Summary
Mänskliga telomeras omvänt transkriptas (TERT) syntetiserar inte bara telomeric DNA utan också dubbelsträngat RNA genom RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet. Här beskriver vi en nyinrättade analys för att upptäcka RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av endogena TERT.
Abstract
Mänskliga telomeras omvänt transkriptas (TERT) är den katalytiska subuniten av telomeras och det förlänger telomeren genom RNA-beroende DNA-polymerasen aktivitet. Även om TERT heter som ett omvänt transkriptas, Visa strukturella och fylogenetiska analyser av TERT att TERT är medlem av högerhänta polymeraser, och avser att viral RNA-beroende RNA polymeraser (RdRPs) samt viral omvänt transkriptas. För det första identifierade vi RdRP aktivitet av mänskliga TERT som genererar kompletterande RNA stå till en mall som icke-kodande RNA och bidrar till RNA ljuddämpning i cancerceller. För att analysera denna icke-kanoniska enzymaktivitet, vi utvecklat RdRP assay med rekombinant TERT 2009, därefter etablerat in vitro- RdRP assay för endogena TERT. I detta manuskript beskriver vi den senare metoden. Kort, TERT immunkomplex isolerade från celler och inkuberas med template RNA och rNTPs inklusive radioaktivt rNTP för RdRP reaktion. För att eliminera enkelsträngat RNA, behandlas reaktionsprodukter med RNase jag, och slutprodukterna analyseras med polyakrylamid gelelektrofores. Radioaktivt märkt RdRP produkter kan upptäckas genom autoradiografi efter övernattning exponering.
Introduction
Mänskliga telomeras omvänt transkriptas (TERT) är känd som den katalytiska subuniten av telomeras och det förlänger telomeren använder telomeras RNA komponent (TERC), specifika RNA mall1. Även om TERT polymerizes telomeric DNA som en del av telomeras, indikerar de strukturella och fylogenetiska analyserna att TERT är närbesläktat med viral RNA-beroende RNA polymeraser (RdRPs) samt viral omvänt transkriptas, och aktier domäner med dessa polymeraser2,3,4. RdRP är det enzym som genererar kompletterande RNA strand till en mall RNA. Enzymet kodas inte bara virus utan också i modellorganismer, såsom växt-, jäst- och mask, och dubbelsträngat RNA-syntes av RdRP bidrar till transkriptionell och post-transcriptional nedtystning i dessa organismer5,6 . Även om mänskliga RdRP hade varit försvunnen under en lång tid, hittade vi RdRP aktivitet i mänskliga TERT i 20097.
Vi först bekräftade RdRP aktivitet av TERT med rekombinant protein7, sedan etablerade en känsliga in vitro- test för att upptäcka RdRP aktivitet av endogena TERT8. Här visar vi i vitro RdRP analysen (IP-RdRP assay) för endogena TERT. Den här metoden börjar med immunoprecipitation (IP) av endogena TERT, och följs av in vitro- RdRP reaktion, som radioaktiva ribonukleotider ingår i begynnande RNA-strängar.
Protocol
1. reagens Setup
-
Reagens som används för cellen synkronisering
- För att generera Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) som innehåller 2,5 mM tymidin, lös 30.28 mg tymidin per 1 mL vävnadsodling grade vatten att förbereda 125 mM tymidin. Filtratet lösningen med en 0,22 μm spruta filterenhet. Tillsätt 1 mL nyberedd 125 mM tymidin per 50 mL DMEM kompletteras med 10% (vol/vol) fetalt bovint serum (FBS).
- Lös upp nocodazole i dimetyl sulfoxid (DMSO) att förbereda 5 μg/μL nocodazole generera DMEM innehållande 0,1 μg/mL nocodazole. Tillsätt 1 µL 5 µg / µL nocodazole per 50 mL DMEM kompletteras med 10% (vol/vol) FBS.
- För att generera DMEM som innehåller 0,002% (vol/vol) av DMSO, tillsätt 1 µL av DMSO per 50 mL DMEM kompletteras med 10% (vol/vol) FBS.
-
Reagens som används för IP-RdRP assay
- Förbereda lysis buffert A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) och 0,5% (vol/vol) Nonidet p-40 (NP-40). Lagra reagens vid 4 ° C.
- Förbereda 5 x acetatbuffert: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic syra (HEPES)-KOH (pH 7,8), 500 mM kalium acetat och 20 mM MgCl2. Lagra reagens vid rumstemperatur.
