Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57021
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) توليف الحمض النووي تيلوميريك ليس فقط، بل أيضا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا. وهنا يصف لنا مقايسة المنشأة حديثا للكشف عن نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا ثالثي الذاتية.

Abstract

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) هو وحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الدنا. على الرغم من أن يدعى ثالثي المنتسخة العكسية، يثبت تحليلات الهيكلية والنشوء والتطور لمادة ثالثي عضو اليد اليمنى [بولمرس]، وتتصل الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس) فضلا عن الفيروسية عكس المنتسخة. وقد حددنا أولاً RdRP نشاط ثالثي البشرية التي تولد رنا مكملة الوقوف إلى قالب غير الترميز الجيش الملكي النيبالي ويسهم في الجيش الملكي النيبالي إسكات في الخلايا السرطانية. لتحليل هذا النشاط الأنزيمي غير متعارف عليه، نحن نمواً الإنزيم RdRP مع ثالثي المؤتلف في عام 2009، وبعد ذلك أنشأت في المختبر بالانزيم RdRP ثالثي الذاتية. في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة الأخيرة. بإيجاز، مجمعات محصنة ثالثي المعزولة من الخلايا، والمحتضنة مع قالب الجيش الملكي النيبالي، ورنتبس بما في ذلك رنتب المشعة لرد فعل RdRP. للقضاء على الجيش الملكي النيبالي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تعامل نواتج التفاعل مع رناسي الأول، والمنتجات النهائية ويتم تحليل مع جل polyacrylamide التفريد. ويمكن الكشف عن راديولابيليد RdRP المنتجات التي أوتوراديوجرافي بعد التعرض بين عشية وضحاها.

Introduction

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) المعروف جيدا كوحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere استخدام قالب الحمض النووي الريبي محددة1telomerase الجيش الملكي النيبالي المكون (ترك)،. على الرغم من أن مادة بوليميريزيس تيلوميريك الحمض النووي كعنصر من عناصر تيلوميراسي، التحليل الهيكلي والنشوء والتطور تشير إلى أن ثالثي ارتباطاً وثيقا مع الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس)، فضلا عن المنتسخة العكسية الفيروسية، وتشاطر المجالات مع هذه بولمرس2،،من34. RdRP هو الإنزيم الذي يولد حبلا الحمض النووي الريبي مكملة لقالب الجيش الملكي النيبالي. يتم ترميز الإنزيم ليس فقط في الفيروسات ولكن أيضا في نموذج الكائنات، مثل النباتات والخميرة والدودة، وتوليف الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي RdRP يساهم في إسكات الجينات النسخي وبوستترانسكريبشونال في هذه الكائنات الحية5،6 . على الرغم من أن RdRP البشرية كانت مفقودة منذ فترة طويلة، نحن وجدنا نشاط RdRP ثالثي البشرية في 20097.

أولاً أكد RdRP نشاط ثالثي مع البروتين المؤتلف7، ثم أنشأت مقايسة حساسة في المختبر للكشف عن النشاط RdRP الذاتية ثالثي8. هنا، علينا أن نظهر في المختبر RdRP المقايسة (مقايسة الملكية الفكرية-RdRP) لمادة الذاتية. هذا الأسلوب يبدأ مع إيمونوبريسيبيتيشن (IP) من مادة الذاتية، وتبعتها في المختبر رد RdRP، التي تدمج ribonucleotides المشعة خيوط الحمض النووي الريبي الوليدة.

