiunto (circa 7-10 giorni).
- Confermare la formazione spontanea della sferoide al microscopio cercando di conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Escludere i pozzetti con irregolare e/o formazione di sferoide multipla da ulteriori indagini.
Nota: Sferoidi dovrebbero essere visibile ad occhio nudo, troppo, facilitare l'ulteriore elaborazione e modifiche di supporto come descritto di seguito.
4. esporre sferoidi alla terapia multimodale del tumore Standard o sperimentali
- Scegliere un regime di terapia desiderata. Progettazione di gruppi di controllo sufficientemente grande che consentono confronti dei trattamenti di sferoidi non trattate o sferoidi che ricevono solo i regimi di terapia parziale, ad es. radiazione da solo. La dimensione dei gruppi di controllo dipende dalla progettazione del gruppo sperimentale e non può essere definita universalmente.
- Scambiare i mezzi di comunicazione ai media con additivi, significato media con chemioterapici e/o anticorpi monoclonali alle concentrazioni desiderate. Aggiungere cisplatino alle concentrazioni di 2.5/5/10 µM o 5-fluoruracil (5FU) a 30 µM.
Nota: Per esperimenti di throughput elevato o grande gruppo dimensioni/grande numero di gruppi, uno può utilizzare un robot di pipettaggio automatizzato come stiamo stabilendo ulteriormente negli esperimenti. - In alternativa, irradiare le piastre per colture cellulari con sferoidi a 2 Gy usando un impianto di irradiazione adatto.
Attenzione: Rispettare protocolli dell'istituzione per quanto riguarda la prevenzione dell'esposizione di radiazioni nocive dei dipendenti. Funziona solo con i tecnici designati e addestrati secondo le linee guida di protezione di radiazione. Se lo si desidera, aggiungere chemioterapici come descritto sotto 4.2. in seguito. - Incubare le cellule per 24 h in condizioni di coltura precedentemente descritti (37 ° C, punto 3.2).
- Dopo l'incubazione, continuare la coltura delle cellule per almeno 6 giorni con le modifiche di supporto ogni altro giorno.
5. valutazione della sferoide formato ed il limite di proliferazione cellulare per test lettura
- Misurare la dimensione di sferoide in termini di superficie dopo documentazione fotografica digitale il giorno 6 (giorno 10, giorno 16) con un software di grafica (parametro 1).
- Dopo centrifugazione a 520 x g per 2,5 min della piastra, eliminare il surnatante. Lavare le cellule con sufficiente quantità di 1X PBS e centrifugare che la piastra nuovamente come descritto, seguita da rimuovendo il surnatante (PBS).
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di distacco enzimatica cellulare ad ogni flacone per consentire le sferoidi a dissolversi. Incubare la piastra per 8 min a 37 ° C.
- Verifica per la dissoluzione del successo di sferoide sotto il microscopio. Aggiungere 100 µ l di DMEM. Centrifugare la piastra a 520 x g per 2,5 minuti rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 100 μl di DMEM.
- Eseguire un'analisi di proliferazione colorimetrico disponibile nel commercio, nell'analisi di esempio WST-8 su ciascun flaconcino secondo istruzioni25 del produttore. Leggere il saggio in un lettore di test (ELISA) enzima-collegata dell'immunosorbente (parametro 2).