- Förbereda Wash buffer 1: 1 x acetatbuffert, 10% (vol/vol) glycerol, 0,1% (vol/vol) Triton X-100 och 0.06 x proteashämmare cocktail, ethylenediamenetetraacetic syra (EDTA)-gratis. Förbereda tvättbuffert 1 på dagen för användning eller dagen före användning. Lagra reagens vid 4 ° C.
- Förbereda AGC lösning: 1 x acetatbuffert, 10% (vol/vol) glycerol och 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (käkar). Lagra reagens vid 4 ° C.
- För att generera AGC lösning innehållande 2 mM CaCl2, tillsätt 100 µL av 1 M CaCl2 per 50 mL AGC lösning. Lagra reagens vid 4 ° C.
- Att generera AGC lösning innehållande 3 mM etylenglykol bis (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), tillsätt 375 µL av 0,4 M EGTA (pH 7,5) per 50 mL AGC lösning. Lagra reagens vid 4 ° C.
- Förbered tvättbufferten buffert 2: 1 x acetat och 0,02% (wt/vol) käkar. Lagra reagens vid 4 ° C.
- Förbereda HMD lösning: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 och 2 mM Ditiotreitol (DTT). Lagra reagens vid-20 ° C.
Obs: HMD lösning bör förnyas minst i tre månader. - Förbered 2 x proteinas K buffert: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA och 1% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate (SDS). Lagra reagens vid-20 ° C.
- Förbered 2 x laddar buffert: 95% (vol/vol) formamid, 20 mM EDTA och 1% (wt/vol) Orange G. lagra reagens vid-20 ° C.
2. beredning av HeLa celler
Obs: Förbereda HeLa cells synkroniserade i mitotiska fas (manipulerat) eller dividera asynkront (unmanipulated). Odla cellerna i närvaro av 5% CO2 vid 37 ° C.
-
Synkronisering av HeLa celler i Mitos
- Tallrik 1 x 10-6 i HeLa cells med 10 mL DMEM kompletteras med 10% (vol/vol) FBS i en 10 cm kultur maträtt.
- Två dagar efter plätering, ersätta mediet med 10 mL DMEM innehållande 2,5 mM tymidin och 10% (vol/vol) FBS. Odla cellerna för 24 h.
- Tvätta cellerna tre gånger med 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (-) och odla cellerna med 10 mL DMEM innehållande 10% (vol/vol) FBS för 6 h.
- Ersätta mediet med 10 mL DMEM innehållande 0,1 µg/mL nocodazole och 10% (vol/vol) FBS och odla cellerna för 14 h.
- Skaka kultur skålen försiktigt och hämta supernatanten som innehåller fristående mitotiska celler. Räkna antalet cell för IP-RdRP analysen.
- Centrifugera provet vid 490 x g under 5 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten.
Obs: Cellpelleten kan lagras vid-80 ° C.
-
Beredning av omanipulerat HeLa celler
- Tallrik 1 x 10-6 i HeLa cells med 10 mL DMEM kompletteras med 10% (vol/vol) FBS i en 10 cm kultur maträtt.
- Två dagar efter plätering, ersätta mediet med 10 mL DMEM innehållande 10% (vol/vol) FBS. Odla cellerna för 30 h.
- Ersätta mediet med 10 mL DMEM som innehåller 0,002% (vol/vol) DMSO och 10% (vol/vol) FBS och odla cellerna för 14 h.
- Samla in cellerna genom trypsinization med 0,7 mL av trypsin (2,5 g/L) som innehåller 1 mM EDTA. Räkna antalet cell för IP-RdRP analysen.
- Centrifugera provet vid 490 x g under 5 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten.
Obs: Cellpelleten kan lagras vid-80 ° C.
3. IP-RdRP Assay
- Protein A-agaros pärla förberedelse
- Över 1 mL (säng volym 500 µL) av affinitet harts till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 800 μl lyseringsbuffert A till pärlorna och blanda väl genom att vända tuben flera gånger. Centrifugera vid 800 x g i 3 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten. Upprepa detta steg två gånger (totalt tre tvättar).
- Tillsätt 800 μl lyseringsbuffert A till pärlorna, blanda väl genom att vända rör flera gånger. Vrid röret över natten (eller åtminstone 4 h) vid 4 ° C på en roterande skakapparat.
- Centrifugera röret vid 800 x g i 3 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 500 µL lyseringsbuffert A i pärlor och blanda väl genom att vända tuben flera gånger. Förvara pärlorna vid 4 ° C.
- Beredning av cell lysate
- (Valfritt) Om cellerna är frysta i steg 2, placera och Tina upp de frusna cellerna på is tills cellerna blivit löst.
