Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Summary

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Abstract

Pancreas eilandjes, ook wel de eilandjes van Langerhans, zijn een cluster van endocriene cellen die hormonen produceert voor glucoseregulatie en andere belangrijke biologische functies. De eilandjes bestaan hoofdzakelijk uit vijf soorten hormonen-afscheidende cellen: α-cellen scheiden glucagon, β-cellen scheiden insuline, δ cellen scheiden Somatostatine, ε cellen afscheiden ghreline, en PP cellen scheiden alvleesklier polypeptide. 60 tot 80% van de cellen in de eilandjes zijn β-cellen, die de belangrijkste celpopulatie zijn om de insuline secretie te bestuderen. Pancreatic eilandjes zijn een cruciaal modelsysteem om ex vivo insuline secretie te bestuderen. Het verwerven van hoge kwaliteit eilandjes is van groot belang voor diabetesonderzoek. De meeste eilandje isolatie procedures vereisen technisch moeilijk te benaderen site van Collagenase injectie, harde en complexe spijsvertering procedures, en meerdere dichtheid gradiënt zuivering stappen. Dit papier is voorzien van een eenvoudige, hoge opbrengst muis eiland isolatiemethode met gedetailleerde beschrijvingen en realistische demonstraties, met de volgende specifieke stappen: 1) injectie van Collagenase P bij de Papil van Vater, een klein gebied dat lid wordt van de alvleesklier en de Galgang, 2) enzymatische vertering en mechanische scheiding van de exocriene alvleesklier, en 3) een enkele gradiënt zuiveringsstap. De voordelen van deze methode zijn de injectie van spijsverterings enzym met behulp van de toegankelijker Papil van Vater, completere spijsvertering met behulp van combinatie van enzymatische en mechanische benaderingen, en een eenvoudigere enkele gradiënt zuivering stap. Dit protocol produceert ongeveer 250 — 350 eilandjes per muis; en eilandjes zijn geschikt voor verschillende ex vivo-studies. Mogelijke waarschuwingen van deze procedure zijn potentieel beschadigde eilandjes als gevolg van enzymatische spijsvertering en/of langdurige gradiënt incubatie, die allemaal grotendeels kunnen worden vermeden door zorgvuldige advertentie-rechtvaardiging van incubatietijd.

Introduction

Er zijn twee veelgebruikte methoden in de literatuur voor de isolatie van de eiland alvleesklier. Men vereist het exciseren van de alvleesklier en het diceren in kleine stukjes met behulp van chirurgische schaar, en vervolgens verteerd in een Collagenase oplossing^1,2,3. Een andere preciezere methode is het gebruik van het netwerk van kanalen aanwezig in de alvleesklier te introduceren spijsverterings enzym. De volgende sites zijn gebruikt voor de digestieve enzym injectie: de kruising van de gal en Cystic duct, de galblaas in de Galgang, of de gemeenschappelijke gal duct zelf^1,4,5. Het is bekend dat eilandjes niet gelijkmatig worden verdeeld in de alvleesklier; de regio milt bevat de meeste eilandjes⁶. Terwijl de tweede methode met behulp van anatomische routes voor het leveren van spijsverteringsenzymen zorgt voor een vollediger perfusie van de alvleesklier, met inbegrip van de milt regio, deze procedure vereist vaak klemmen of het versterken van de Papil van Vater die technisch Uitdagende. In termen van de zuivering van het eilandje, zijn meerdere dichtheidsgradiënten, evenals celstrainers en magnetische terugtrekking gebruikt om de eilandjes op^3,7te zuiveren. Het gebruik van deze gradiënten kan tijdrovend zijn en de Ficoll gradiënten kunnen leiden tot toxische schade aan eilandjes⁸.