Protocol

1-كاشف الإعداد

  1. الكواشف المستخدمة "المزامنة الخلية"
    1. لتوليد المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) التي تحتوي على thymidine 2.5 ملم، حل ملغ 30.28 من thymidine كل 1 مل مياه الصف زراعة الأنسجة بإعداد thymidine 125 ملم. فيلتراتي الحل مع وحدة تصفية حقنه ميكرومترات 0.22. أضف 1 مل thymidine طازجة 125 مم كل 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) المصل البقري الجنين (FBS).
    2. لإنشاء دميم يحتوي على 0.1 ميكروغرام/مل من نوكودازولي، حل نوكودازولي في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لإعداد 5 ميكروغرام/ميكروليتر نوكودازولي. إضافة 1 ميليلتر من 5 ميكروغرام/ميليلتر نوكودازولي الواحد 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS.
    3. لإنشاء دميم المحتوية على 0.002 في المائة (المجلد/المجلد) من [دمس]، أضف 1 ميليلتر من [دمس] في 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS.
  2. الكواشف المستخدمة لفحص الملكية الفكرية-RdRP
    1. إعداد 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4) تحلل المخزن المؤقت 150 ألف: مم كلوريد الصوديوم، و 0.5% (المجلد/المجلد) نونيديت P-40 (NP-40). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد 5 × خلات المخزن المؤقت: 50 ملم حمض 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic (حبيس)-كوه (pH 7.8)، خلات البوتاسيوم 500 مم و 20 مم مجكل2. تخزين الكاشف في درجة حرارة الغرفة.
    3. يعد غسل العازلة س 1:1 خلات العازلة، والغليسيرول 10% (المجلد/المجلد)، 0.1% (المجلد/المجلد) تريتون X-100 و 0.06 x حوزتي المانع كوكتيل، حمض اتهيلينيديامينيتيتراسيتيك (يدتا)-مجاناً. إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 اليوم الاستخدام أو يوم قبل الاستخدام. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد الحل AGC: 1 x خلات المخزن المؤقت، والغليسيرول 10% (المجلد/المجلد) و 0.02% (wt/المجلد) 3-[(3-Cholamidopropyl) ديميثيلامونيو]-1-بروبانيسولفونات (الفصول). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    5. لإنشاء حل AGC تحتوي على 2 مم كاكل2، إضافة 100 ميليلتر من كاكل 1 م2 لكل 50 مل من محلول AGC. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    6. لإنشاء حل AGC تحتوي على 3 مم جليكول مكررا (ب-أمينوثيليثير)-ن، ن، ن '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)، أضف ميليلتر 375 متر 0.4 عطا (درجة الحموضة 7.5) الواحدة 50 مل من محلول AGC. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    7. يعد غسل العازلة x 2:1 خلات العازلة والفصول 0.02% (wt/المجلد). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
    8. إعداد الحل HMD: 0.2 م حبيس-كوه (pH 7.8), 40 مم مجكل2 و 2 مم ديثيوثريتول (DTT). تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: حل HMD ينبغي تجديد على الأقل في ثلاثة أشهر.
    9. إعداد 2 × "ك بروتيناز" المخزن المؤقت: 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، يدتا 20 مم و 1% (wt/المجلد) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي). تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.
    10. إعداد 2 × تحميل المخزن المؤقت: 95% (المجلد/المجلد) ميثلامين، يدتا 20 مم و 1% (wt/المجلد) زاي البرتقال تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.

2-إعداد خلايا هيلا

ملاحظة: إعداد خلايا هيلا متزامنة في المرحلة الانقسامية (التلاعب) أو تقسيم بشكل غير متزامن (unmanipulated). الثقافة الخلايا حضور 5% CO2 في 37 درجة مئوية.

