Summary
Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.
Abstract
Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che produce ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Le isole sono costituite principalmente da cinque tipi di cellule che secernono l'ormone: le cellule secernono glucagone, le cellule secernono insulina, cellule che sortostatine, le cellule secernono la grelina e le cellule PP secernono la polipeptide pancreatica. Il sessanta-80% delle cellule nelle isole sono cellule z, che sono la popolazione cellulare più importante per studiare la secrezione di insulina. Le isole pancreatiche sono un sistema modello cruciale per studiare la secrezione di insulina ex vivo. Acquisire isocchi di alta qualità è di grande importanza per la ricerca sul diabete. La maggior parte delle procedure di isolamento dell'isolotto richiedono tecnicamente difficile accedere al sito di iniezione di collagenase, procedure di digestione dure e complesse e più fasi di purificazione del gradiente di densità. Questo documento presenta un semplice metodo di isolamento dell'isolotto del mouse ad alto rendimento con descrizioni dettagliate e dimostrazioni realistiche, che mostra i seguenti passaggi specifici: 1) iniezione di collagene P all'ampulla di Vater, una piccola area che unisce il condotto pancreatico e il dotto biliare comune, 2) la digestione enzimatica e la separazione meccanica del pancreas esocrino, e 3) un singolo passo di purificazione del gradiente. I vantaggi di questo metodo sono l'iniezione di enzima digestivo utilizzando l'ampulla più accessibile di Vater, una digestione più completa utilizzando la combinazione di approcci enzimatici e meccanici e una fase di purificazione a singolo gradiente più semplice. Questo protocollo produce circa 250-350 isolotti per mouse; e isolotti sono adatti per vari studi ex vivo. Possibili avvertenze di questa procedura sono potenzialmente danneggiate isole a causa di digestione enzimatica e/o incubazione del gradiente prolungata, che possono essere evitati in gran parte con un'attenta giustificazione pubblicitaria del tempo di incubazione.
Introduction
Ci sono due metodi comuni nella letteratura per l'isolamento delle isolotzioni pancreatiche. Uno richiede di eccitare il pancreas e dividerlo in piccoli pezzi usando forbici chirurgiche, e poi digerirlo in una soluzione collagenae1,2,3. Un altro metodo più preciso è quello di utilizzare la rete di dotti presenti nel pancreas per introdurre l'enzima digestivo. I seguenti siti sono stati utilizzati per l'iniezione di enzimi digestivi: la giunzione della bile e del dotto cistico, la cistifellea nel dotto biliare comune, o il dotto biliare comune stesso1,4,5. È noto che le isole non sono distribuite uniformemente nel pancreas; la regione splenica contiene la maggior parte degli isolotti6. Mentre il secondo metodo che utilizza percorsi anatomici per fornire enzimi digestivi consente una perfusione più completa del pancreas, compresa la regione splenica, questa procedura spesso richiede la bloccallatura o la sutura dell'ampulla del Vater tecnicamente impegnativo. In termini di purificazione dell'isolotto, sono stati utilizzati ceppi di densità multipla, così come ceppi cellulari e retrazione magnetica per purificare le isole3,7. L'utilizzo di questi gradienti può richiedere molto tempo e le pendenze Ficoll possono causare danni tossici alle isole8.
Il protocollo attuale si basa sul metodo descritto da Li et al.7, con ulteriori modifiche aggiunte in base all'esperienza di noi stessi e degli altri1,4. I passaggi più critici del nostro protocollo sono il bloccaggio del dotto biliare comune vicino alla fine del fegato, l'iniezione di collagenasi P attraverso l'ampulla di Vater per digerire il tessuto esocrino, e quindi utilizzando un bagno d'acqua accomodante per accelerare la digestione meccanicamente1, 4,7. Successivamente, viene applicata una soluzione "STOP" per inibire un'ulteriore digestione delle isole; HBSS viene utilizzato per lavare via la restante soluzione collagenasi P e STOP. Quando il metodo Ficoll è stato utilizzato per purificare le isole umane, la resa è stata segnalata per essere due volte le isole con maggiore capacità funzionale (ad esempio, secrezione di insulina) rispetto all'uso di gradienti di Percoll9. Tuttavia, gli studi hanno messo in discussione l'uso del gradiente di Ficoll a causa del suo effetto tossico sulle isole1,10. È stato riferito che il gradiente Histopaque fornisce una cinetica di purificazione ottimale per l'isolamento dell'isolotto del mouse, che produce una buona resa di isolotti di alta qualità con passaggi più semplici e costi inferiori1. Nel nostro protocollo, Histopaque-1077 viene utilizzato per purificare le isole da altri tessuti residui8,11. Le isole raccolte possono essere coltivate in supporti RPMI-1640 completi, o utilizzati direttamente nella quantificazione RNA/proteina.