- Tvätta cellerna en gång med 10 mL PBS (-). Centrifugera provet vid 1 450 x g i 5 minuter vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten.
- Lysera cellerna med iskall lyseringsbuffert en (1 mL lyseringsbuffert A per 1 x 107 celler) av milda pipettering.
- Sonikera provet i ett 1,5 mL rör med följande villkor; förstärkning av den någon sonikator på 25%, och Sonikera för 10 s.
- Centrifugera provet vid 20 400 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Samla in supernatanten. Över 1 mL av supernatanten till 1,5 mL mikrocentrifugrör.
FÖRSIKTIGHET: Utför alla procedurer RNase-fria villkor.
- Immunoprecipitation
- Pre avmarkera den lysate från steg 3.2.6 genom att lägga till 40 µL (pärla volym 20 µL) av förtvättad protein A-agaros pärlor per 1 mL av den lysate. Blanda väl genom att vända tuben flera gånger och rotera provet under 30 minuter vid 4 ° C.
- Centrifugera provet vid 13 000 x g för 1 minuter vid 4 ° C, och återställa supernatanten.
- Tillsätt 40 µL (säng volym 20 µL) av förtvättad protein A-agaros pärlor och 10 µg av anti-humant TERT antikropp (klon: 10E9-2)8 i den pre clearade lysate. Blanda väl genom att vända tuben flera gånger och rotera provet vid 4 ° C över natten.
- Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna med tvättbuffert 1: Tillsätt 1 mL av tvättbuffert 1 till pärlor, blanda väl genom att vända tuben och rotera provet för 5 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Upprepa detta steg ytterligare tre gånger.
- Tvätta pärlorna en gång med AGC lösning innehållande 2 mM CaCl2: Tillsätt 1 mL av AGC lösning innehållande 2 mM CaCl2 till pärlor, blanda väl genom att vända tuben och rotera provet för 5 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Behandla pärlorna med Micrococcal nuclease (MNase): förbereda MNase reaktionsblandningen beskrivs i tabell 1. Återsuspendera pärlorna i 60 µL av MNase reaktionsblandningen av mild pipettering. Skaka provet försiktigt (20 till 25 rpm) på en skivspelare i en shaker i ett Peltier-typ inkubator för 15 min vid 25 ° C.
Obs: Det är mycket viktigt att använda en böljande shaker och strikt följa hastighetsbegränsningen i detta steg. Annan typ av shakers, såsom roterande blandare, rekommenderas inte. - Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna två gånger med AGC lösning innehållande 3 mM EGTA: Tillsätt 1 mL av AGC lösning innehållande 3 mM EGTA till pärlor, blanda väl genom att vända tuben och rotera provet för 5 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Upprepa detta en gång.
- Tvätta pärlorna en gång med tvättbuffert 2: Tillsätt 1 mL av tvättbuffert 2pärlor, blanda väl genom att vända tuben och rotera provet för 5 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 3300 x g för 0,5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Förvara pärlorna på is när du konfigurerar RdRP reaktion.
FÖRSIKTIGHET: Utför alla procedurer RNase-fria villkor.
- RdRP reaktion
- Förbereda en RdRP reaktionsblandningen i en ny tub som beskrivs i tabell 2.
- Tillsätt 6 µL av [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) till blandningen och blanda väl genom pipettering.
Obs: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP eller [α -32P] GTP kan användas för reaktionen i stället för [α -32P] UTP. - Tillsätt 1 µL av mallen RNA (1 µg/µL) till blandningen och blanda väl genom pipettering.
Obs: För att fastställa RdRP analysen, mallen RNA följande rekommenderas: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9. - Återsuspendera pärlorna med 20 µL av RdRP reaktionsblandningen från steg 3.4.3 genom pipettering.
- Skaka provet försiktigt (20 till 25 rpm) på en skivspelare i en shaker i ett peltier-typ inkubator för 2 h vid 32 ° C.
- Lägga till 5,4 µL av proteinas K (20 mg/mL) och 45,4 µL av 2 x proteinas K buffert i reaktionsblandningen. Blanda genom pipettering och skaka (20 till 25 rpm) provet på en skivspelare i en Peltier-typ inkubator under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 109,2 µL RNase-fritt vatten i provet.
- Tillsätt 200 µL syra fenol-kloroform. Blanda väl genom vortex, och sedan Centrifugera provet vid 21,100 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Överföra vattenfasen till en ny tub. Upprepa detta en gång.