Het huidige protocol is gebaseerd op de methode die wordt beschreven door Li et al.⁷, met aanvullende wijzigingen toegevoegd op basis van de ervaring van onszelf en anderen^1,4. De meest kritische stappen van ons protocol zijn het klemmen van de galwegen in de buurt van het lever uiteinde, het injecteren van Collagenase P via de Papil van Vater om het exocriene weefsel te verteren en vervolgens een schud waterbad te gebruiken om de spijsvertering mechanisch te versnellen^{1, 4,7}. Vervolgens wordt een ' STOP'-oplossing toegepast om de verdere vertering van de eilandjes te remmen; HBSS wordt gebruikt om de resterende Collagenase P-en STOP oplossing af te spoelen. Wanneer de Ficoll-methode werd gebruikt om menselijke eilandjes te zuiveren, werd de opbrengst gerapporteerd als tweemaal de eilandjes met een grotere functionele capaciteit (bijv. insuline secretie) in vergelijking met het gebruik van Percoll gradiënten⁹. Studies hebben echter het gebruik van Ficoll gradiënt betwist vanwege het toxische effect op de eilandjes^1,10. Er is gemeld dat de histopaque gradiënt optimale zuiverings kinetiek biedt voor het isoleren van muizen eilandjes, wat een goede opbrengst oplevert van hoogwaardige eilandjes met eenvoudigere stappen en lagere kosten¹. In ons protocol wordt Histopaque-1077 gebruikt om eilandjes van ander rest weefsel^8,11te zuiveren. De geoogste eilandjes kunnen worden gekweekt in complete RPMI-1640-media, of rechtstreeks worden gebruikt in RNA/eiwit quantitatie.

Ons protocol, met behulp van een combinatie van Collagenase P spijsvertering en een enkele gradiënt zuivering stap, is eenvoudiger dan andere gepubliceerde protocollen. Onze methode vereist geen veeleisende chirurgische procedures en heeft slechts een paar eenvoudige stappen. Wat nog belangrijker is, dit protocol produceert consequent een goede opbrengst van hoogwaardige functionele eilandjes (250-350/muis) zoals we gemeld¹².

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité (ACUC) van Texas A & M University. De chirurgische gereedschappen moeten worden weergegeven in Figuur 1 en het schematische schema van de procedure wordt weergegeven in Figuur 2.

1. oplossingen

1. Bereid de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS) voor door 100 mL 10X HBSS (uit voorraad) toe te voegen aan 900 mL gedistilleerd water om 1 L HBSS (1X) te maken.
2. Bereid STOP oplossing (moet vers worden gemaakt en moet worden gebruikt binnen 1 h) door toevoeging van 50 mL 100X foetaal runderserum (FBS) aan 450 mL ijskoud 1X HBSS; Dit maakt 500 mL STOP oplossing. Houd de STOP oplossing bij 4 °C.
3. Bereid Collagenase P-oplossing (moet vers worden gemaakt binnen 1 uur na gebruik) door toevoeging van 1 mg/mL Collagenase P aan ijskoud 1X HBSS; gebruik 6 mL/muis.
   1. Voeg 0,05% (w/v) bovine serumalbumine (BSA) toe aan Collagenase P-oplossing (dit levert voedingsstoffen aan de geïsoleerde eilandjes). Gebruik bijvoorbeeld 3 mg BSA in 6 mL Collagenase P-oplossing. Blijf op ijs.
   2. Bereken en bereid de hoeveelheid Collagenase P die nodig is voor alle muizen in 1 50 mL Tube.
4. Bereid complete RPMI 1640 medium voor door toevoeging van 10% FBS, 100 U/mL penicillaire, 100 μg/mL streptomycine, INS-1 celsupplement (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvate en 0,05 mM 2-mercaptoethanol) tot 500 mL RPMI 1640 media met 5,5 mM glucose die gebruikt voor de nachtelijke cultuur en incubatie.