  1. تزامن هيلا الخلايا في الانقسام
    1. بلايت 1 × 106 خلايا هيلا مع 10 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS في صحن ثقافة 10 سم.
    2. يومين بعد الطلاء، يستعاض في المتوسط 10 مل دميم تتضمن التريتيوم 2.5 ملم و 10% (المجلد/المجلد) FBS... ثقافة الخلايا ح 24.
    3. تغسل الخلايا ثلاث مرات مع 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS) (-)، والثقافة في الخلايا التي تحتوي على 10 مل دميم التي تحتوي على 10% (المجلد/المجلد) FBS ح 6.
    4. استبدال المتوسطة مع 10 مل دميم يحتوي على 0.1 ميكروغرام/مل نوكودازولي و 10% (المجلد/المجلد) FBS، والثقافة الخلايا ح 14.
    5. يهز الطبق الثقافة بلطف، واسترجاع المادة طافية تحتوي على خلايا الانقسامية منفصلة. حساب عدد الخلايا لفحص IP--RdRP.
    6. الطرد المركزي العينة في 490 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.
  2. إعداد خلايا هيلا unmanipulated
    1. بلايت 1 × 106 خلايا هيلا مع 10 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS في صحن ثقافة 10 سم.
    2. يومين بعد الطلاء، يستعاض في المتوسط 10 مل دميم التي تحتوي على 10% (المجلد/المجلد) FBS... ثقافة الخلايا ح 30.
    3. استبدال المتوسطة مع 10 مل دميم المحتوية على 0.002% (المجلد/المجلد) [دمس] و 10% (المجلد/المجلد) FBS، والثقافة الخلايا ح 14.
    4. جمع الخلايا باستخدام 0.7 مل التربسين (2.5 g/L) الذي يحتوي على 1 مم يدتا تريبسينيزيشن. حساب عدد الخلايا لفحص IP--RdRP.
    5. الطرد المركزي العينة في 490 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.