- Tillsätt 20 µL av 3 M natriumacetat (pH = 5.2), 4 µL av nederbörd bärare och 250 µL etanol till vattenfasen. Skaka tuben väl för att blanda, sedan Centrifugera provet vid 21,100 x g i 20 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 300 µL kallt 70% (vol/vol) etanol förvaras vid-20 ° C. Centrifugera provet vid 21,100 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten.
FÖRSIKTIGHET: Utför alla procedurer RNase-fria villkor.
Obs: Pelleten från steg 3.4.11 kan förvaras vid-20 ° C i minst 2 dagar.
- RNase behandling
- Återsuspendera pelleten från steg 3.4.11 i 20 µL RNase-gratis vatten.
- Förbereda ett RNase reaktionsblandningen i en ny tub som beskrivs i tabell 3.
- Lägga till 180 µL av RNase reaktionsblandningen provet och Inkubera röret för 2 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 2.3 µL 10% (vol/vol) SDS i provet och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 µL proteinas K (20 mg/mL) i provet och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 205 µL syra fenol-kloroform till provet. Blanda väl av vortex, sedan Centrifugera provet vid 21,100 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Överföra vattenfasen till en ny tub.
- Tillsätt 20 µL av 3 M natriumacetat (pH 5.2), 4 µL av nederbörd bärare och 250 µL etanol till vattenfasen. Skaka tuben väl för att blanda, sedan Centrifugera provet vid 21,100 x g i 20 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 300 µL kallt 70% (vol/vol) etanol förvaras vid-20 ° C. Centrifugera provet vid 21,100 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten.
Obs: Pelleten från steg 3.5.9 kan förvaras vid-20 ° C i minst 2 dagar.
- Gel-elektrofores och autoradiografi
- Återsuspendera provet med 20 µL av RNase-gratis vatten.
- Tillsätt 20 µL av 2 x laddar buffert.
- Koka prov för 10 min vid 95 ° C. Krossa provet på isen.
- Kör gelen. Om mallen är 34 nts (se även steg 3.4.3), används 7 M Urea - 10% Polyakrylamidgelen för denaturering gelelektrofores.
- Torka gelen med en gel som torktumlare.
- Exponera filmen till torkade-gelen inom en röntgen kassett med en allt intensivare skärm vid-80 ° C.
Representative Results
Med mallen rekommenderade RNA, kan radioaktiva RdRP produkter observeras mellan 20 till 30 nucleotides (nt) specifikt i HeLa cells i mitotiska fas efter övernattning exponering (figur 1A). Typiskt, signalintensitet RdRP produkter visar två toppar som är placerade runt 25 nt och 30 nt i samklang med storlek distribution av produkterna bekräftas av nästa generations sekvensering9. I motsats till mitotiska celler Visa HeLa celler utan synkronisering nästan inte de 20 – 30 nt radioaktiva produkterna. Oval signaler, som placeras under 20 nt i alla prover, är ospecifik drivor.
Om det är det bara en ~ 30 nt produkt med svag signal i mitotiska HeLa cells, anger det att den RdRP reaktionen inte gick väl. Till exempel om MNase behandling utförs ungefär och olämpligt, signal intensiteten i mitotiska HeLa celler minskar avsevärt (figur 1B). RdRP reaktionen utförs med gamla HMD lösning minskar också produkterna (figur 1 c).
Figur 1 : Representant RdRP produkter av endogena TERT i mitotiska HeLa cells. (A) tre representativa resultat för IP-RdRP-analysen i HeLa celler behandlas med nocodazole (manipulerat) eller DMSO (unmanipulated). Den kemiskt syntetiserade 34 nt RNA användes som mall. (B) IP-RdRP assay i mitotiska HeLa cells utförs med olämplig MNase behandling. (C) IP-RdRP assay i mitotiska HeLa cells utförs med antingen färsk eller gammal HMD lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagenser | Volym |
| Micrococcal Nuclease, 20 U/µL | 1 ΜL |
| Micrococcal Nuclease buffert, 10 x | 8 ΜL |
| RNase-gratis vatten | 51 ΜL |
Tabell 1: MNase reaktion mix komponent.
| Reagenser | Volym |
| KÄKAR, 0,07% (wt/vol) | 6 ΜL |
| HMD lösning | 2 ΜL |
| rATP, 80 mM | 0,5 ΜL |
| rGTP, 8 mM | 1 ΜL |
| rUTP, 0,4 mM | 1 ΜL |
| rCTP, 8 mM | 1 ΜL |
| RNase inhibitor, 40 U/µL | 0,5 ΜL |
| RNase-gratis vatten | 1 ΜL |
Tabell 2: RdRP reaktion mix komponent.
| Reagenser | Volym |
| RNase en ribonunkleas, 10 U/µL | 0.2 ΜL |
| Reaktion buffert, 10 x | 20 ΜL |
| RNase-gratis vatten | 159,8 ΜL |
Tabell 3: Ribonunkleas reaktion mix komponent.