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Representative Results
Siamo stati in grado di generare riproducibile sferoidi dalle sospensioni unicellulare, in primo luogo da linee cellulari differenti compreso la proprietaria linea cellulare di PiCa, più tardi dalle cellule di cancro umano primario derivato da biopsie del tumore fresco come descritto in Hagemann et al. . 26. abbiamo valutato due metodi consolidati per la generazione di sferoide; i due sono l'impiccagione cosiddetto drop (HD) metodo e il metodo di ultra-bassa adesione (ULA), il quest'ultimo è quello più efficace e sicuro. Siamo stati in grado di evidenziare i vantaggi del metodo ULA rispetto al HD, tra cui la più veloce crescita della sferoide, meno problemi con piastra movimentazione, conseguente perdita di sferoidi con forti vibrazioni e più riproducibili sferoide crescita in termini di uniformità ( Figura 2). L'avvenimento di sferoidi multiple per flaconcino era più comune nel metodo HD. Siamo arrivati per una caratterizzazione più distinta della morfologia della sferoide. La figura 3 Mostra un immunochimica macchiatura per Ki67, un marker di proliferazione, di uno sferoide dalle cellule di PiCa. Come descritto in letteratura, sferoidi consistono di un meno core con uno strato esterno di proliferazione di proliferazione, che imita diverse regioni della proliferazione di tinta HNSCC in esseri umani. In vitro come in vivo, questo è presumibilmente causato da un gradiente di nutrienti e ossigeno fornito dal terreno di coltura cellulare causando una diminuzione dalla periferia al centro del tumore.
Quindi abbiamo cercato di dimostrare che il dosaggio è in grado di rilevare variazioni nella dimensione della sferoide dopo l'incubazione con farmaci chemioterapici o l'esposizione a radiazioni ionizzanti, qui che rappresenta due regimi di trattamento standard comuni per HNSCC. Prima di integrare eventualmente il dosaggio in una routine di pre-trattamento, la convalida della sensibilità del dosaggio sarebbe un prerequisito. Due parametri erano disponibili come punti finali del test: dimensione della sferoide (zona; parametro 1 dal passaggio 5.1.) e la proliferazione (vedi parametro 2 dal punto 5.4.), essendo un indicatore sostitutivo per la vitalità cellulare e potenziale di crescita dopo la terapia. I risultati degli studi trattamento con protocolli di chemio-radioterapia e comune chemioterapici sono mostrati in Figura 4. L'esposizione e l'incubazione di sferoidi con cisplatino o 5FU hanno portato a una significativa riduzione nella velocità di crescita nel tempo rispetto a un gruppo di controllo non trattato (p< 0,001). Radiazione con 2Gy era in grado di ridurre la velocità di crescita in modo significativo (p< 0,01). L'analisi di sopravvivenza (WST-8) era in grado di rilevare un ulteriore, significativo valore chemio-radioterapia con cisplatino rispetto a radiazione da solo (p = 0,017), un precedentemente non rilevati differenza nella valutazione delle dimensioni della sferoide. Ciò sottolinea l'importanza per l'analisi nel suo complesso, aumentando la sensibilità di risposta di terapia di piccole modifiche.
Figura 1: concetto di un modello sulla strada per la futura terapia personalizzata. Pazienti con uno sfondo di mucosa dell'infezione di HPV e/o storia di abuso di alcol e tabacco presente al nostro centro di cura terziario di rinvio per sospetto di diagnosi di cancro del collo e della testa. Le biopsie delle aree mucose sospette o masse tumorali macroscopici sono prese nell'ambito dell'anestesia per garantire la diagnosi. Inoltre, prendiamo le biopsie del tumore per generare colture cellulari tridimensionali a forma sferoide in laboratorio. Su una crescita sufficiente di cellula primaria base sferoidi, li esponiamo attuali regimi di trattamento standard o sperimentale per verificare la risposta di terapia individuale. Ulteriori analisi di variazioni genetiche o molecolari possono essere aggiunti dopo l'analisi dei risultati della terapia. Terapia risultati in vitro può essere disegnato in considerazione per il processo di pianificazione concetti di terapia per il paziente. Questa figura è ristampata da Hagemann, J. et al. 26, con autorizzazione concessa dagli autori e Gazzetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tutte le linee cellulari potrebbero generare affidabile sferoidi; le differenze di dimensione e tempo di lettura sono secondo la figura 1. In esperimenti preliminari, cellule primarie non hanno formato riproducibile sferoidi in HD ma piastre ULA (in basso a sinistra). Ulteriori studi devono essere intrapresi per valutare le caratteristiche di crescita della sferoide da cellule primarie. Il numero di celle sulla destra è il numero iniziale delle cellule messo nel flaconcino per formare uno sferoide. Questa figura è ristampata da Hagemann, J. et al. 26, con autorizzazione concessa dagli autori e Gazzetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ki67 macchiatura immunochimica di una fetta di sferoide (PiCa). La periferia della cultura mostra tassi molto più alti di proliferazione di cellule centrale, che imita la distribuzione dei nutrienti nei tumori solidi della mucosa che spesso mostrano nuclei necrotici. Questa figura è ristampata da Hagemann, J. et al. 26, con autorizzazione concessa dagli autori e Gazzetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: studi sulla terapia. (A) cellule di PiCa sono coltivate per generare sferoidi (n = 12 per ogni gruppo) nelle piastre di ULA. Le cellule sono state stimolate secondo il protocollo con entrambi PBS come controllo, cisplatino a 5 µM o 5FU a 30 µM. dimensioni di sferoidi sono stati determinati al giorno 6, 10 e 16 secondo protocolli standard. Cisplatino e 5FU trattamento ha condotto ad una diminuzione significativa nella dimensione (p-valori sono riportati in basso a sinistra nella sezione (B) identico disegno sperimentale come in (A) (n = 12), ma con ulteriori radiazioni di 2Gy. (C) trama Mostra min a max. Secondo il p-valori indicati al punto (C), precedente radiazione con 2Gy ha condotto ad una diminuzione significativa nella dimensione della sferoide nel gruppo di controllo, imitando la radioterapia e mostrando sensibilità di radiazione delle cellule di PiCa. Radiazioni in combinazione con cisplatino trattamento non hanno condotto ad un'ulteriore diminuzione significativa nella dimensione della sferoide (p> 0.05). Trama Mostra min max. (C) calcolato p-valori da analisi di varianza 2 vie da esperimenti A e b. WST8 (D) analisi eseguita il giorno 16 come alternativa per analisi planimetrica (zona) di sferoidi. WST8 analisi erano in grado di rilevare una diminuzione significativa in cellule viventi dopo chemio-radioterapia (2Gy radiazioni e cisplatino) rispetto a cisplatino da solo (p = 0,017), mostrando quindi il vantaggio di combinare sia analisi planimetrica e WST8 analisi colorimetrica al momento della lettura del saggio. Trama Mostra min a max. Questa figura è ristampata da Hagemann, J. et al. 26, con autorizzazione concessa dagli autori e Gazzetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Siamo stati in grado di stabilire un protocollo per generare sferoidi riproducibile da sospensioni cellulari, per entrambe le linee cellulari e, in esperimenti preliminari, cellule primarie del tumore umano. Abbiamo valutato due metodi precedentemente descritti e identificati l'ULA-metodo, un metodo dove sono utilizzati piatti di coltura con superfici ultra-bassa aderenza, per essere quello più sicuro e affidabile per la generazione di sferoidi tridimensionale uniforme. Combinando i due metodi distinti per lettura di dosaggio (attuabilità delle cellule e area di dimensioni), questa analisi multimodale è sufficientemente sensibile per identificare piccole differenze tra i gruppi. Questo è il primo passo verso la prova di fattibilità tecnica per la successiva integrazione del dosaggio nel pathway clinico presso il nostro centro di cura terziario. In futuro, potrebbe essere utilizzato per (i) valutare la suscettibilità individuale tumore al primo-secondo-o terzo-linea terapia protocolli comuni (chemio-reagenti, radiazione) e protocolli di terapia sperimentale, (ii) più ulteriormente caratterizzano le cellule del tumore da esemplari freschi e correlare modelli molecolari di superficie o citoplasmatiche alla risposta di terapia. Sferoidi da esemplari provenienti da localizzazioni differenti del tumore, per esempio, primario e metastasi di linfonodo, sono immaginabili.