Il nostro protocollo, utilizzando una combinazione di digestione di collageneP e una singola fase di purificazione del gradiente, è più semplice rispetto ad altri protocolli pubblicati. Il nostro metodo non richiede procedure chirurgiche impegnative e ha pochi semplici passi. Ancora più importante, questo protocollo produce costantemente una buona resa di isolotti funzionali di alta qualità (250-350/mouse) come abbiamo riportato12.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Texas A&M University. Gli strumenti chirurgici necessari sono illustrati nella Figura 1 e il diagramma schematico della procedura è illustrato nella Figura 2.
1. Soluzioni
- Preparare Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aggiungendo 100 mL di 10X HBSS (dal magazzino) a 900 mL di acqua distillata per fare 1 L HBSS (1X).
- Preparare la soluzione STOP (deve essere fatta fresca e deve essere utilizzata entro 1 h) aggiungendo 50 mL di 100X siero bovino fetale (FBS) a 450 mL di ghiaccio freddo 1X HBSS; questo rende la soluzione 500 mL STOP. Mantenere la soluzione STOP a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione collagenase P (deve essere fatta fresca entro 1 h dall'uso) aggiungendo 1 mg/mL di collagenae P al freddo ghiaccio 1X HBSS; utilizzare 6 mL/mouse.
- Aggiungere lo 0,05% (w/v) l'albumina del siero bovino (BSA) alla soluzione collagenase P (questo fornisce nutrienti alle isole isolate). Ad esempio, utilizzare 3 mg BSA in 6 mL collagenase P soluzione. Tenere il ghiaccio.
- Calcolare e preparare la quantità di collagenae P necessaria per tutti i topi in un tubo da 50 mL.
- Preparare il mezzo RPMI 1640 completo aggiungendo il 10% di FBS, 100 U/mL penicillina, 100 g/mL streptomicina, integratore cellulare INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM di pydium pyruvate e 0,05 mM 2-mercaptoetanol) a 500 mL di per la cultura e l'incubazione durante la notte.
2. Preparazione
- Riempire tre tubi da 50 mL da 25 mL soluzione inibitoria rem, 70% etanolo o distillato H2O. Queste soluzioni saranno utilizzate per la pulizia di utensili chirurgici prima e durante la procedura.
- Immergere le punte degli strumenti in RNase inibitore soluzione per 30 min prima di iniziare il protocollo; questo elimina qualsiasi potenziale RNase sugli strumenti.
- Pre-taglio cuscinetti assorbenti a 6 in x 6 dimensioni per l'uso durante l'intervento chirurgico.
- Preparare in anticipo 1X della soluzione HBSS e conservare a 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione STOP prima dell'intervento. Conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione collagenase P immediatamente prima dell'intervento chirurgico e conservare sul ghiaccio.
NOTA: Questo deve essere utilizzato entro 2 h dalla preparazione. - Etichettare tubi da 50 mL per la digestione e la purificazione; preparare 2 tubi per ogni topo, uno per la digestione e l'altro per la purificazione dell'isolotto. Assicurarsi che l'ID animale sia su entrambi i tubi.
- Aggiungere 3 mL di soluzione collagene P nel primo tubo da 50 mL. I restanti 3 mL di collagene P saranno iniettati.
- Disegnare i restanti 3 mL di soluzione di collagenasi in una siringa da 3 mL montata con 30 G 1/2 nell'ago. Mettere la siringa sul ghiaccio.
3. Procedura
- Rimuovere tutti gli strumenti dalla soluzione inibitore di RNase, quindi immergerli prima nel tubo con il 70% di etanolo, poi nel tubo contenente distillato H2O, quindi asciugare all'aria su un asciugamano di carta pulita.
- Posizionare il mouse in una camera contenente 0,5 mL di isoflurane fino a quando il topo non è profondamente anatetizzato.
