Summary
وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.
Abstract
جزر البنكرياس، وتسمى أيضا الجزر من Langerhans، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج الهرمونات لتنظيم الجلوكوز وغيرها من الوظائف البيولوجية الهامة. الجزر تتكون في المقام الأول من خمسة أنواع من الخلايا التي تفرز الهرمونات: خلايا α تفرز الجلوكاجون، خلايا بيتا تفرز الأنسولين، خلايا δ تفرز سوماتوستاتين، خلايا تفرز غريلين، وخلايا PP تفرز ببتيد البنكرياس. 60 إلى 80٪ من الخلايا في الجزر هي خلايا بيتا، والتي هي أهم خلية السكان لدراسة إفراز الأنسولين. جزر البنكرياس هي نظام نموذج حاسم لدراسة إفراز الأنسولين في الجسم الحي السابق. الحصول على جزر عالية الجودة هو ذو أهمية كبيرة لبحوث مرض السكري. تتطلب معظم إجراءات عزل الجزيرة صعوبة تقنية في الوصول إلى موقع حقن الكولاجين، وإجراءات الهضم القاسية والمعقدة، وخطوات تنقية التدرج المتعددة الكثافة. تتميز هذه الورقة بطريقة بسيطة عالية الإنتاجية لعزل جزيرة الماوس مع أوصاف مفصلة ومظاهرات واقعية، وتبين الخطوات المحددة التالية: 1) حقن الكولاجين P في أمبولة فاتر، وهي منطقة صغيرة تنضم إلى قناة البنكرياس و القناة الصفراوية المشتركة، 2) الهضم الأنزيمي والفصل الميكانيكي للالبنكرياس exocrine، و 3) خطوة تنقية التدرج واحد. مزايا هذه الطريقة هي حقن إنزيم الجهاز الهضمي باستخدام أمبولة أكثر سهولة من Vater، والهضم أكثر اكتمالا باستخدام مزيج من النهج الأنزيمية والميكانيكية، وأبسط خطوة تنقية التدرج واحد. ينتج هذا البروتوكول ما يقرب من 250-350 جزيرة لكل ماوس; والجزر الصغيرة هي مناسبة لمختلف الدراسات في الجسم الحي السابق. المحاذير المحتملة من هذا الإجراء يحتمل أن تكون مصحوبة بأضرار الجزر بسبب الهضم الأنزيمي و / أو حضانة التدرج لفترات طويلة، وكلها يمكن تجنبها إلى حد كبير عن طريق تبرير الإعلان الدقيق لوقت الحضانة.
Introduction
هناك طريقتان شائعتان في الأدب لعزل الجزيرة البنكرياسية. واحد يتطلب استئصال البنكرياس وتقطيعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الجراحية، ومن ثمهضمه في محلول الكولاجين 1،2،3. طريقة أخرى أكثر دقة هو استخدام شبكة من القنوات الموجودة في البنكرياس لإدخال إنزيم الجهاز الهضمي. وقد استخدمت المواقع التالية لحقن الإنزيم الهضمي: تقاطع القناة الصفراوية والكيسي، المرارة في القناةالصفراوية المشتركة، أو القناة الصفراوية المشتركة نفسها 1،4،5. ومن المعروف أن الجزر لا توزع بالتساوي في البنكرياس. منطقة الطحال يحتوي على معظم الجزر6. في حين أن الطريقة الثانية باستخدام الطرق التشريحية لتقديم الإنزيمات الهضمية يسمح لضخ أكثر اكتمالا من البنكرياس، بما في ذلك منطقة الطحال، وهذا الإجراء غالبا ما يتطلب لقط أو خياطة أمبولة من Vater التي هي من الناحية الفنية تحديا. من حيث تنقية جزيرة، وقد استخدمت التدرجات كثافة متعددة، فضلا عن مصافي الخلاياوالتراجع المغناطيسي لتنقية الجزر 3،7. استخدام هذه التدرجات يمكن أن تستغرق وقتا طويلا والتدرجات فيكول يمكن أن يؤدي إلى ضرر سام من الجزر8.