Discussion
IP-RdRP analysen är en känslig metod för att upptäcka RdRP aktivitet av mänskliga TERT. TERT proteinet uttrycks mycket i mitotiska HeLa celler, där TERT bildar RdRP komplexa8,9,10. Detta tyder på att mitotiska HeLa cells är ett optimalt material till upptäcka RdRP aktivitet. I det protokoll som beskrivs ovan, ingår mitotiska och icke-synkroniserade HeLa cells som ett positivt och ett negativt exempel, respektive. Som visas i figur 1A, RdRP assay produkter från mallen rekommenderade RNA i mitotiska HeLa cells Visa bred radioaktiva signaler mellan 20 till 30 nt. Förutom HeLa cells, har vi utfört analysen med olika typer av cellinjer, och fann att signalbild kan ändras i olika cell typer9: några visar en stark signal endast runt 30 nt, några visar ett liknande mönster med HeLa cells. Vi har även utfört analysen med RNA mallar än den 34 nt mall8, korta och långa (~ 300 nt) RNAs med olika sekvenser, och framgångsrikt fått RdRP produkter från dessa mallar även om det kan finnas vissa preferens. För den första rättegången, dock rekommenderar vi HeLa cells mitotiska fas och 34 nt RNA mallen. RdRPs kan generera dubbelsträngat RNA både i en primer-beroende och en primer-oberoende sätt11. Vi har rapporterat att TERT bevarar denna fastighet som mänskliga RdRP7,9. TERT syntetiserar dsRNA från en RNA-mall med 3'-foldback struktur genom en tillbaka-priming mekanism7. För mallen 34 nt RNA syntetiserar TERT kompletterande trådar utan att använda primers9. Att specifikt identifiera RdRP produkter syntetiseras i en primer-oberoende sätt, dvs de novo syntetiseras RNA produkter, [α -32P] NTP kan ersättas med [γ -32P] NTP i RdRP reaktion9.
MNase behandling av TERT immunkomplex på pärlor är ett viktigt steg för att uppnå önskat resultat. Om MNase behandlingen utförs för länge eller med intensiv skakning, skulle de RdRP produkterna minskas anmärkningsvärt. För att undvika sådana problem, rekommenderar vi att strikt följa protokollet noggrant. HMD lösning är en annan avgörande faktor för framgång. Om du hittar att signalerna är mycket svaga, ersätta HMD lösningen till en nyligen beredd.
I hela protokollet, bör man ta stor omsorg att undvika RNase kontaminering. Ribonunkleas behandling bör utföras med särskild utrustning. Efter att manipulera ribonunkleas, en bör kassera tips och rör med RNase omedelbart, eliminera RNase med specialiserade lösning (t.ex. RNase lugnt) och ändra lundar.
TERT interagerar med inte bara TERC men även många typer av endogena RNAs, och vi har rapporterat en del av dem7. Ändring i IP-RdRP-analysen, till exempel IP-RdRP analysen utan MNase behandling, kommer att ge en full lista av endogena RNA mallar för TERT-associerad RdRP aktivitet och bioinformatiska guide på deras sekvens funktioner. Vi har framgångsrikt tillämpat detta protokoll till vävnad lysate. Eftersom TERT uttrycks i en mängd normal och tumör vävnader, kan denna analys vara bra att undersöka icke-kanoniska enzymatiska funktion av TERT i mänskliga.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds delvis av projektet för utveckling av innovativa forskning om Cancer Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) och projektet för cancerforskning och terapeutiska Evolution (P-skapa) (16cm 01061150001, K.M.) från Japan Agency för medicinsk forskning och utveckling, AMED; Stiftelsen Takeda vetenskap (Y.M.); Beviljande av Princess Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); och JSPS KAKENHI licensnummer JP16K07133 (Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
| Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
| Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
| Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
| Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
| Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
| Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
| Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
| Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
| Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
| Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
| cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
| Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
| 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
| Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
| rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
| [a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
| RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
| Proteinase K | Takara | 9033 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
| 3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
| Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
| RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
| Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
| Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
| CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
| Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
| Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
| Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
| Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
| MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
| Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
| Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |
References
- Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
- Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
- Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
- Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
- Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
- Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
- Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
- Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
- Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
- van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).