- Togliere il mouse dalla camera e controllare lo stato di anestesia pizzicando un piede con pinze. L'anestesizzazione profonda si basa sull'osservazione che la respirazione diventa costantemente lenta e il mouse non è reattivo al pizzicamento del piede. Dopo aver confermato che il mouse è profondamente anestesizzato, eutanasia il mouse con dislocazione cervicale, e quindi posizionare il mouse sul pad assorbente.
- Posizionare il topo anasetizzato sullo stomaco, applicando pressione al collo e dislocando la colonna vertebrale dal cervello tirando la coda.
- Nastro gli arti del topo in posizione supina al pad assorbente, spruzzare il corpo con 70% di etanolo, e pulire l'eccesso di etanolo in eccesso.
- Utilizzare pinze di vetro di copertura e forbici chirurgiche curve per fare incisioni. In primo luogo fare un'incisione orizzontale sulla pelle della zona addominale (3 cm), tirare la pelle spalancata per esporre la parete addominale. Quindi fare un'incisione verticale (3-4 cm) sul peritoneo addominale per esporre completamente il pancreas nella cavità addominale (Figura 3).
- Spingere i lobi del fegato in modo superiore per esporre il dotto biliare, apparirà come un tubo rosa pallido (Figura 3).
- Spostare con attenzione l'intestino dalla regione lombare/iliaca destra della cavità addominale a destra, esponendo il dotto biliare e l'arteria epatica (Figura 3).
- Bloccare con attenzione il dotto biliare comune utilizzando le micro serrefini Schwartz (Figura 1) il più vicino possibile al fegato.
- Identificare l'ampulla di Vater, che si trova nella papilla duodenale, formata dall'unione del dotto pancreatico e del dotto biliare comune. L'ampulla di Vater appare gonfio quando viene visualizzato al microscopio di dissezione, che è il punto di ingresso al dotto biliare comune (Figura 4).
NOTA: Regolare l'intensità/angolo di luce del microscopio di dissezione può facilitare l'individuazione. - Inserire la siringa con 3 mL della soluzione collagene P nell'ampulla di Vater. Spingere l'ago nel condotto per circa 1/4 della lunghezza del dotto biliare comune (ampulla conduce nel condotto) come mostrato nella Figura 5.
- Una volta che l'ago è nell'ampulla, assicurarsi che l'orientamento dell'ago sia tale che sia parallelo al condotto.
- Stabilizzare l'ago bloccando con micro pinze Adson per evitare che fori il condotto (Figura 5).
- Lentamente e costantemente iniettare 3 mL della soluzione collagenae P dalla siringa nel dotto biliare comune (abbastanza per sentire resistenza) come mostrato Figura 6. L'obiettivo è quello di creare pressione di ridisposizione per costringere il collagenae a entrare nel condotto pancreatico. L'iniezione è considerata riuscita se la regione della testa, del collo, del corpo e della coda del pancreas sono tutte completamente gonfiate.
NOTA: La resa dell'isola sarà bassa se il pancreas non è completamente gonfiato o se l'area della milza non è completamente gonfiata. L'area di splenica contiene il maggior numero di isolotti6. L'inflazione può essere confermata dalla comparsa di spazi aperti tra il tessuto pancreatico che sono pieni di soluzione. - Sezionare con attenzione il pancreas gonfiato e metterlo in un tubo di digestione di 50 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenae P ghiacciata.
- Rimuovere il pancreas con 2 pinze (curvo e Micro Adson; Vedere la Figura 1): (a partire dalla milza, allontanare il pancreas dalla milza e continuare a rimuovere dallo stomaco e lungo il duodenum.
NOTA: non sono necessarie incisioni. - Tritare il pancreas per 3-5 s nel tubo di digestione con 3 mL di soluzione collagenae P ghiacciata utilizzando forbici chirurgiche fini (Figura 7A).
- Rimuovere il pancreas con 2 pinze (curvo e Micro Adson; Vedere la Figura 1): (a partire dalla milza, allontanare il pancreas dalla milza e continuare a rimuovere dallo stomaco e lungo il duodenum.
- Fissare il tubo su un rack in bagnomaria a 37 gradi centigradi e agitare a 100–120 giri/mper per circa 12-13 min.
- Dopo l'incubazione, scuotere delicatamente i tubi a mano per interrompere il tessuto fino a quando la soluzione di digestione del collagenasi P diventa omogenea (Figura 7B). L'omogeneità è confermata da un aspetto simile alla sabbia di particelle fini di pancreas. Di solito sono sufficienti circa 30 s di dolce scossa alle mani. Tenere il tubo fino alla luce per esaminare se il tessuto è ben omogeneizzato; agitare per altri 15 s se necessario.