3-الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم

  1. أ-[اغروس] بروتين حبة إعداد
    1. نقل 1 مل (سرير حجم 500 ميليلتر) راتنج انجذاب إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
    2. إضافة 800 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، ومزيج جيد بعكس الأنبوبة عدة مرات. الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرتين (إجمالي يغسل ثلاث).
    3. إضافة 800 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، تخلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات. تدوير الأنبوب بين عشية وضحاها (أو على الأقل 4 ح) في 4 درجات مئوية على شاكر دوارة.
    4. الطرد المركزي الأنبوب في 800 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
    5. إضافة 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، ومزيج جيد بعكس الأنبوبة عدة مرات. تخزين الخرز عند 4 درجة مئوية.
  2. إعداد الخلية ليستي
    1. (اختياري) إذا كان يتم تجميد الخلايا في الخطوة 2، وإذابة الخلايا المجمدة على الجليد حتى تصبح الخلايا فضفاضة.
    2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (-). الطرد المركزي العينة في س 1,450 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
    3. الخلايا مع المثلج تحلل العازلة (1 مل تحلل المخزن المؤقت بكل 1 × 107 للخلايا) بلطيف بيبيتينج.
    4. Sonicate العينة في أنبوب 1.5 مل مع الشروط التالية؛ تعيين تضخيم سونيكاتور نسبة 25%، و sonicate لمدة 10 ق.
    5. الطرد المركزي العينة في س 20,400 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    6. جمع المادة طافية. نقل 1 مل من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
      تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
  3. إيمونوبريسيبيتيشن
    1. قبل مسح من الخطوة 3.2.6 بإضافة 40 ميكروليتر (حبة حجم 20 ميليلتر) من البروتين بريواشيد A-[اغروس] حبات كل 1 مل من. خلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات وتدوير العينة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. الطرد المركزي العينة في س 13,000 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، واسترجاع المادة طافية.
    3. إضافة 40 ميكروليتر (سرير حجم 20 ميليلتر) البروتين بريواشيد A-[اغروس] الخرز و 10 ميكروغرام لجسم الإنسان المضادة مادة (استنساخ: 10E9-2)8 إلى المجازين ليستي. خلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات وتدوير العينة عند 4 درجة مئوية خلال الليل.
    4. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
    5. أغسل الخرز مع الغسيل المخزن المؤقت 1: إضافة 1 مل من يغسل المخزن المؤقت 1 إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات إضافية.
    6. أغسل الخرز مرة واحدة مع AGC محلول يحتوي على 2 مم كاكل2: إضافة 1 مل من محلول AGC تحتوي على 2 مم كاكل2 إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
    7. علاج الخرز مع نوكلاس ميكروكوككال (منسى): إعداد الخليط رد فعل منسى المبينة في الجدول 1. ريسوسبيند الخرز في 60 ميليلتر من خليط رد فعل منسى قبل بيبيتينج لطيف. هزة العينة بلطف (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) على القرص الدوار شاكر في حاضنة بلتيير من نوع لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
      ملاحظة: من المهم جداً استخدام شاكر متموجة والتقيد الحد الأقصى للسرعة في هذه الخطوة. نوع آخر من الهزازات، مثل خلاطات الدورية، لا ينصح.
    8. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
    9. أغسل الخرز مرتين مع AGC محلول يحتوي على 3 مم عطا: أضف 1 مل من محلول AGC تحتوي على 3 مم عطا إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    10. أغسل حبات مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2: إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2الخرز، تخلط جيدا بعكس الأنبوب، وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. تبقى الخرز على الجليد أثناء إعداد الرد RdRP.
      تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
  4. رد فعل RdRP
    1. إعداد خليط رد فعل RdRP في أنبوب جديد كما هو موضح في الجدول 2.
    2. إضافة ميليلتر 6 من [α-32ف] UTP (3,000 Ci/ملمول) إلى خليط ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
      ملاحظة: ATP [α-32ف]، [α-32ف] الأداء النظري المركب، أو أنشئ [α-32ف] يمكن استخدامها لرد الفعل بدلاً من [α-32ف] UTP.
    3. أضف 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام/ميليلتر) إلى خليط ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
      ملاحظة: إلى تحديد الإنزيم RdRP، الحمض النووي الريبي القالب التالي يوصي:-ججاوكاوجوججوككووواكووووااكككا 5 '-3' 9.
    4. ريسوسبيند الخرز مع 20 ميليلتر من خليط رد فعل RdRP من الخطوة 3.4.3 من بيبيتينج.
    5. هزة العينة بلطف (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) على القرص الدوار شاكر في حاضنة بلتيير نوع ح 2 عند 32 درجة مئوية.
    6. إضافة 5.4 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) وميليلتر 45.4 x 2 "ك بروتيناز" المخزن المؤقت إلى خليط رد فعل. مزيج من بيبيتينج ويهز (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) العينة على القرص الدوار في حاضنة بلتيير من نوع لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. إضافة ميليلتر 109.2 المياه خالية من رناسي للعينة.
    8. إضافة 200 ميليلتر من حمض الفينول-كلوروفورم للعينة. مزيج جيد من دوامة، ومن ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    9. إضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (pH = 5.2)، 4 ميليلتر 250 ميليلتر من الإيثانول إلى المرحلة المائية والناقل هطول الأمطار. هز الأنبوبة جيدا لخلط، ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    10. أغسل بيليه مع 300 ميليلتر الباردة الإيثانول (المجلد/المجلد) 70% المخزنة في-20 درجة مئوية. الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    11. تجاهل المادة طافية وأيردري بيليه.
      تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه من الخطوة 3.4.11 في-20 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
  5. العلاج رناسي
    1. ريسوسبيند بيليه من الخطوة 3.4.11 في 20 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
    2. إعداد خليط رد فعل رناسي في أنبوب جديد كما هو موضح في الجدول 3.
    3. إضافة ميليلتر 180 من خليط رد فعل رناسي للعينة، واحتضان الأنبوب ح 2 في 37 درجة مئوية.
    4. إضافة 2.3 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% (المجلد/المجلد) للعينة، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. إضافة 2 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) للعينة، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. إضافة ميليلتر 205 حمض الفينول-كلوروفورم للعينة. ثم أن مزيج جيد من دوامة، الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    7. إضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (5.2 درجة الحموضة)، 4 ميليلتر من الناقل هطول الأمطار و 250 ميليلتر من الإيثانول إلى مرحلة مائي. هز الأنبوبة جيدا لخلط، ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    8. أغسل بيليه مع 300 ميليلتر الباردة الإيثانول (المجلد/المجلد) 70% المخزنة في-20 درجة مئوية. الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    9. تجاهل المادة طافية وأيردري بيليه.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه من الخطوة 3.5.9 في-20 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
  6. هلام التفريد وأوتوراديوجرافي
    1. ريسوسبيند العينة مع 20 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
    2. إضافة 20 ميليلتر من 2 × تحميل المخزن المؤقت.
    3. تغلي العينة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. سحق العينة على الجليد.
    4. تشغيل الهلام. في حالة حجم القالب nts 34 (انظر أيضا خطوة 3.4.3)، يتم استخدام جل polyacrylamide م اليوريا-10% 7 يشوه التفريد جل.
    5. الجاف للجل مع هلام مجفف.
    6. يعرض الفيلم لجل المجففة داخل كاسيت الأشعة سينية مع شاشة تكثيف في-80 درجة مئوية.