ويستند البروتوكول الحالي على الطريقة التي وصفها لي وآخرون7، مع تعديلات إضافية تضاف على أساس تجربة أنفسنا والآخرين1،4. الخطوات الأكثر أهمية من بروتوكولنا هي لقط من القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من نهاية الكبد، حقن الكولاجين P عن طريق أمبولة فاتر لهضم الأنسجة exocrine، ومن ثم استخدام حمام الماء تهتز لتسريع الهضم ميكانيكيا1، 4،7. في وقت لاحق، يتم تطبيق حل 'STOP' لمنع المزيد من الهضم من الجزر. يستخدم HBSS لغسل ما تبقى من الكولاجين P وSTOP الحل. عندما تم استخدام طريقة فيكول لتنقية الجزر البشرية، أفيد أن العائد هو ضعف الجزر مع قدرة وظيفية أكبر (على سبيل المثال، إفراز الأنسولين) بالمقارنة مع استخدام التدرجات Percoll9. ومع ذلك، شككت الدراسات في استخدام تدرج فيكول بسبب تأثيره السام على الجزر1،10. وقد أفيد أن التدرج Histopaque يوفر حركية تنقية الأمثل لعزل جزيرة الماوس، والتي تنتج غلةجيدة من الجزر عالية الجودة مع خطوات أبسط وتكلفة أقل 1. في بروتوكولنا، يستخدم Histopaque-1077 لتنقية الجزرمن الأنسجة المتبقية الأخرى 8،11. يمكن زراعة الجزر المقطوعة في وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640، أو استخدامها مباشرة في RNA /البروتين الكم.
بروتوكولنا، وذلك باستخدام مزيج من الكولاجين P الهضم وخطوة تنقية التدرج واحد، هو أبسط من البروتوكولات المنشورة الأخرى. أسلوبنا لا يتطلب إجراءات جراحية صعبة ولها فقط بضع خطوات بسيطة. والأهم من ذلك، هذا البروتوكول تنتج باستمرار عائد جيد من الجزر الوظيفية عالية الجودة (250-350/mouse) كما أبلغنا12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (ACUC) من جامعة تكساس A & M. تظهر الأدوات الجراحية اللازمة في الشكل 1 ويظهر الرسم التخطيطي للإجراء في الشكل 2.
1- الحلول
- إعداد حل الملح المتوازن هانك (HBSS) عن طريق إضافة 100 مل من 10X HBSS (من المخزون) إلى 900 مل من الماء المقطر لجعل 1 L HBSS (1X).
- إعداد حل STOP (يجب أن تكون طازجة وينبغي استخدامها في غضون 1 ح) عن طريق إضافة 50 مل من 100X المصل البقري الجنيني (FBS) إلى 450 مل من الجليد البارد 1X HBSS؛ هذا يجعل 500 مل إيقاف الحل. حافظ على حل STOP عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- إعداد محلول الكولاجين P (يجب أن تكون طازجة في غضون 1 ساعة من استخدامها) عن طريق إضافة 1 ملغ / مل من الكولاجين P إلى الجليد البارد 1X HBSS. استخدام 6 مل / ماوس.
- إضافة 0.05٪ (ث / الخامس) الزلال المصل البقري (BSA) إلى محلول الكولاجين P (وهذا يوفر المواد الغذائية للجزر المعزولة). على سبيل المثال، استخدم 3 ملغ BSA في 6 مل كولاجيناز P الحل. الحفاظ على الجليد.
- حساب وإعداد كمية الكولاجين P اللازمة لجميع الفئران في أنبوب واحد 50 مل.
- إعداد كامل RPMI 1640 المتوسطة عن طريق إضافة 10٪ FBS، 100 U/mL البنسلين، 100 ميكروغرام / مل ستربيوميسين، INS-1 ملحق الخلية (10 مل HEPES، 2 مل L-الجلوتامين، 1 mM بيروفات الصوديوم، و 0.05 مل 2-mercaptoethanol) إلى 500 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام التي تحتوي على 5.5 M الجلوكوز لاستخدامها للثقافة بين عشية وضحاها والحضانة.
2- الإعداد
- ملء ثلاثة أنابيب 50 مل من 25 مل RNase تثبيط الحل، 70٪ الإيثانول أو المقطر H2O. سيتم استخدام هذه الحلول لتنظيف الأدوات الجراحية قبل وأثناء العملية.
- نقع نصائح من الأدوات في RNase تثبيط الحل لمدة 30 دقيقة قبل بدء البروتوكول. هذا يلغي أي RNase المحتملة على الأدوات.
- قبل قطع منصات ماصة إلى 6 في × 6 في الحجم للاستخدام أثناء الجراحة.