- Una volta digerito, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio e aggiungere 40 mL di soluzione STOP ghiacciata per terminare la digestione enzimatica.
NOTA: A questo punto i tubi di digestione possono essere lasciati sul ghiaccio fino a 2 h, se si lavora su più topi. - Centrifugare il tubo in una centrifuga oscillante-secchio a 300 x g per 30 s (temperatura di centrifuga è flessibile).
NOTA: Utilizzare una centrifuga oscillante in modo che il pellet di tessuto si formi nella parte inferiore del tubo da 50 mL e non sulla parete del tubo; questo è fondamentale per una migliore resa delle isolotto. - Decant e ripetere la centrifugazione con soluzione STOP altre 2 volte, decantando la soluzione dopo ogni giro. Utilizzare 20 mL di soluzione STOP per ogni lavaggio successivo.
- Prima di ogni rotazione, interrompere il pellet scuotendo delicatamente il pellet di tessuto nel tubo da 50 mL in una soluzione DI 20 mL STOP.
- Sospendere nuovamente il pellet di tessuto con 40 mL di ghiaccio freddo HBSS e centrifugare a 300 x g per 30 s.
- Decant e ripetere la centrifuga zione utilizzando una centrifuga oscillante-secchio con soluzione HBSS altre due volte, decantando la soluzione dopo ogni giro. Utilizzare 20 mL di HBSS per ogni lavaggio.
- Prima di ogni rotazione, interrompere il pellet, per staccarlo dal fondo del tubo agitando delicatamente il tubo contenente soluzione HBSS 20 mL.
- Dopo l'ultima centrifugazione rimuovere tutti hbSS.
- Aggiungere quindi 5 mL di gradiente di densità di temperatura ambiente al tubo da 50 mL contenente il pellet. Vortice brevemente a bassa velocità fino a omogeneizzato.
- Aggiungere altri 5 mL del gradiente di densità di temperatura ambiente al tubo da 50 mL. Non vortice/mix.
NOTA: È fondamentale rimanere fermi e fermi in modo da consentire una migliore forma del gradiente senza interruzioni. - Pipetta 10 mL di temperatura ambiente HBSS tampone nel tubo (contenente il gradiente di densità), gocciolamento per goccia delicatamente e lentamente per consentire la formazione di un gradiente. Utilizzare una pistola pipetta con una pipetta da 10 mL per aggiungere il dropwise HBSS.
- Utilizzando una centrifuga a oscillazione, i tubi di spin a 1700 x g per 15 min. Assicurarsi di modificare la velocità di entrambe le accelerazioni / decelerazioni per l'impostazione più bassa (Figura 7C).
- Dopo la rotazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare il gradiente. Utilizzando un cannone pipetta pre-bagnato con HBSS freddo (pipette HBSS su e giù), pipetta fuori lo strato di isolotti (5-10 mL) formato tra il gradiente di densità e HBSS nel nuovo tubo di raccolta di isole 50 mL.
NOTA: È utile bagnare la pipetta con HBSS freddo prima di pipettare le isole per evitare che le isole si attacchino alle pareti interne della pipetta.- Nel caso in cui la separazione sia incompleta, le isole sarebbero visibili nel livello del gradiente di densità, pipette fuori l'intero 10 mL del gradiente di densità (strato inferiore) insieme allo strato di isolotto formato sull'interfaccia (solo per lasciare circa 8-10 mL dello strato superiore HBSS dietro).
NOTA: la raccolta sia dello strato di isolotto che dello strato di gradiente di densità (strato inferiore) può comportare la raccolta di detriti che possono allungare il tempo di raccolta dell'isolotto, ma non verranno modificati altri passaggi. La raccolta di entrambi questi strati non è necessaria quando lo strato di isolotto è ben formato.
- Nel caso in cui la separazione sia incompleta, le isole sarebbero visibili nel livello del gradiente di densità, pipette fuori l'intero 10 mL del gradiente di densità (strato inferiore) insieme allo strato di isolotto formato sull'interfaccia (solo per lasciare circa 8-10 mL dello strato superiore HBSS dietro).
- Aggiungere 20 mL di HBSS ghiacciato al nuovo tubo da 50 mL contenente le isole, quindi centrifugare a 350 x g per 3 min in una centrifuga oscillante-secchio.