Representative Results

مع قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها، لوحظت المنتجات RdRP المشعة بين 20 إلى 30 النيوكليوتيدات (nt) على وجه التحديد في خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية بعد التعرض بين عشية وضحاها (الشكل 1A). نموذجياً، يوضح كثافة إشارة من المنتجات RdRP اثنين من قمم المتوضعة حوالي 25 nt و 30 nt بما يتفق مع حجم توزيع المنتجات التي أكدتها تسلسل الجيل القادم9. على النقيض من الخلايا الانقسامية، إظهار خلايا هيلا دون التزامن تقريبا غياب المنتجات المشعة nt 20 – 30. إشارات البيضاوي، التي توضع تحت 20 nt في جميع العينات هي الانجرافات غير محدد.

في حالة أن هناك فقط منتج nt ~ 30 مع إشارة ضعيفة في خلايا هيلا الانقسامية، فإنه يشير إلى أن رد فعل RdRP لم يذهب جيدا. على سبيل المثال، إذا كان يتم تنفيذ المعاملة منسى تقريبا وغير لائق، كثافة إشارة في هيلا الانقسامية الخلايا يقلل إلى حد كبير (الشكل 1B). رد فعل RdRP يؤديها مع الحل HMD القديم يقلل أيضا من المنتجات (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1 : منتجات RdRP ممثل ثالثي الذاتية في الانقسامية هيلا الخلايا. معالجة نتائج المقايسة RdRP الملكية الفكرية في خلايا هيلا الممثل ثلاثة (A) مع نوكودازولي (التلاعب) أو [دمس] (unmanipulated). 34 مركباً كيميائيا nt الرنا كقالب. (ب) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع منسى معاملة غير لائقة. (ج) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع الحل HMD أما جديدة أو قديمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكواشف وحدة التخزين
ميكروكوككال نوكلاس، 20 ش/ميليلتر 1 ميليلتر
المخزن المؤقت نوكلاس ميكروكوككال، 10 x ميليلتر 8
المياه خالية من رناسي ميليلتر 51

الجدول 1: منسى رد فعل المزيج المكون.

الكواشف وحدة التخزين
الفصول، 0.07% (wt/المجلد) ميليلتر 6
الحل HMD 2 ميليلتر
rATP، 80 مم 0.5 ميليلتر
رجتب، 8 مم 1 ميليلتر
راتب، 0.4 مم 1 ميليلتر
ركتب، 8 مم 1 ميليلتر
رناسي المانع، 40 ش/ميليلتر 0.5 ميليلتر
المياه خالية من رناسي 1 ميليلتر

الجدول 2: RdRP رد فعل المزيج المكون.