- إعداد 1X HBSS الحل مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية. إعداد حل STOP قبل الجراحة. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- إعداد محلول الكولاجين P مباشرة قبل الجراحة وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: يجب استخدام هذا في غضون 2 ساعة من الإعداد. - تسمية أنابيب 50 مل للهضم وتنقية; إعداد 2 أنابيب لكل فأر، واحد للهضم والآخر لتنقية islet. تأكد من أن هوية الحيوان على كلا الأنبوبين.
- إضافة 3 مل من محلول كولاجيناز P في أول أنبوب 50 مل. سيتم حقن 3 مل المتبقية من الكولاجين P.
- رسم ما تبقى 3 مل من محلول الكولاجين في حقنة 3 مل شنت مع 30 G 1/2 في إبرة. ضع الحقنة على الثلج
3- الإجراء
- إزالة جميع الأدوات من RNase تثبيط الحل، ثم تراجع لهم أولا في الأنبوب مع الإيثانول 70٪، ثم في أنبوب يحتوي على المقطر H2O، ثم الهواء الجاف على منشفة ورقية نظيفة.
- ضع الماوس في غرفة تحتوي على 0.5 مل من الإسيوفروران حتى يتم التخدير بعمق الماوس.
- إزالة الماوس من الغرفة والتحقق من حالة التخدير عن طريق معسر وسادة القدم مع ملقط. ويستند التخدير العميق على ملاحظة أن التنفس تصبح بطيئة باطراد والماوس غير رد الفعل على القدم معسر. بعد التأكد من أن الماوس هو التخدير العميق ، قتل الفأر مع خلع عنق الرحم ، ثم وضع الماوس على لوحة ماصة.
- وضع الماوس التخدير على بطنه، وتطبيق الضغط على الرقبة وخلع العمود الفقري من الدماغ عن طريق سحب الذيل.
- الشريط أطراف الماوس في موقف supine إلى وسادة ماصة، رش الجسم مع الإيثانول 70٪، ومسح الزائدة من الإيثانول الزائد.
- استخدام ملقط الزجاج غطاء ومقص الجراحية المنحنية لجعل الشقوق. أولا جعل شق أفقي على جلد منطقة البطن (~ 3 سم)، وسحب الجلد مفتوحة على مصراعيها لفضح جدار البطن. ثم جعل شق عمودي (~ 3-4cm) على الشمع البطني لفضح البنكرياستماما في تجويف البطن (الشكل 3).
- دفع فصوص الكبد متفوقا لفضح القناة الصفراوية، وسوف تظهر كأنبوبوردي شاحب (الشكل 3).
- نقل الأمعاء بعناية من المنطقة القطنية / الحرقفية اليمنى من تجويف البطن إلى اليمين، وتعريض القناة الصفراوية والشريان الكبدي (الشكل3).
- بعناية المشبك القناة الصفراوية المشتركة باستخدام serrefines شوارتز الصغيرة (الشكل1) أقرب إلى الكبد قدر الإمكان.
- تحديد أمبولة فاتر، الذي يقع في الحليمة الاثني عشر، التي شكلتها اتحاد قناة البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة. أمبولة Vater يبدو منتفخا عند النظر إليها تحت المجهر تشريح الذي هونقطة الدخول إلى القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 4).
ملاحظة: ضبط كثافة / زاوية ضوء المجهر تشريح يمكن أن تجعل من الأسهل لتحديد موقع. - إدراج حقنة مع 3 مل من محلول الكولاجين P في أمبولة من Vater. دفع الإبرة في القناة لحوالي 1/4 من طول القناة الصفراوية المشتركة (أمبولة يؤدي إلى القناة) كما هو مبين في الشكل 5.
- مرة واحدة الإبرة في أمبولة، تأكد من أن اتجاه الإبرة هو من هذا القبيل أنه موازي ة مع القناة.
- استقرار الإبرة عن طريق لقط مع ملقط Adson الصغيرة لمنعها من ثقب القناة (الشكل5).
- حقن ببطء وثبات 3 مل من محلول الكولاجين P من المحاقن في القناة الصفراوية المشتركة (ما يكفي ليشعر المقاومة) كما هو مبين في الشكل 6. والهدف من ذلك هو خلق ضغط التدفق الخلفي لإجبار الكولاجين على دخول قناة البنكرياس. يعتبر الحقن ناجحا إذا كان الرأس والرقبة والجسم ومنطقة الذيل من البنكرياس كلها تضخمت تماما.