- Dopo lo spin, pipetta con attenzione (non decantare) fuori il supernatante (lasciare 3 mL in basso) senza disturbare il pellet contenente le isole nella parte inferiore. Scartare il super-attardato.
- Ripetere il lavaggio e la centrifuga almeno 3 volte. Aggiungere ogni volta 20 mL di HBSS e assicurarsi di sospendere il pellet prima di ogni rotazione.
- Riscaldare la bottiglia multimediale completa RPMI-1640 in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi prima dell'uso. Dopo l'ultima centrifugazione, rimuovere tutti gli HBSS e aggiungere 4 mL di supporti RPMI-1640 completi precedentemente preparati (contenenti FBS, integratore cellulare INS-1 e penicillina/streptomicina) al pellet.
- Slogare il pellet ruotando delicatamente il tubo e versare immediatamente il supporto RPMI-1640 in una parabola Petri da 100 mm. Aggiungere altri 5 mL di supporto RPMI-1640 al tubo e ruotarlo delicatamente per lavare le isole rimanenti, quindi versare anche il supporto nella stessa parabola Petri.
- Al microscopio di dissezione, raccogliere le isole sane della piastra Petri utilizzando una pipetta da 20 luna e metterle in una nuova parabola Petri contenente 10 mL di supporti RPMI 1640 completi. Se osservati al microscopio di dissezione, le isole dovrebbero apparire di colore sferico/oblungo e marrone dorato con una superficie liscia rispetto al tessuto esocrino relativamente trasparente e squallido.
NOTA: L'ingrandimento del microscopio di dissezione è solitamente impostato a 12,5–16x. La resa dell'istole varia a seconda di vari fattori, tra cui la tensione, l'età e il sesso del topo. Questo protocollo produce in genere 250-350 isole sane da C57BL/6J mouse sano di età compresa tra 4 e 10 mesi.
- Al microscopio di dissezione, raccogliere le isole sane della piastra Petri utilizzando una pipetta da 20 luna e metterle in una nuova parabola Petri contenente 10 mL di supporti RPMI 1640 completi. Se osservati al microscopio di dissezione, le isole dovrebbero apparire di colore sferico/oblungo e marrone dorato con una superficie liscia rispetto al tessuto esocrino relativamente trasparente e squallido.
- Incubare le isole in un'incubatrice sterile a 37 gradi centigradi con 5% di infusione di CO2 e 95% di aria umidificata durante la notte per gli esperimenti il giorno successivo, o congelare le isole per l'analisi desiderata in un secondo momento.
- Una volta che le isole sono congelate, non possono essere utilizzate per saggi di secrezione, solo la quantificazione dell'RNA o delle proteine. Per raccogliere le celle da congelare, metterle nel buffer HBSS, raccogliere tutte le isolotti in 200-500 l di buffer, trasferire a 1,5 mL tubo, centrifuga350 x g per 1–2 min, rimuovere il supernatante lasciando non più di 30-40 soluzione L, mettere in -20 c per l'immagazzinamento breve breve ( diversi giorni) o -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
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Representative Results
Il corretto completamento di questa procedura richiede una certa comprensione dell'anatomia del topo nella cavità addominale. Ciò consente una corretta identificazione dell'ampulla di Vater e il bloccaggio del dotto biliare comune. L'intera procedura normalmente richiede 1–2 h. È più efficiente isolare le isole da 4-6 topi contemporaneamente, quindi diversi campioni possono essere centrifugati insieme. Il tempo per la raccolta delle isole varia a seconda del numero di isolotti e dell'efficienza della digestione; potrebbe essere necessario circa un'ora per prelevare 250-350 isolotti da 1 mouse.