2. voorbereiding

1. Vul 3 50 mL tubes van 25 mL RNase remmende oplossing, 70% ethanol of gedistilleerd H₂O. Deze oplossingen zullen worden gebruikt voor het reinigen van chirurgische hulpmiddelen voorafgaand en tijdens de procedure.
2. Week de tips van de gereedschappen in RNase remmende oplossing gedurende 30 minuten voordat het protocol wordt gestart; Dit elimineert potentiële RNase op de tools.
3. Voorgesneden absorberende pads tot 6 in x 6 in grootte voor gebruik tijdens chirurgie.
4. Bereid 1X HBSS-oplossing van tevoren en bewaar deze bij 4 °C. Bereid STOP oplossing voorafgaand aan de operatie. Bewaren bij 4 °C.
5. Bereid Collagenase P-oplossing onmiddellijk voorafgaand aan de operatie en bewaar op ijs.
   Opmerking: dit moet binnen 2 uur na de voorbereiding worden gebruikt.
6. Etiket 50 mL buizen voor spijsvertering en zuivering; bereid 2 buizen voor elke muis, een voor de spijsvertering en de andere voor de zuivering van het eilandje. Zorg ervoor dat het dier ID op beide buisjes staat.
7. Voeg 3 mL Collagenase P-oplossing toe aan de eerste tube van 50 mL. De resterende 3 mL Collagenase P wordt geïnjecteerd.
8. Teken de resterende 3 mL Collagenase-oplossing in een injectiespuit van 3 mL die is gemonteerd met 30 G 1/2 in de naald. Plaats de spuit op ijs.