ملاحظة: سيكون عائد الislet منخفضًا إذا لم يتم تضخم البنكرياس بشكل كامل، أو إذا لم يتم تضخيم منطقة الطحال بشكل كامل. منطقة الطحال يحتوي على أكبر عدد من الجزر6. يمكن تأكيد التضخم من خلال ظهور المساحات المفتوحة بين أنسجة البنكرياس التي تمتلئ بالحل. - تشريح بعناية من البنكرياس تضخم ووضعها في أنبوب الهضم 50 مل التي تحتوي على 3 مل من الجليد الباردة كولاجيناز P الحل.
- إزالة البنكرياس باستخدام 2 ملقط (منحني ة ومايكرو Adson; انظر الشكل1): (بدءا من الطحال، وسحب البنكرياس بعيدا عن الطحال ومواصلة إزالة من المعدة وعلى طول الاثني عشر.
ملاحظة: لا توجد شقوق مطلوبة. - قم بتقطيع البنكرياس لمدة 3-5 ثوان في أنبوب الهضم مع 3 مل من محلول كولاجيناز P المثلج باستخدام مقص جراحي ناعم (الشكل7A).
- إزالة البنكرياس باستخدام 2 ملقط (منحني ة ومايكرو Adson; انظر الشكل1): (بدءا من الطحال، وسحب البنكرياس بعيدا عن الطحال ومواصلة إزالة من المعدة وعلى طول الاثني عشر.
- تأمين الأنبوب إلى رف في حمام مائي 37 درجة مئوية ويهز في 100-120 دورة في الدقيقة لمدة 12-13 دقيقة تقريبا.
- بعد الحضانة، يهز بلطف الأنابيب باليد لتعطيل الأنسجة حتى يصبح محلول الهضم الكولاجين P متجانسة (الشكل7B). يتم تأكيد التجانس من خلال ظهور يشبه الجسيمات الدقيقة من البنكرياس. حوالي 30 ث من لطيف المصافحة اليد عادة ما يكون كافيا. عقد الأنبوب حتى الضوء لفحص ما إذا كان الأنسجة متجانسة بشكل جيد. يهز لآخر ~ 15 s إذا لزم الأمر.
- مرة واحدة هضمها، على الفور وضع الأنابيب على الجليد وإضافة 40 مل من الجليد الباردة وقف الحل لإنهاء الهضم الأنزيمي.
ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن ترك أنابيب الهضم على الجليد تصل إلى 2 ساعة، إذا كان العمل على فئران متعددة. - الطرد المركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو في 300 × ز لمدة 30 ق (درجة حرارة الطرد المركزي مرنة).
ملاحظة: استخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو بحيث يتم تشكيل بيليه الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل وليس على جدار الأنبوب؛ هذا أمر بالغ الأهمية لتحسين غلة الهَسَلِت. - Decant وتكرار الطرد المركزي مع حل STOP 2 مرات أخرى، وdecanting الحل بعد كل تدور. استخدام 20 مل من حل STOP لكل غسل اللاحقة.
- قبل كل تدور، وتعطيل بيليه عن طريق هز بلطف بيليه الأنسجة في أنبوب 50 مل في محلول وقف 20 مل.
- إعادة تعليق بيليه الأنسجة مع 40 مل من الجليد الباردHBSS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 30 ق.
- Decant وتكرار الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو مع حل HBSS مرتين أكثر، وdecanting الحل بعد كل تدور. استخدام 20 مل من HBSS لكل غسل.
- قبل كل تدور، وتعطيل بيليه، لفصلها من الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق هز بلطف أنبوب يحتوي على 20 مل HBSS الحل.
- بعد الطرد المركزي الأخير إزالة جميع HBSS.
- ثم إضافة 5 مل من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب 50 مل التي تحتوي على بيليه. دوامة لفترة وجيزة في سرعة منخفضة حتى متجانسة.
- إضافة آخر 5 مل من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب 50 مل. لا دوامة / مزيج.
ملاحظة: من الضروري أن تبقى ثابتة ولا يزال للسماح أفضل التدرج لتشكيل دون تعطيل. - ماصة 10 مل من درجة حرارة الغرفة HBSS العازلة في الأنبوب (التي تحتوي على التدرج الكثافة)، قطرة بقطرة بلطف وببطء للسماح للتدرج لتشكيل. استخدام بندقية ماصة مع ماصة 10 مل لإضافة HBSS قطرة.
- باستخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو، تدور أنابيب في 1700 × ز لمدة 15 دقيقة.
- بعد الدوران، قم بإزالة الأنابيب بعناية دون إزعاج التدرج. باستخدام بندقية ماصة مبتلة مسبقا مع HBSS الباردة (ماصة HBSS صعودا وهبوطا)، ماصة من طبقة الجزر (5-10 مل) شكلت بين تدرج الكثافة وHBSS في أنبوب جمع جزيرة 50 مل جديدة.
ملاحظة: من المفيد أن تبلل الماصة مع HBSS الباردة قبل الأنابيب الجزر لمنع الجزر من التمسك الجدران الداخلية للماصة.- في حالة عدم اكتمال الفصل، تكون الجزر الصغيرة مرئية في طبقة تدرج الكثافة، وصالة من كامل 10 مل من تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) جنبا إلى جنب مع طبقة جزيرة شكلت في واجهة (فقط لترك حوالي 8-10 مل من الطبقة العليا HBSS وراء).
ملاحظة: يمكن أن يؤدي جمع كل من طبقة islet وطبقة تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) إلى جمع الحطام الذي قد يطيل وقت انتقاء الislet، ولكن لن يتم تغيير أية خطوات أخرى. جمع كل من هذه الطبقات ليست ضرورية عندما يتم تشكيل طبقة islet بشكل جيد.
- في حالة عدم اكتمال الفصل، تكون الجزر الصغيرة مرئية في طبقة تدرج الكثافة، وصالة من كامل 10 مل من تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) جنبا إلى جنب مع طبقة جزيرة شكلت في واجهة (فقط لترك حوالي 8-10 مل من الطبقة العليا HBSS وراء).
- إضافة 20 مل من الجليد البارد HBSS إلى أنبوب 50 مل الجديد الذي يحتوي على الجزر، ثم الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 3 دقائق في جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو.
- بعد تدور، ماصة بعناية (لاdecant)من supernatant (ترك ~ 3 مل في الجزء السفلي) دون إزعاج بيليه التي تحتوي على الجزر في الجزء السفلي. تجاهل الـ supernatant.
- كرر الغسيل والطرد المركزي 3 مرات على الأقل. إضافة 20 مل من HBSS في كل مرة، وتأكد من تعليق بيليه قبل كل تدور.
- قم بتسخين زجاجة وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640 في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. بعد الطرد المركزي الأخير، وإزالة كل من HBSS وإضافة 4 مل من الوسائط RPMI-1640 كاملة أعدت سابقا (تحتوي على FBS، INS-1 ملحق الخلية والبنسلين / العقدية) إلى بيليه.
- قم بإزالة بيليه عن طريق الدوران بلطف في الأنبوب وصب على الفور وسائل الإعلام RPMI-1640 في طبق بيتري 100 مم. إضافة آخر 5 مل من وسائل الإعلام RPMI-1640 إلى الأنبوب ودوامة بلطف لغسل أي الجزر المتبقية، ثم أيضا صب وسائل الإعلام في نفس طبق بيتري.
- تحت مجهر تشريح، واختيار الجزر الصحية من طبق بيتري باستخدام ماصة 20 درجة مئوية، ووضعها في طبق بيتري جديد يحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 كاملة. عندما ينظر إليها تحت المجهر تشريح، يجب أن تظهر الجزر كروية / مستطيل والذهبي البني اللون مع سطح أملس بالمقارنة مع شفافة نسبيا، والأنسجة exocrine wispy.
ملاحظة: عادة ما يتم تعيين تكبير مجهر تشريح في 12.5-16x. سوف تختلف غلة جزيرة اعتمادا على عوامل مختلفة بما في ذلك سلالة, عمر وجنس الماوس. عادة ما ينتج هذا البروتوكول 250-350 الجزر الصحية من عمر الماوس C57BL/6J صحية 4-10 أشهر.
- تحت مجهر تشريح، واختيار الجزر الصحية من طبق بيتري باستخدام ماصة 20 درجة مئوية، ووضعها في طبق بيتري جديد يحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 كاملة. عندما ينظر إليها تحت المجهر تشريح، يجب أن تظهر الجزر كروية / مستطيل والذهبي البني اللون مع سطح أملس بالمقارنة مع شفافة نسبيا، والأنسجة exocrine wispy.
- احتضان الجزر في حاضنة معقمة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 التسريب و 95٪ الهواء المرطب بين عشية وضحاها للتجارب في اليوم التالي، أو تجميد الجزر للتحليل المطلوب في وقت لاحق.
- مرة واحدة يتم تجميد الجزر الصغيرة، لا يمكن استخدامها لإفراز الاختبارات، فقط RNA أو البروتين القياس الكمي. لجمع الخلايا لتجميد، ووضعها في المخزن المؤقت HBSS، وجمع جميع الجزر في 200-500 ميكرولتر من العازلة، ونقل إلى أنبوب 1.5 مل، الطرد المركزي 350 × غرام لمدة 1-2 دقيقة، وإزالة supernatant ترك ما لا يزيد عن 30-40 محلول لتر، ووضع في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير ( عدة أيام) أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إكمال هذا الإجراء بشكل صحيح يتطلب بعض الفهم لتشريح الماوس في تجويف البطن. وهذا يسمح لتحديد السليم من أمبولة من Vater ولقط من القناة الصفراوية المشتركة. يستغرق الإجراء بأكمله عادة 1-2 ساعة. ومن الأكثر كفاءة عزل الجزر الصغيرة من 4-6 فئران في نفس الوقت، لذلك يمكن طرد العديد من العينات معاً. ويختلف وقت قطف الجزر، حسب عدد الجزر وكفاءة الهضم؛ قد يستغرق الأمر حوالي ساعة لاختيار 250-350 جزيرة صغيرة من فأر واحد.
في هذه الورقة، يتم تضمين عدد من الصور واقعية جدا: الشكل 3 يظهر تجويف البطن من الماوس، وفضح القناة الصفراوية المشتركة والشريان الكبدي. يظهر الشكل 4 طول القناة الصفراوية الشائعة، والتي يبدو أنها لون أخف، وكذلك أمبولة Vater، وهو أكبر وألمع بالقرب من المنعطف (حيث سيتم إدخال الإبرة) بين البنكرياس والاثني عشر. يتم وضع المشبك في القناة الصفراوية المشتركة وحزمة الشريان الكبدي على مقربة من الكبد لمنع تدفق الكولاجين P إلى الكبد. الفشل في المشبك القناة الصفراوية بشكل صحيح أو ضيق بما فيه الكفاية سيؤدي إلى تسرب وضخ غير مكتملة من البنكرياس. يظهر الشكل 5 الإبرة التي تم إدخالها في أمبولة فاتر في القناة الصفراوية المشتركة. مرة واحدة الإبرة في القناة المشتركة، وتستخدم ملقط لتثبيت الإبرة لمنعها من ثقب القناة أثناء الحقن. بمجرد أن يبدأ الحقن ، سيبدأ البنكرياس في التضخم من نهاية القريب إلى النهاية البعيدة. يجب أن تبدأ منطقة الطحال في تضخيم بعد حوالي 1 مل من حقن الكولاجين. يمكن أن يؤدي التدفق الخلفي إلى الأمعاء إلى تضخم غير مرغوب فيه من الاثني عشر. ويمكن علاج هذا عن طريق تعديل وضع الإبرة (سحبها قليلا، أو إعادة إدراج أعمق قليلا) وعن طريق تثبيت الإبرة بشكل صحيح باستخدام ملقط. ويعتبر الحقن نجاحا إذا تم تضخيم جميع مناطق البنكرياس (الاثني عشر، المعدة، والفصوص الطحال) كما هو مبين في الشكل 6. يجب أن تبدأ إزالة البنكرياس من منطقة الطحال. يتم تقطيع البنكرياس المتضخم إلى قطع باستخدام مقص الجراحية غرامة (الشكل7A). بعد 12-13 دقيقة الهضم والخلط عن طريق هز اليد، وتعليق تحتوي على الأنسجة يبدو أكثر تجانسا (الشكل7B). في وقت لاحق، يتم تنقية الجزر من قبل التدرج الكثافة بعد الطرد المركزي. ويبين الشكل 7C أن طبقة تعليق الهَسَلة تُشكَّل بين HBSS والتدرج الكثافة بعد الطرد المركزي. تظهر الجزر الجيدة/الصحية على شكل دائري ناعم. الجزر سيئة / التالفة تظهر حواف خشنة، والأنسجة exocrine غير مهضوم يظهر شكل غير منتظم ويبدو أكثر شفافية كما هو مبين في الشكل 8.
الشكل 1: الأدوات الجراحية.
يظهر مقص جراحي منحني، ملقط الزجاج غطاء، ملقط Adson الصغيرة، ملقط منحني، مقص الجراحية الصغيرة، وSerrefines شوارتز الصغيرة (المشبك الأوعية الدموية الدقيقة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توضيح تخطيطي للبروتوكول.
الخطوات الأكثر أهمية من هذا الإجراء هي لقط القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الكبد، وحقن الكولاجين P عن طريق أمبولة فاتر في القناة الصفراوية المشتركة لهضم البنكرياس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: موقع القناة الصفراوية الشائعة.
الملقط عقد القناة الصفراوية المشتركة وحزمة الشريان الكبدي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم توضيحي للقناة الصفراوية الشائعة وأمبير ولات فاتر.
يتم وضع المشبك على القناة الصفراوية الشائعة وحزمة الشريان الكبدي بالقرب من الكبد. تشير الأسهم السوداء إلى أمبولا من Vater حيث سيتم إدخال الإبرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تعليب القناة الصفراوية الشائعة.
بعد التعليب السليم للقناة الصفراوية المشتركة ، يتم حقن أمبولة فاتر بالأزرق التريبان (لغرض العرض التوضيحي فقط) للتأكيد بشكل أفضل على وضع القناة الصفراوية الشائعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: البنكرياس المتضخم بالكامل.
يظهر الخط المنقط حدود البنكرياس المنصهر بالكامل. الملقط عقد حتى منطقة الطحال حيث الجزر هي الأكثر تتركز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: خطوات عزل وتنقية الجزيرة.
(أ) قطع الأنسجة المفرومة ميكانيكيا من البنكرياس قبل الهضم. (ب) البنكرياس المهضوم - تعليق الأنسجة المتجانسة من البنكرياس المغروس بالكولاجين بعد 13 دقيقة من الحضانة في حمام مائي تهتز عند 37 درجة مئوية، تليها 30 ق من الخلط باليد. (C) تتشكل طبقة تعليق الهَسْتَلة بين HBSS وتدرج الكثافة بعد الطرد المركزي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: صور من صور البُصِنة الفلورية من الخلايا الفلورية.
(أ) ينظر إلى الجزر الجيدة والجزر الصغيرة السيئة والأنسجة الخارجية. (ب) تظهر مجموعة من الجزر الصغيرة الجيدة. (ج) يُظهر الفريق الأنسجة الخارجية غير المهضومة المتصلة برسالة جيدة. الجزر الجيدة / الصحية تظهر حواف مستديرة على نحو سلس، المشار إليها من قبل الحرف الأحمر "G".؛ الجزر سيئة / التالفة تظهر شكل غير منتظم وحواف خشنة، ويشار إليها بحرف أزرق "B". تبدو الأنسجة الخارجية غير المهضومة شفافة، وغالباً ما تكون متصلة بالجزر الصغيرة، ويشار إليها بالحرف الأخضر "E". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويشمل هذا البروتوكول التسريب الكولاجينوووووووالهضم، تليها تنقية الجزر. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي الحقن الفعال والتسريب الكامل من البنكرياس1،4،7. طريقة التسليم من هذا البروتوكول يسمح للإنزيم لاجتياز الطرق التشريحية لهضم أفضل الأنسجة exocrine المحيطة الجزر1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هي مناسبة تماما للهضم الكامل للمنطقة الطحال، والتي لديها أعلى تركيز من الجزر4،6. هذا البروتوكول، مع وقت الهضم التي تسيطر عليها جيدا وخطوات تنقية نفذت بعناية، يمكن أن تنتج 250-350 الجزر الصحية. وقد استخدمت الجزر المعزولة من هذا البروتوكول بنجاح لدراسة إفراز الأنسولين تحفيز الجلوكوز السابقين فيالجسم الحي12. من تجربتنا، زاد إفراز الأنسولين 4 أضعاف عند تحفيز الجلوكوز العالي (22.2 مليون متر مكعب) مقارنة بخط الأساس (3.3 مليون متر مربع) بعد الحضانة الليلية في وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640 التي تحتوي على الجلوكوز 5.5 مليون متر مربع. لم يتم اختبار إمكانية البقاء على قيد الحياة/وظيفة الجزر تحت الحضانة المطولة (2-7 أيام).
وعلى الرغم من أن البروتوكول المقدم يتضمن ملاحظات تفصيلية وعروض مرئية، فإن هناك حاجة إلى إدخال بعض التعديلات لتحقيق الظروف المثلى للجزر ذات العائد العالي والجودة العالية. هناك مشكلتان شائعتان قد تعوقان النجاح وهما التعليب غير السليم لقدرة الأمبير ية في فاتر أو ثقب عرضي للقناة. لتجنب هذه، ينبغي للمرء أن يضمن أن موقع الاختراق هو بالضبط حيث يلتقي أمبولة مع الاثني عشر. هذه المنطقة أكبر وسهلة نسبيا لتحديد، والذي يسمح لثقوب متعددة دون المساس بشكل خطير سلامة القناة. مرة واحدة داخل أمبولة، يجب أن يكون اتجاه الإبرة موازية مع القناة بدلا من الزاوية. عند هذه النقطة، دفع الإبرة في القناة لحوالي 1/4 من طول القناة، ومن ثم استقرار الإبرة مع ملقط في حين حقن الكولاجين ببطء. وهذا سوف يساعد على منع الإبرة من الانحناء تحت الضغط وثقب بطريق الخطأ القناة. قد تشمل المشاكل الأخرى الإفراط في هضم البنكرياس أو نقصه. وهذا قد يتطلب تعديل على أساس العمر والإجهاد والجنس من الفئران. الجزر التالفة بسبب الإفراط في الهضم (الأنزيمية والميكانيكية) أو التعرض لفترات طويلة لتدرج الكثافة قد تحدث. هذه هي المشاكل الشائعة التي توجد لأساليب مماثلة; وينبغي أن تسفر بعض التعديلات الطفيفة عن تحسينات كبيرة. اقتراح عند التعامل مع هذه الأنواع من القضايا هو اختيار متغير واحد لتعديل في وقت واحد (على سبيل المثال، وقت الهضم أو تركيز الكولاجين).
الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو الطريق من تسليم الإنزيم: وجود الكولاجين P لهضم مباشرة البنكرياس exocrine باستخدام مسار تشريحي أسهل مما يزيد من كفاءة الهضم1. وقد أفيد أن هذه الطريقة تسفر عن زيادة بنسبة 50٪ في عدد الجزر مقارنة مع طريقة استئصال البنكرياس، وتقطيعه، وتعريضه للكولاجيناز13. يتطلب هذا البروتوكول فقط استخدام تدرج كثافة واحد، مما يجعله أقل كثافة في العمالة بشكل كبير وأكثر فعالية من حيث التكلفة، مقارنة بالأساليب الأخرى التي تتطلب إعداد تدرجات متعددة في كثافات مختلفة، أو المعقدة طريقة Percoll التيتتطلب وقت إضافي 1،8،11. كما تم استخدام طريقة التدرج المستخدمة في هذا البروتوكول في عزل الجزيرة من قبل الآخرين4. توفر هذه الطريقة لعزل الجزيرة للعالم أداة محسنة لدراسة جزر البنكرياس. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول التغيير لتعزيز فعالية عند التعامل مع الفئران السكري. كما لاحظ وآخرون، الفئران السكري، اعتمادا على مستويات الجلوكوز، تسفر عن عدد أقل من الجزر (أقل من 100)، مع انخفاض حجم ومظهر الجزر4. وقد لاحظنا هذه الظاهرة ونعتقد أن الجزر السكرية هي أكثر عرضة للهضم الأنزيمي والميكانيكية التي تتطلب رعاية خاصة. بالإضافة إلى ذلك، قد تغير كثافة جزيرة مظهرها في تدرج الكثافة، وزيادة تحسين البروتوكول من شأنه أن يساعد على زيادة غلة الجزر السكرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للغاية للسيدة جنيفر مونغيا على توضيحها الفني للرسم التخطيطي. نشكر السيد مايكل ر. هونيغ في محطة الإذاعة العامة المجتمعية في هيوستن KPFT على مساعدته التحريرية. تم دعم هذه الدراسة من قبل الجمعية الأمريكية للسكري #1-15-BS-177 (YS)، وNIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). كما تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1010840 (YS) وR01 DK095118 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