In tutta la struttura del protocollo e metodo, abbiamo utilizzato linee cellulari conosciuti differenti, alcuni essendo ben consolidata da decenni. La mera età delle linee cellulari solleva il dubbio della loro connessione e comparabilità alle cellule di tumore umano reale attuale, presumibilmente dopo aver perso diverse proprietà e hallmark marcatori molecolari. I risultati dagli esperimenti in vitro erano difficili da riprodurre nell'essere umano o in vivo studi27. Ci siamo quindi concentrati su una linea cellulare recentemente generata dalle cellule umane del tumore primario nella nostra struttura che è ben caratterizzati16. Con questa linea cellulare PiCa, siamo stati in grado di condurre esperimenti di trattamento ad una scala più grande e ha confermato le aspettative attuali di terapia. Questo supporta la teoria che cellule PiCa riflettono il comportamento effettivo del tumore umano meglio di altri, più invecchiato e secondarie di cellula che ha subito numerosi passaggi. Le cellule che possono essere sottoposti a selezione non-fisiologica dovuta a lungo termine in vitro condizioni potrebbero bias sensibilità di chemio-radioterapia. In recenti esperimenti, abbiamo confermato la fattibilità con cellule primarie per quanto riguarda la formazione della sferoide affidabile; Tuttavia, ulteriori e più grandi esperimenti devono essere eseguita prima di essere in grado di implementare il dosaggio nella routine clinica.
Si presume che sferoidi e coltura cellulare tridimensionale in generale reagiscono in modo diverso rispetto al convenzionale 2D-cultura quando esposti a farmaci chemioterapici o radiazione 28. L'architettura di sferoidi conduce ad un gradiente di ossigeno e nutrizione spedizione dalla superficie esterna al nucleo, e recenti studi hanno dimostrato che anche la somministrazione di farmaci in diverse parti del cluster tridimensionale delle cellule non è uniforme29. Inoltre, cellule in coltura di sferoide sembrano conservare determinati pattern di espressione genica che sono associati con farmaco-resistenza di animale modelli 30. Suggeriamo che anche resistenza di cosiddetto radiazione, una funzionalità che è stata collegata a cancro di collo e testa in numerosi pazienti, è un risultato dell'interazione cellula-cellula e distinti microambienti che conduce a variazioni nel rifornimento di ossigeno e l'attività metabolica. Questo fenomeno potrebbe essere imitato in sferoidi a causa di una funzionalità aumentata in vivo . In conclusione, l'utilizzo di cellule primarie e la generazione di sferoidi ci permettessero di conservare quante più possibili caratteristiche di crescita del tumore in vivo in combinazione con un'analisi di costo-efficiente per lo studio della risposta di terapia individuale.
Certamente ci sono limitazioni per l'approccio. Ad oggi, non si sa come cellule da diversi singoli pazienti si esibiranno nel saggio essere esposto al trattamento del tumore, e come predittivo l'analisi in termini di correlazione con il risultato di terapia successiva. Studi eccessivi sono necessari semplicemente confrontare le prestazioni in vitro vs decorso clinico. Tra gli altri, vale a dire due fattori contribuiscono a questa incertezza: eterogeneità del tumore e la mancanza di co-coltura con cellule stromali e sistema immunitarie. Eterogeneità del tumore è un fenomeno non completamente capito ed esiste tra diversi siti secondari del primario, così come tra localizzazione primari e metastatici12. Da studi recenti, ci è un terzo sito dove molto distinte e cellule specializzate del tumore possono esistere e prevalgono nelle nicchie: sangue e midollo osseo sono in grado di ospitare circolanti e diffuse del tumore cellule9,10. La mancanza di altri tipi cellulari come cellule stromali e le cellule T (come rappresentante per il sistema immunitario) nella coltura delle cellule non è limitata per il test, ma uno svantaggio valido della maggior parte dei saggi in vitro studiando suscettibilità terapia del tumore. Alla luce di recenti approvazioni di droga e gli studi in corso che influenzano la risposta delle cellule T, futuri esperimenti per scoperta della droga devono essere condotta in una combinazione di diversi saggi e metodi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato da un contributo dell'Università di Monaco di Baviera (n. FöFoLe progetto: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
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