3. procedure

1. Verwijder alle gereedschappen van RNase remmende oplossing, DIP ze eerst in de buis met 70% ethanol, vervolgens in de buis met gedistilleerd H₂O, dan lucht drogen op schone papieren handdoek.
2. Plaats de muis in een kamer met 0,5 mL Isofluraan totdat de muis diep is verdoofd.
3. Verwijder de muis uit de kamer en controleer de staat van de anesthesie door het knijpen van een voet pad met pincet. Diepe anesthetisering is gebaseerd op de waarneming dat ademhaling gestaag langzaam wordt en de muis is niet reactief om te voet knijpen. Na te hebben bevestigd dat de muis diep verdoofd is, euthaniseer je de muis met cervicale dislocatie en plaats je de muis op het absorberende kussentje.
   1. Plaats de verdoofde muis op zijn buik, druk op de nek en ontlucht de wervelkolom van de hersenen door de staart te trekken.
4. Plak de ledematen van de muis in liggende positie op het absorberende pad, spuit het lichaam met 70% ethanol en veeg overtollig overtollige ethanol af.
5. Gebruik afdekglas Tang en gebogen chirurgische schaar om incisies te maken. Maak eerst een horizontale incisie op de huid van de buikstreek (~ 3 cm), trek de huid wijd open om de buikwand bloot te leggen. Maak vervolgens een verticale incisie (~ 3 – 4cm) op het abdominale peritoneum om de alvleesklier in de buikholte volledig bloot te leggen (Figuur 3).
6. Duw de lobben van de lever bovenzijde om de galkanaal bloot, het zal verschijnen als een bleke roze buis (Figuur 3).
7. Beweeg de darmen voorzichtig van de rechter lumbale/iliacale regio van de buikholte naar rechts, waardoor het galkanaal en de lever slagader worden blootgesteld (Figuur 3).
8. Klem de gemeenschappelijke galkanaal voorzichtig met de Schwartz micro-serverfomen (Figuur 1) zo dicht mogelijk bij de lever.
9. Identificeer de Papil van Vater, die is gelegen op de duodenale papilla, gevormd door de Unie van de alvleesklier en de galkanaal. De Papil van Vater lijkt gezwollen wanneer bekeken onder een dissectie Microscoop die het ingangspunt van de gemeenschappelijke galkanaal (Figuur 4).
   Opmerking: het aanpassen van de intensiteit/hoek van het licht van de dissectie Microscoop kan het gemakkelijker maken om te lokaliseren.
10. Plaats de spuit met 3 ml Collagenase P-oplossing in de Papil van Vater. Duw de naald in het kanaal voor ongeveer 1/4 van de lengte van de gemeenschappelijke galkanaal (ampulla leidt naar het kanaal) zoals weergegeven in Figuur 5.
11. Zodra de naald in de ampulla is, zorg ervoor dat de oriëntatie van de naald zodanig is dat deze parallel met het kanaal.
12. Stabiliseer de naald door te klemmen met de micro Adson-tang om te voorkomen dat het kanaal wordt doorgeprikken (Figuur 5).
13. Injecteer langzaam en gestaag 3 mL Collagenase P-oplossing van de spuit in de Galgang (genoeg om weerstand te voelen) zoals afgebeeld in Figuur 6. Het doel is om terugstroom druk te creëren om de collagenase te dwingen om de alvleesklier buis te betreden. Injectie wordt beschouwd als succesvol als het hoofd, nek, lichaam en staart gebied van de alvleesklier volledig zijn opgeblazen.
    Opmerking: de opbrengst van het eilandje is laag als de alvleesklier niet volledig is opgeblazen of als het milt gebied niet volledig is opgeblazen. Het splenisch gebied bevat het hoogste aantal eilandjes⁶. De inflatie kan worden bevestigd door het verschijnen van open ruimten tussen pancreas weefsel die gevuld zijn met oplossing.
14. Zorgvuldig ontleden de opgeblazen alvleesklier en plaats deze in een 50 mL digestie buis met 3 mL ijskoude Collagenase P-oplossing.
    1. Verwijder de alvleesklier met 2 Tang (gebogen en micro-Adson; Zie Figuur 1): (beginnend bij de milt, trek de alvleesklier weg van de milt en verder te verwijderen uit de maag en langs de twaalfvingerige darm.
       Opmerking: geen incisies nodig.
    2. Snijd de alvleesklier voor 3 – 5 s in de vergistings buis met 3 mL ijskoude Collagenase P-oplossing met behulp van een fijne chirurgische schaar (figuur 7A).
15. Bevestig de buis aan een rek in 37 °C waterbad en schud bij 100 – 120 rpm gedurende ongeveer 12 – 13 minuten.
16. Schud de buisjes na incubatie voorzichtig met de hand om het weefsel te verstoren tot de Collagenase P-digestie oplossing homogeen wordt (figuur 7b). Homogeniteit wordt bevestigd door een zandachtige verschijning van fijne deeltjes van de alvleesklier. Over 30 s van zachte hand schudden is meestal genoeg. Houd de buis aan het licht om te onderzoeken of het weefsel goed is gehomogeniseerd; Schud voor een ander ~ 15 s indien nodig.
17. Eenmaal verteerd, plaats de buizen onmiddellijk op ijs en voeg 40 mL ijskoude STOP oplossing toe om de enzymatische spijsvertering te beëindigen.
    Let op: op dit punt kunnen vergistings buizen op ijs worden gelaten tot 2 uur, als u op meerdere muizen werkt.
18. Centrifugeer de buis in een swingende emmer centrifuge bij 300 x g gedurende 30 sec. (temperatuur van centrifuge is flexibel).
    Opmerking: gebruik een swingende emmer centrifuge zodat de weefsel pellet wordt gevormd aan de onderkant van de 50 mL buis en niet op de wand van de buis; Dit is van cruciaal belang voor een betere eiland opbrengst.
19. Decanteren en herhalen van de centrifugeren met STOP oplossing 2 keer, de oplossing na elke spin ontstoppen. Gebruik voor elke volgende wasbeurt 20 mL STOP oplossing.