In questo articolo sono incluse una serie di immagini molto realistiche: la figura 3 mostra la cavità addominale del topo, esponendo il dotto biliare comune e l'arteria epatica. La figura 4 mostra l'intera lunghezza del dotto biliare comune, che sembra essere un colore più chiaro, così come l'ampulla di Vater, che è più grande e più brillante vicino alla giunzione (dove verrà inserito l'ago) tra il pancreas e duodenum. Un morsetto è posto al dotto biliare comune e fascio di arteria epatica vicino al fegato per bloccare il flusso di collagenasi P nel fegato. La mancata bloccazione del dotto biliare correttamente o abbastanza stretto comporterà perdite e perfusione incompleta del pancreas. Figura 5 mostra l'ago inserito all'ampulla di Vater nel dotto biliare comune. Una volta che l'ago è nel condotto comune, pinze vengono utilizzate per stabilizzare l'ago per evitare che fori il condotto durante l'iniezione. Una volta che inizia l'iniezione, il pancreas inizierà a gonfiarsi dall'estremità prossima alla fine dissotterrale; la regione splenica dovrebbe iniziare a gonfiarsi dopo circa 1 mL di iniezione di collagenasi. Il riflusso nell'intestino può portare a un'inflazione indesiderabile del duodenum; questo può essere rifatto regolando il posizionamento dell'ago (tirarlo fuori un po ', o reinserire leggermente più in profondità) e stabilizzando correttamente l'ago utilizzando pinze. L'iniezione è considerata un successo se tutte le regioni del pancreas sono gonfiate (duodenal, gastrico, e lobi splenici) come mostrato Figura 6. La rimozione del pancreas dovrebbe iniziare dalla regione splenica. Il pancreas gonfiato viene tagliato a pezzi utilizzando forbici chirurgiche fini (Figura 7A). Dopo la digestione e la miscelazione di 12-13 min a mano, la sospensione contenente tessuti appare più omogenea (Figura 7B). Successivamente, le isole vengono purificate dal gradiente di densità dopo la centrifugazione. La figura 7C mostra che si forma uno strato di sospensione dell'isolotto tra HBSS e il gradiente di densità dopo la centrifugazione. Isolotti buoni/sani appaiono a forma di rotondo liscio; le isole danneggiate mostrano bordi ruvidi, mentre il tessuto esocrino non digerito mostra una forma irregolare e appare più traslucido come illustrato nella Figura 8.
Figura 1: Utensili chirurgici.
Vengono mostrate forbici chirurgiche curve, pinze di vetro di copertura, pinze micro Adson, pinze curve, piccole forbici chirurgiche e micro serrefini Schwartz (morsetto microvascolare). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica del protocollo.
I passaggi più critici di questa procedura sono il bloccaggio del dotto biliare comune vicino al fegato, e l'iniezione di collagenasi P attraverso l'ampulla di Vater nel dotto biliare comune per digerire il pancreas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizione del dotto biliare comune.
Le pinze sostengono il dotto biliare comune e il fascio di arteria epatica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione del dotto biliare comune e dell'ampulla di Vater.
Un morsetto è posto sul dotto biliare comune e fascio di arteria epatica vicino al fegato. Le frecce nere puntano all'ampulla di Vater dove verrà inserito l'ago. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cannulazione del dotto biliare comune.
Dopo una corretta cannulazione del dotto biliare comune, l'ampulla di Vater viene iniettato con trypan blu (solo a scopo dimostrativo) per enfatizzare meglio il posizionamento del dotto biliare comune. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: pancreas completamente gonfiato.
La linea tratteggiata mostra il confine del pancreas completamente perfuso. Le pinze resistono alla regione della mungente dove le isole sono più concentrate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Passaggi di isolamento e purificazione dell'isolazione.
(A) Pezzi di tessuto tagliati meccanicamente di pancreas prima della digestione. (B) Pancreas digerito: sospensione omogenea dei tessuti del pancreas perfusa di collagenasi dopo 13 min di incubazione in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi centigradi, seguito da 30 s di miscelazione manuale. (C) Lo strato di sospensione dell'isola si forma tra l'HBSS e il gradiente di densità dopo la centrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini dell'isolotto rappresentativo di Fluorescence Cell-Imager.
(A) Si vedono buone isole, isole cattive e tessuto esocrino. (B) Viene visualizzato un gruppo di buone isole. (C) Pannello mostra tessuto esocracolo non digerito attaccato a una buona isolotto. Isolotti buoni/sani mostrano bordi rotondi uniformi, indicati dalla lettera rossa "G"; isolotti danneggiati mostrano la forma irregolare e i bordi irregolari e sono indicati dalla lettera blu "B". I tessuti esocrini non digeriti appaiono traslucidi, spesso attaccati alle isole, e sono indicati dalla lettera verde "E". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo include la perfusione di collagenae e la digestione, seguita dalla purificazione delle isole. I passaggi più critici di questo protocollo sono l'iniezione efficace e la perfusione completa del pancreas1,4,7. Il metodo di consegna di questo protocollo permette all'enzima di attraversare le vie anatomiche per digerire meglio il tessuto esocrino che circonda le isole1. Inoltre, questa tecnica è adatta per la digestione completa della regione splenica, che ha la più alta concentrazione di isolotti4,6. Questo protocollo, con tempi di digestione ben controllati e passaggi di purificazione attentamente eseguiti, può produrre 250-350 isole sane. Le isole isolate da questo protocollo sono state utilizzate con successo per studiare la secrezione di insulina stimolata dal glucosio ex vivo12. Dalla nostra esperienza, la secrezione di insulina è aumentata di 4 volte rispetto alla stimolazione elevata del glucosio (22,2 mM) rispetto al basale (3,3 mM) dopo un'incubazione notturna in un RPMI-1640 completo contenente glucosio da 5,5 mM. La sopravvivenza/funzionalità delle isole in incubazione prolungata (2-7 giorni) non è stata testata.