الكواشف وحدة التخزين
Ribonuclease رناسي واحد، يو 10/ميليلتر ميليلتر 0.2
رد فعل المخزن المؤقت, 10 x 20 ميليلتر
المياه خالية من رناسي 159.8 ميليلتر

الجدول 3: Ribonuclease رد فعل المزيج المكون.

Discussion

مقايسة RdRP الملكية الفكرية أسلوب حساسة للكشف عن النشاط RdRP من البشر ثالثي. وأعرب عن البروتين ثالثي هو الغاية في خلايا هيلا الانقسامية، التي تشكل مادة RdRP المعقدة8،،من910. وهذا يشير إلى أن خلايا هيلا الانقسامية مادة أمثل للكشف عن النشاط RdRP. في البروتوكول، المذكورة أعلاه، الانقسامية وغير متزامنة هيلا يتم تضمين الخلايا إيجابية، ومن الأمثلة سلبية، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 1A، منتجات الإنزيم RdRP من قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها في خلايا هيلا الانقسامية إظهار إشارات مشعة واسعة بين 20 إلى 30 nt. بالإضافة إلى خلايا هيلا، لدينا إجراء المقايسة مع أنواع مختلفة من خطوط الخلايا، ووجدت أنه لا يمكن تغيير نمط الإشارات في خلية مختلفة الأنواع9: تظهر بعض إشارة قوية فقط حوالي 30 nt، تظهر بعض نمط مماثل مع خلايا هيلا. ونحن أيضا بإجراء المقايسة مع قوالب الرنا خلاف 34 قالب nt8، قصيرة وطويلة (~ 300 nt) الكشف مع تسلسل مختلف، ونجاح الحصول على منتجات RdRP من تلك القوالب رغم أنه قد تكون هناك بعض التفضيل. في المحاكمة الأولى، ومع ذلك، نوصي باستخدام خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية والقالب nt الحمض النووي الريبي 34. ردربس يمكن أن تولد الرنا المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في تعتمد على التمهيدي وفي طريقة مستقلة عن التمهيدي11. وقد أبلغنا أن ثالثي يحتفظ بهذه الخاصية البشرية RdRP7،9؛ يجمع ثالثي دسرنا من قالب الجيش الملكي النيبالي مع هيكل 3 '-foldback من خلال إليه فتيلة ظهر7. 34 قالب nt الجيش الملكي النيبالي، يجمع ثالثي خيوط التكميلية دون استخدام كبسولة تفجير9. على وجه التحديد الكشف عن منتجات RdRP توليفها بطريقة مستقلة عن التمهيدي، أي دي نوفو توليف الحمض النووي الريبي المنتجات، [α-32ف] NTP يمكن الاستعاضة عن [γ-32ف] NTP في رد فعل RdRP9.

علاج منسى ثالثي مجمعات محصنة في الخرز خطوة حاسمة لتحقيق النتائج المرجوة. إذا كان يتم تنفيذ معاملة مناسى طويل جداً أو بالهز مكثفة، منتجات RdRP ستقل ملحوظ. لتجنب هذه المتاعب، نوصي بشدة على التقيد البروتوكول بعناية. الحل HMD عامل حاسم آخر للنجاح. إذا كنت تجد أن الإشارات ضعيفة جداً، يحل محل حل HMD واحدة أعدت حديثا.

في جميع أنحاء البروتوكول، واحدة ينبغي إيلاء عناية كبيرة لتفادي التلوث رناسي. ينبغي أن تجري معاملة ribonuclease مع معدات مخصصة. بعد التلاعب في Ribonuclease، واحدة ينبغي تجاهل نصائح وأنابيب مع رناسي فورا، القضاء على رناسي مع الحل المتخصصة (مثل هادئة رناسي)، وتغيير بساتين.