    1. Voor elke spin, verstoren de pellet door zachtjes schudden van de weefsel pellet in de 50 mL buis in 20 mL STOP oplossing.
20. Resuspendeer de weefsel pellet met 40 mL ijskoude HBSS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 30 sec.
21. Decanteren en herhalen van de centrifugeren met behulp van een swingende emmer centrifuge met HBSS-oplossing nog twee keer, de oplossing na elke spin destoppen. Gebruik voor elke wasbeurt 20 mL HBSS.
    1. Voor elke spin, verstoren de pellet, om het los te maken van de bodem van de buis door zachtjes schudden van de buis met 20 mL HBSS oplossing.
22. Verwijder na de laatste centrifugeren alle HBSS.
23. Voeg vervolgens 5 mL ruimte temperatuurdichtheids gradiënt toe aan de buis van 50 mL die de pellet bevat. Vortex kort bij lage snelheid tot gehomogeniseerd.
24. Voeg nog eens 5 mL van de ruimte temperatuurdichtheids gradiënt toe aan de buis van 50 mL. Niet Vortex/mix.
    Opmerking: het is van cruciaal belang om stabiel te blijven en nog steeds om een betere gradiënt te vormen zonder onderbreking.
25. Pipetteer 10 mL kamertemperatuur HBSS buffer in de buis (met de dichtheidsgradiënt), drop-by-drop zachtjes en langzaam om een verloop te vormen. Gebruik een pipet pistool met een pipet van 10 mL om HBSS dropwise toe te voegen.
26. Gebruik een swingende emmer centrifuge, spin tubes bij 1700 x g gedurende 15 min. Zorg ervoor dat u de snelheid van zowel versnelling/vertraging naar de laagste instelling wijzigt om het verloop te behouden (afbeelding 7C).
27. Na de spin, voorzichtig verwijderen van de buizen zonder verstoring van de helling. Gebruik een pipet dat is voorbevochtig met koude HBSS (HBSS op en neer Pipetteer) en Pipetteer de laag van de eilandjes (5 – 10 mL) tussen de dichtheidsgradiënt en de HBSS in de nieuwe 50 mL-opvang buis van het eilandje.
    Opmerking: het is handig om de pipet met koude HBSS te bevochtigen voordat u de eilandjes pipetteren om te voorkomen dat de eilandjes aan de binnenwanden van de pipet kleven.
    1. In het geval dat de scheiding onvolledig is, zouden eilandjes zichtbaar zijn in de laag met dichtheidsgradiënt, de hele 10 mL van de dichtheidsgradiënt (onderste laag), samen met de eilandlaag die op de interface is gevormd (alleen om ongeveer 8 – 10 mL van de HBSS-toplaag achter te laten).
       Let op: het verzamelen van zowel de Islet-laag als de laag met dichtheidsgradiënt (onderste laag) kan resulteren in het verzamelen van puin dat de orderverzameltijd van het eilandje kan verlengen, maar er zullen geen andere stappen worden gewijzigd. Het verzamelen van beide lagen is niet nodig wanneer de laag van Islet goed is gevormd.
28. Voeg 20 mL ijskoude HBSS toe aan de nieuwe 50 mL tube met eilandjes en centrifugeer vervolgens bij 350 x g gedurende 3 minuten in een swingende emmer centrifuge.
29. Na de spin, voorzichtig Pipet (niet decanteren) uit de supernatant (laat ~ 3 ml aan de onderkant) zonder verstoring van de pellet met de eilandjes aan de onderkant. Gooi het supernatant weg.
30. Herhaal wassen en centrifugeren minstens 3 keer. Voeg elke keer 20 mL HBSS toe en zorg ervoor dat u de pellet voor elke spin onderbreekt.
31. Verwarm de RPMI-1640 complete media fles in een waterbad van 37 °C vóór gebruik. Verwijder na de laatste centrifugeren alle HBSS en voeg 4 mL eerder bereide complete RPMI-1640-media (met FBS, INS-1-celsupplement en penicillaire/streptomycine) toe aan de pellet.
32. Ontdoe de pellet door zachtjes over de buis te zwengelen en giet de RPMI-1640-media onmiddellijk in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg nog eens 5 mL RPMI-1640 media toe aan de tube en zwenk het zachtjes om eventuele overgebleven eilandjes af te spoelen en giet de media vervolgens in dezelfde Petri schaal.
    1. Onder een dissectie Microscoop u gezonde eilandjes uit de Petri schaal plukken met behulp van een 20 μL Pipet, en ze in een nieuwe Petri schaaltje met 10 mL complete RPMI 1640 media plaatsen. Wanneer bekeken onder een dissectie Microscoop, eilandjes moeten sferisch/langwerpige en goudbruine kleur met een glad oppervlak in vergelijking met de relatief transparante, onregelmatige exocriene weefsel.
       Opmerking: vergroting van de dissectie Microscoop wordt meestal ingesteld op 12,5 – 16x. De opbrengst van het eilandje varieert afhankelijk van verschillende factoren, waaronder stam, leeftijd en geslacht van de muis. Dit protocol levert meestal 250 – 350 gezonde eilandjes van gezonde C57BL/6J muis leeftijd 4 – 10 maanden oud.
33. Incuberen de eilandjes in een steriele incubator bij 37 ° c met 5% CO₂ infusie en 95% bevochtiging lucht 's nachts voor experimenten de volgende dag, of bevriezen de eilandjes voor de gewenste analyse op een later tijdstip.
    1. Zodra eilandjes zijn bevroren, ze kunnen niet worden gebruikt voor secretie assays, alleen RNA of eiwit kwantificering. Om cellen te verzamelen om te bevriezen, plaats ze in HBSS buffer, verzamel alle eilandjes in 200 – 500 μL buffer, transfer naar 1,5 mL Tube, centrifuge 350 x g gedurende 1 – 2 min, verwijder de supernatant die niet meer dan 30 – 40 μl oplossing, plaats in-20 °c voor korte termijn opslag ( enkele dagen) of-80 °C voor lange termijn opslag.

Representative Results

Juiste voltooiing van deze procedure vereist enig begrip van muis anatomie in de buikholte. Dit zorgt voor een juiste identificatie van de Papil van Vater en klemmen van de Galgang. De gehele procedure duurt normaal 1 – 2 uur. Het is efficiënter om eilandjes van 4 – 6 muizen tegelijkertijd te isoleren, zodat verschillende monsters samen kunnen worden gecentrifugeerd. De tijd voor eilandje-plukken varieert, afhankelijk van het aantal eilandjes en de efficiëntie van de spijsvertering; het kan ongeveer een uur duren om 250 – 350 eilandjes van 1 muis te kiezen.

In dit document zijn een aantal zeer realistische beelden opgenomen: Figuur 3 toont de buikholte van de muis, waardoor het galkanaal en de Leverslagader worden blootgesteld. Figuur 4 toont de gehele lengte van de gemeenschappelijke galwegen, die een lichtere kleur lijkt te zijn, evenals de Papil van Vater, die groter en glanzender is in de buurt van het kruispunt (waar de naald zal worden ingebracht) tussen de alvleesklier en duodenum. Een klem wordt geplaatst op de gemeenschappelijke galkanaal en hepatische slagader bundel dicht bij de lever te blokkeren van de stroom van Collagenase P in de lever. Het niet goed of strak genoeg klemmen van de galwegen zal resulteren in lekkage en onvolledige perfusie van de alvleesklier. Figuur 5 toont de naald die bij de Papil van Vater in de Galgang is ingebracht. Zodra de naald in de gemeenschappelijke buis, Tang worden gebruikt om de naald te stabiliseren om te voorkomen dat het prikken van het kanaal tijdens het injecteren. Zodra de injectie begint, zal de alvleesklier beginnen te zwellen van proximale einde tot distale einde; het milt gebied moet beginnen te blazen na ongeveer 1 mL Collagenase injectie. Terugstroming in de darmen kan leiden tot een ongewenste inflatie van de twaalfvingerige darm; Dit kan worden verholpen door aanpassing van de plaatsing van de naald (trek het een beetje uit, of plaats iets dieper) en door de naald goed te stabiliseren met behulp van een tang. De injectie wordt als een succes beschouwd als alle gebieden van de alvleesklier opgeblazen zijn (duodenale, maag en milt lobben) zoals weergegeven in Figuur 6. Verwijdering van de alvleesklier moet beginnen uit de milt regio. De opgeblazen alvleesklier wordt in stukjes gehakt met behulp van een fijne chirurgische schaar (figuur 7A). Na de vertering van 12 – 13 minuten en het mengen met de hand schudden, lijkt de weefsel suspensie homogener (figuur 7b). Vervolgens worden de eilandjes gezuiverd door de dichtheidsgradiënt na centrifugeren. Figuur 7C laat zien dat er een eilandje suspensie wordt gevormd tussen HBSS en de dichtheidsgradiënt na centrifugeren. Goede/gezonde eilandjes verschijnen als een gladde ronde vorm; slechte/beschadigde eilandjes vertonen ruwe randen en onverteerd exocriene weefsel vertoont een onregelmatige vorm en lijkt meer doorschijnend zoals afgebeeld in Figuur 8.

Figuur 1: chirurgische hulpmiddelen.
Gebogen chirurgische schaar, afdekglas Tang, micro Adson Tang, gebogen Tang, kleine chirurgische schaar, en Schwartz micro serrefines (microvasculaire klem) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Schematische illustratie van het protocol.
De meest kritieke stappen van deze procedure zijn de opspanning van de galwegen in de buurt van de lever, en het injecteren van Collagenase P via de Papil van Vater in een gemeenschappelijk galkanaal om de alvleesklier te verteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: ligging van een galkanaal.
Pincet houden de gemeenschappelijke galwegen en de hepatische slagader bundel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: afbeelding van een galkanaal en een Papil van Vater.
Een klem wordt geplaatst op de gemeenschappelijke galkanaal en hepatische slagader bundel in de buurt van de lever. De zwarte pijlen wijzen naar de Papil van Vater waar de naald wordt ingebracht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Cannulatie van een galkanaal.
Na een goede cannulatie van het galkanaal wordt de Papil van Vater met trypan Blue geïnjecteerd (alleen voor demonstratiedoeleinden) om de plaatsing van de galwegen beter te benadrukken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: volledig opgeblazen alvleesklier.
De gestippelde lijn toont de grens van de volledig geperfundeerd alvleesklier. De Tang houdt de milt in de regio waar de eilandjes het meest geconcentreerd zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: eilandje isolatie-en zuiveringsstappen.
A) mechanisch gehakte weefsel stukken van de alvleesklier vóór de spijsvertering. B) verteerde alvleesklier — homogene weefsel suspensie van Collagenase-perfused alvleesklier na 13 minuten incubatie in een bad met schud water bij 37 °c, gevolgd door 30 s menging met de hand. C) de ophangings laag van het eilandje wordt gevormd tussen de HBSS en de dichtheidsgradiënt na centrifugeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: representatieve eilandje beelden van fluorescentie Cell-Imager.
(A) goede eilandjes, slechte eilandjes en exocriene weefsel worden gezien. B) er wordt een cluster van goede eilandjes getoond. (C) paneel toont onverteerde exocriene weefsel gehecht aan een goed eilandje. Goede/gezonde eilandjes tonen gladde ronde randen, aangegeven door de rode letter "G"; slechte/beschadigde eilandjes vertonen onregelmatige vorm en ruwe randen en worden aangeduid met een blauwe letter "B". Onverteerde exocriene weefsels verschijnen doorschijnend, vaak gehecht aan eilandjes, en worden aangeduid met een groene letter "E". Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Dit protocol omvat Collagenase perfusie en spijsvertering, gevolgd door zuivering van eilandjes. De meest kritieke stappen van dit protocol zijn effectieve injectie en volledige perfusie van de alvleesklier^1,4,7. De leveringsmethode van dit protocol kan het enzym de anatomische routes doorkruisen om het exocriene weefsel rond de eilandjes¹beter te verteren. Bovendien is deze techniek zeer geschikt voor volledige vertering van de milt, die de hoogste concentratie van eilandjes^4,6heeft. Dit protocol, met goed gecontroleerde digestie tijd en zorgvuldig uitgevoerde zuiveringsstappen, kan 250 – 350 gezonde eilandjes produceren. De eilandjes geïsoleerd van dit protocol zijn gebruikt met succes te bestuderen glucose-gestimuleerd insuline secretie ex vivo¹². Uit onze ervaring, verhoogde insuline secretie 4-voudige bij hoge glucose stimulatie (22,2 mM) ten opzichte van Baseline (3,3 mM) na nachtelijke incubatie in 5,5 mM glucose-bevattende RPMI-1640 complete media. De overlevingsvermogen/functionaliteit van de eilandjes onder langdurige incubatie (2 – 7 dagen) is niet getest.

Hoewel het gepresenteerde protocol gedetailleerde aantekeningen en visuele demonstraties bevat, zijn er enkele aanpassingen nodig om de optimale omstandigheden voor hoge opbrengst en hoogwaardige eilandjes te bereiken. Twee meest voorkomende problemen die het succes kunnen belemmeren, zijn onjuiste canulatie van de Papil van Vater of accidentele punctie van het kanaal. Om te voorkomen dat deze, men moet ervoor zorgen dat de plaats van penetratie is precies waar de Papil ontmoet met de twaalfvingerige darm. Dit gebied is groter en relatief gemakkelijk te identificeren, waardoor meerdere lekke banden zonder de integriteit van het kanaal ernstig in gevaar brengen. Eenmaal binnen de ampulla, de oriëntatie van de naald moet parallel met het kanaal in plaats van schuin. Op dit punt, duw de naald in het kanaal voor ongeveer 1/4 van de lengte van het kanaal, en stabiliseer de naald met een tang tijdens het langzaam injecteren van Collagenase; Dit helpt om te voorkomen dat de naald onder de druk buigt en per ongeluk het kanaal prikt. Andere problemen kunnen omvatten over-of onderspijs vertering van de alvleesklier; Dit kan modificatie vereisen op basis van leeftijd, stam en geslacht van de muizen. Beschadigde eilandjes als gevolg van overmatige spijsvertering (enzymatische en mechanische) of langdurige blootstelling aan de dichtheidsgradiënt kunnen optreden. Dit zijn veelvoorkomende problemen die voor soortgelijke methoden bestaan; sommige kleine aanpassingen moeten aanzienlijke verbeteringen opleveren. Een suggestie bij het omgaan met dit soort problemen is het kiezen van een variabele te wijzigen op een tijdstip (bijvoorbeeld tijd van de spijsvertering of de concentratie van Collagenase).

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de route van enzym levering: het hebben van Collagenase P om de exocriene alvleesklier direct te verteren met behulp van een gemakkelijkere anatomische route die de spijsvertering efficiëntie verhoogt¹. Deze methode is gemeld om een 50% toename van het aantal eilandjes in vergelijking met de methode van middendoor de alvleesklier, hakken, en bloot aan Collagenase¹³. Dit protocol vereist slechts het gebruik van een enkele dichtheidsgradiënt, waardoor het aanzienlijk minder arbeidsintensief en kosteneffectiever is, in vergelijking met andere methoden die de voorbereiding van meerdere gradiënten op verschillende dichtheden vereisen, of de complexe Percoll methode die extra tijd^1,8,11vereist. De in dit Protocol gebruikte gradiënt methode is ook te gebruiken in eilandje isolement door anderen⁴. Deze methode van eilandje isolement biedt de wetenschapper een verbeterde tool voor het bestuderen van pancreas eilandjes. Toekomstige toepassingen van dit protocol omvatten wijziging ter verbetering van de werkzaamheid bij het omgaan met diabetische muizen. Evenals et al. hebben waargenomen, diabetische muizen, afhankelijk van de niveaus van de glucose, opleveren minder eilandjes (minder dan 100), met een verminderde grootte en het uiterlijk van eilandjes⁴. We hebben dit fenomeen waargenomen en geloven dat diabetische eilandjes kwetsbaarder zijn voor enzymatische en mechanische spijsvertering die speciale zorg vereisen. Bovendien kan de dichtheid van het eilandje de weergave in de dichtheidsgradiënt veranderen, de verdere optimalisatie van het protocol zou helpen om de opbrengst van diabetische eilandjes te verhogen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL syringe	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass forceps	VWR	82027-396	Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forceps	Sigma-Aldrich	Z168696	Holding tissues during pancreas removal
Isoflurane	Piramal	B13B16A	To anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishes	VWR	30-2041	Used for islet culture
30 G. ½ inch needle	BD	305106	For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tube	VWR	89039-658	Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrier	VWR	82020-845	To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability	Eppendorf	5811FJ478114	Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissors	Fisher-Scientific	13-804-21	For cutting open mouse abdomen
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Corning	20-023-CV	Washing cells
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	For gradient formation
Light source	Leeds	LR92240	Enhancing visibility of microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Culturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)	Fine Science Tools	18052-01	Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbath	Boekel/Grant	8R0534008	Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissors	VWR	82027-578	Cuttitng tissue that atached to pancreas