Anche se il protocollo presentato include note dettagliate e dimostrazioni visive, sono necessarie alcune regolazioni per ottenere le condizioni ottimali per l'alta resa e le isole di alta qualità. Due problemi più comuni che possono ostacolare il successo sono la cannulazione impropria dell'ampulla di Vater o la puntura accidentale del condotto. Per evitare questi, si dovrebbe garantire che il sito di penetrazione è esattamente dove l'ampulla incontra con il duodenum. Quest'area è più grande e relativamente facile da identificare, il che consente più forature senza compromettere seriamente l'integrità del condotto. Una volta all'interno dell'ampulla, l'orientamento dell'ago deve essere parallelo al condotto piuttosto che angolato. A questo punto, spingere l'ago nel condotto per circa 1/4 della lunghezza del condotto, quindi stabilizzare l'ago con pinze mentre lentamente iniettando collagenase; questo aiuterà a evitare che l'ago si pieghi sotto la pressione e fori accidentalmente il condotto. Altri problemi possono includere over- o sotto-digestione del pancreas; ciò può richiedere modifiche in base all'età, al ceppo e al sesso dei topi. Possono verificarsi isolotti danneggiati dovuti a un'eccessiva digestione (ezimatica e meccanica) o a un'esposizione prolungata al gradiente di densità. Questi sono problemi comuni che esistono per metodi simili; alcuni piccoli aggiustamenti dovrebbero produrre miglioramenti significativi. Un suggerimento quando si tratta di questi tipi di problemi è quello di scegliere una variabile da modificare alla volta (ad esempio, il tempo di digestione o concentrazione di collagene).
Il vantaggio principale di questo protocollo è la via della somministrazione di enzimi: avere collagene P per digerire direttamente il pancreas esocranico utilizzando un percorso anatomico più facile che aumenta l'efficienza di digestione1. Questo metodo è stato segnalato per produrre un 50% di aumento del numero di isole rispetto al metodo di eccitare il pancreas, tagliarlo, ed esponerlo al collagenase13. Questo protocollo richiede solo l'uso di un gradiente a densità singola, rendendolo significativamente meno laborioso e più conveniente, rispetto ad altri metodi che richiedono la preparazione di più gradienti a densità diverse, o il complesso Metodo Percoll che richiede tempo aggiuntivo1,8,11. Il metodo gradiente impiegato in questo protocollo è stato utilizzato anche nell'isolamento dell'isolotto da altri4 . Questo metodo di isolamento delle isole fornisce allo scienziato uno strumento migliorato per studiare le isole pancreatiche. Le applicazioni future di questo protocollo includono alterazione per migliorare l'efficacia quando si tratta di topi diabetici. Come do et al. hanno osservato, topi diabetici, a seconda dei livelli di glucosio, producono meno isole (meno di 100), con dimensioni ridotte e l'aspetto delle isole4. Abbiamo osservato questo fenomeno e crediamo che le isole diabetiche siano più vulnerabili alla digestione ezimatica e meccanica che richiedono cure speciali. Inoltre, la densità dell'isolotto può alterare il suo aspetto nel gradiente di densità, un'ulteriore ottimizzazione del protocollo contribuirebbe ad aumentare la resa delle isole diabetiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo estremamente grati alla signora Jennifer Munguia per la sua illustrazione artistica del diagramma schematico. Ringraziamo il signor Michael R. Honig alla Community Public Radio Station KPFT di Houston per la sua assistenza editoriale. Questo studio è stato supportato dall'American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS) e NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1010840 (YS) e R01 DK095118 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
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- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
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