ثالثي يتفاعل مع ترك ليس فقط ولكن أيضا العديد من أنواع الكشف الذاتية، وكنا قد ذكرت جزءا منها7. التعديل في مقايسة RdRP الملكية الفكرية، مثل المقايسة RdRP الملكية الفكرية دون علاج مناسى، ستوفر قائمة كاملة من قوالب الرنا الذاتية لدليل النشاط و bioinformatic RdRP المرتبطة بمادة على ملامحها التسلسل. ونحن قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول للأنسجة ليستي. لأن هو أعرب ثالثي في مجموعة متنوعة من الأنسجة العادية والورم، هذا التحليل قد تكون مفيدة للتحقيق غير متعارف عليه وظيفة ثالثي الأنزيمي في الإنسان.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل وأيده في الجزء المشروع "تطوير البحوث الابتكارية" في علاجات السرطان (فالمباشر) (15cm0106102h0002، ك. م.) والمشروع لأبحاث السرطان والتطور العلاجي (ف إنشاء) (16 سم 01061150001، ك. م.) من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية، AMED؛ مؤسسة العلوم وتاكيدا (Y.M.)؛ منحة صندوق أبحاث السرطان الأميرة تاكاماتسو (13-24520، Y.M.)؛ وعدد المنح JSPS كاكينهي JP16K07133 (Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Wako 044-29765
Fetal bovine serum (FBS) CORNING 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin mixed solution nacalai tesque 26253-84
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution nacalai tesque 32777-44
Phosphate buffered saline (PBS(-)) Wako 166-23555
Thymidine nacalai tesque 07147-61
Nocodazole Sigma M1404
Dimethyl sulfoxide (DMSO) nacalai tesque 08904-85
Sodium chloride nacalai tesque 31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane nacalai tesque 35434-21
Hydrochloric acid nacalai tesque 18321-05
Nonidet P-40 (NP-40) nacalai tesque 25223-04
Pierce Protein A Plus Agarose Thermo scientific 22812
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) nacalai tesque 17514-15
Potassium hydroxide Wako 168-21815
Potassium acetate nacalai tesque 28405-05
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) Wako 135-00165
Glycerol nacalai tesque 17045-65
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) Wako 169-21105
cOmplete, EDTA-free Roche Applied Science 11 873 580 001
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) nacalai tesque 06731-05
Micrococcal nuclease (MNase) Takara Bio 2910A
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) nacalai tesque 15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) nacalai tesque 07957-64
Dithiothreitol (DTT) nacalai tesque 14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each Promega E6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) PerkinElmer NEG507H Use fresh RI for the assay
RNase inhibitor TOYOBO SIN-201
Proteinase K Takara 9033
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Life Technologies AM9720
3 M Sodium acetate NIPPON GENE 316-90081
Ethanol (99.5) nacalai tesque 14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara Bio 9094
RNase One Ribonuclease Promega M4265
Sodium dodecyl sulfate (SDS) nacalai tesque 02873-75
Formamide, deionized nacalai tesque 16345-65
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) nacalai tesque 15130-95
Orange G nacalai tesque 25401-22
CO2 incubator e.g., ASTEC SCA-325DRS
Centrifuge e.g., TOMY EX-135 For step B)
Micro refrigerated centrifuge e.g., KUBOTA 3740 For step 6.2
Sonicator Qsonica Q125 Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4
Micro refrigerated centrifuge e.g., TOMY MX-305 For step 6.5
Cooled incubator e.g., Panasonic MIR-154-PJ Set a rotary shaker inside
Rotary shaker e.g., TAITEC RT-5
Cooled incubator  e.g., TAITEC BR-43FL Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7
MINI WAVE AS ONE WEV-03 A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6
Incubator e.g., TAITEC HB-80 Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6
Block incubator e.g., ASTEC BI-516S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Tags

علم الوراثة، 136 قضية، ثالثي، تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا، الرنا المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، تيلوميراسي، إيمونوبريسيبيتيشن، النظائر المشعة
كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti,… More

Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti, M., Ando, Y., Masutomi, K. Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein. J. Vis. Exp. (136), e57021, doi:10.3791/57021 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter