Summary
Этот метод может использоваться для измерения синтез РНК. 5-Bromouridine добавляется к клеткам и включены в синтезированных РНК. Синтез РНК измеряется РНК добыча сразу после маркировки, следуют 5-Bromouridine ориентированные иммунопреципитации помечены РНК и анализ обратной транскрипции и количественных полимеразной цепной реакции.
Abstract
При установившемся РНК уровни сравнении между двумя условиями, невозможно отличить ли изменений вызванных изменений в производство или деградации РНК. Этот протокол описывает метод для измерения производства РНК, используя 5-Bromouridine маркировки РНК, следуют иммунопреципитация, который позволяет расследования РНК синтезируется в течение короткого периода времени (например, ч. 1). 5-Bromouridine маркировка и иммунопреципитации преимущество использования токсичных transcriptional ингибиторы, такие как α-аманитин и дактиномицин D, что есть нет или очень низкое воздействие на жизнеспособность клеток во время кратковременного использования. Однако потому что только 5-Bromouridine иммунопреципитация захватывает РНК в течение короткого времени маркировки, медленно производства, а также быстро деградируют РНК может быть трудно измерить этим методом. 5-Bromouridine помечены РНК, захвачен 5-Bromouridine иммунопреципитация могут быть проанализированы по обратной транскрипции, количественные полимеразной цепной реакции и следующего поколения последовательности. Все типы РНК могут быть исследованы, и этот метод не ограничивается измерения mRNA, как представлено в этом примере.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) иммунопреципитации (IP) позволяет исследование производства РНК в клетках с нет или очень ограниченное воздействие на клетки физиологии во время краткого маркировки периода1,2. Метод основан на включения синтетических уридина производной Бру в недавно синтезированных РНК после IP помечены РНК, с использованием антител анти Бру (рис. 1).
Он был известен за десятилетия этот синтез белка может регулироваться транскрипционно, и существование транскрипционных факторов было предположить более чем 50 лет назад3. Сегодня, как известно, что некоторые заболевания вызваны регуляции транскрипции и стабильности РНК (дополнительная цифра S1 в ссылка4), и способность измерять изменения в производстве РНК имеет большое значение в понимании болезни развития.
С другой стороны инструменты для регулирования производства РНК обеспечивают новые возможности для лечения заболеваний, вызванных слишком мало или слишком много белков, или накопление белка как при болезни Паркинсона (PD). Преобладающим белок, накапливается в нерастворимые агрегатов в PD-α-synuclein, и уровень α-synuclein непосредственно связан с этой болезни, как ген умножение гена α-synuclein вызывает семейная PD5. Кроме того α-synuclein агрегатов в концентрации зависимым образом. Даунрегуляция уровни mRNA α-synuclein поэтому является интересным терапевтические стратегии, которая успешно достигнут с помощью РНК-интерференции для уменьшения потери нейрональных клеток в PD грызунов модели6,7.
Важно иметь возможность измерить изменения в производстве РНК, вызванной болезнью или терапевтических вмешательств. Современные методы для измерения уровней устойчивого состояния РНК, например обратной транскрипции, следуют количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР), не способны различать между изменений, вызванных регуляцию или изменены РНК стабильности. Широко используемый метод для исследования РНК распада ставок блокируется транскрипционный анализ механизма, с помощью соединений, таких как α-аманитин или актиномицин Д следуют измерений распадаясь РНК. Однако существуют некоторые проблемы, связанные с общей блокировки транскрипции в клетках, таких как индукции апоптоза8,9. Рядом с цитотоксическими эффектами транскрипционный анализ ингибиторы также присутствует ряд технических вопросов, таких как медленно клеточного поглощения α-аманитин и неконкретный характер актиномицин Д (обзор в ссылка10).
Чтобы избежать общей блокировки транскрипции, были использованы нуклеотида аналогов, например уридина 5-ethynyl (5-ЕС), 4-thiouridine (4-ту) и Брю. Эти легко принятые mammalian клеток и включены в недавно синтезированных РНК, позволяя пульс маркировки РНК в конкретные сроки. Брю менее токсичен, чем 5-ЕС и 4-ту, что делает его предпочтительным аналог выбор11,12.
Бру-IP может использоваться для расследования скорость синтеза РНК и стабильности и таким образом отличать причины изменения в целом РНК. Эта статья будет сосредоточена на измерении синтез РНК и относится к ссылки2 подробную информацию о расследовании РНК стабильности. Расследовать синтез РНК, клетки обозначены кратко с BrU например за 1 ч, следуют IP Бру-1 (рис. 1 c). Это позволяет измерения РНК синтезируется в течение короткого времени маркировки и наблюдаемые изменения даст более точную оценку положения в синтез РНК, чем путем измерения изменений в целом РНК по RT-ПЦР. Следует отметить, однако, что хотя время маркировки, например, только 1 h, деградация все еще может иметь влияние на РНК уровней, наблюдаемых.
RNA от BrU-IP экспериментов подходят для вниз по течению анализа RT-ПЦР1 или2,последовательность следующего поколения13. Другие стандартные методы обнаружения РНК, например Северный blotting или анализа защиты рибонуклеаза, могут также применяться для некоторых РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре, если не указано иное и Храните буферы на льду или в холодильник (за исключением от Элюирующий буфер, содержащий SDS). Протокол состоит из 5 разделов: подготовка РНК образцов; подготовка бусы для IP; Связывание BrU помечены РНК бисером; Элюирующий и очистки связанных BrU помечены РНК экстракцией 3 шага фенол фенол/хлороформ хлороформе; анализ РНК (в этом примере с помощью RT-ПЦР)
1. Подготовка образцов РНК
- Фото HEK293T клетки, с помощью автоматизированных клеток противостоять и семян 3,500,000 клетки в чашке Петри 10 см в 10 мл средства роста (среднего изменения орла Дульбекко дополнена 10% плода телячьей сыворотки и 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина) получить в общей сложности > 40 мкг РНК После извлечения 48 ч позже. Сохранить клетки при 37 ° C и 5% CO2.
- 48 ч после посева, аспирационная 8 мл питательной среды и оставить 2 мл, чтобы избежать высыхания клетки. Добавить 2 мм Бру и любого обращения к 8 мл придыханием роста средств массовой информации и удалить остаточные 2 мл от клеток до повторное 8 мл Бру, содержащий роста средств массовой информации. Избегайте использования свежего СМИ по заявлению BrU клеток, так как это может вызвать изменения в экспрессии генов.
- Инкубируйте клетки за 1 час с Бру и лечения. Вымыть клетки в 5 мл Хэнк буфера и trypsinize клетки, используя 2 мл 0,05% трипсина. Добавьте 8 мл питательных сред для остановки реакции, передачи клетки в 15 мл трубку и спин вниз клетки на 2 мин на 1000 x g.
- Удалить супернатант и извлекать всего РНК из клеток гранул с помощью изоляции RNA комплекта (см. Таблицу материалов) или любой другой предпочтительный метод и элюировать РНКазы свободный H2O. Store РНК-80 ° c до готовности продолжить.
2. Подготовка бусы для IP
- Подготовьте бусины в пакетах количество образцов должны расследоваться плюс один дополнительный для учета потерь во время закупорить и кружиться смешивания. Ресуспензируйте анти мыши IgG магнитные шарики тщательно смешивая кружить и вывезти 20 мкл бусы на сэмпл в свободной РНКазы 1,5 мл трубки. Место 1,5 мл трубки магнитного стенд и оставить около 20 s для бисера для сбора на стороне.
- Удалить супернатант, вынуть трубку от магнитного стенд и Ресуспензируйте в буфере Бру-IP 1 x 400 мкл, закупорить. Спиновые трубки очень кратко для 2 s в настольные центрифуги, поместите его обратно в магнитного стенд и удалить супернатант. Повторите шаг Стиральная один раз.
- Блок неспецифических привязка бусы, используя гепарина. Ресуспензируйте бисер в 1 мл 1 x BrU-IP + 1 мг/мл гепарина буфер и отпуск, ротационные для стирки 30 мин бисер один раз, как в шаге 2.2.
Примечание: Гепарина-отрицательно заряженных полимер, который будет конкурировать с РНК для привязки. tRNA или другие не значения РНК может также использоваться если течению приложения не виртуализации. - Ресуспензируйте бисер в 1 мл 1 x BrU-IP буфера и добавьте 1,25 антитела анти α-Бромдезоксиуридин мкг/образца, которая также признает Брю. Инкубировать Бусины для 1 h при вращении, или на ночь при комнатной температуре.
- Вымойте бусины три раза как в шаге 2.2. Ресуспензируйте бисер в 50 мкл/образца 1 x Бру-IP буфера с 1 мм Бру и отпуск, ротационные для 30 минут, чтобы снизить чувствительность антитела, связанный с бисером и настоящим риска неспецифических привязки во время IP.
- Вымойте бусины три раза как в шаге 2.2 и Ресуспензируйте 50 мкл/образец 1xBrU-IP буфера.
3. Привязка BrU помечены РНК бисером
- Измерять концентрации РНК РНК выдержек из шага 1.3 с помощью УФ видимые спектрофотометрии и разбавлять 40 мкг РНК от каждого образца в свободный РНКазы H2O к общим объемом 200 мкл.
- Тепло образцов РНК для 2 мин при 80 ° C до денатурировать РНК и спина кратко в настольной центрифуги. Добавьте 200 мкл 2 x BrU-IP + BSA/РНКазы ингибитора.
- Добавьте 50 мкл высокомобильна и подготовила бусы из шага 2.6 для каждой выборки и оставить вращающихся 1 ч. мыть бусины четыре раза как в шаге 2.2.
4. элюции и Очистка РНК экстракцией фенол фенол/хлороформ хлороформ 3 шага
-
Элюировать РНК и выполнить извлечение фенола
- Ресуспензируйте бисер в 200 мкл Элюирующий буфер элюировать РНК и быстро после этого добавить 200 мкл рабочего раствора фенола, рН 6,6 (осторожно: токсичные, см. Примечание ниже шаг 4.1.2) чтобы удалить любые молекулы-РНК из образца.
- Вихрь смеси образца и спина 3 мин на 25000 х g в настольной центрифуги.
Примечание: Фенол токсичных и обрабатываться в Зонта носить защиту кожи. Слегка кислой рН гарантирует, что только, ДНК и РНК не, извлекается. РНК будет оставаться в верхней водной фазе благодаря гидрофильные характер обвинения. Гидрофобные ядер белки связывают фенола и перейти к нижней органических фенол фазе.
-
Выполнять извлечение фенола хлороформ
- Аспирационная столько Верхний этап как можно (около 190 мкл 200 мкл, в зависимости от опыта в обработке) и переместить его в трубку с 200 мкл фенол/хлороформ, рН 6,6 (осторожно: токсичные, см. Примечание). Убедитесь в том, чтобы аспирационная ту же сумму через образцы.
- Вихрь mix образца и спина на 3 мин на 25000 х g.
Примечание: Хлороформ токсичных и обрабатываться в Зонта носить защиту кожи. Хлороформ добавляется удалить фенол, который может повлиять на течению анализ РНК путем ингибирования обратной транскрипции14 и полимеразной цепной реакции15.
- Выполнения извлечения хлороформ аспирационных водяной верхний участок как раньше (сейчас около 180 мкл) и передать трубка, содержащая 200 мкл хлороформ. Вихрь mix образца и Спиновое 3 мин на 25000 х g.
- Аспирационная водяной верхний участок как раньше (сейчас около 170 мкл) и передача его в пробирку, содержащую COONa, рН 6,0 17 мкл (1/10 объема) 3 M CH3. Для нейтрализации и осадить РНК от водного раствора, добавьте 2 мкл гликогена (20 мг/мл), который осаждает вместе с РНК и делает Пелле РНК более заметными.
- Добавьте 500 мкл Этанол 96% увеличить связывание ионов соли и РНК и микс, инвертирование трубки пару раз. Оставьте трубку на ночь-20 ° C или 15 мин на сухой лед.
- Спиновые образца на 25000 х g, 4 ° C на 30 мин удалить супернатант не нарушая гранулы и помыть лепешка в 185 мкл 75% этанол, чтобы удалить любые остаточные соли. Спина на 25 000 x g, 4 ° C за 5 мин.
- Отменить супернатант полностью не нарушая гранулы и оставить Пелле высохнуть 5-10 мин с открытой крышкой. Ресуспензируйте в 10 мкл РНКазы свободный H2O применяется на стороне трубки, чтобы не мешать гранулы.
5. анализ РНК
- Подготовить cDNA, используя cDNA обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалов) или любой другой предпочтительный метод с использованием 2 мкл пример РНК и 1 мкг дрожжи всего РНК как несущая РНК для реакции синтеза cDNA (не используется, если cDNA используется для следующего поколения секвенирования). Используйте 1 мкг РНК без дрожжей РНК для cDNA подготовки соответствующего вклада.
- Разбавить cDNA 1:25 и микс 9 мкл разбавленный cDNA с 10 мкл ПЦР мастер смесь и 1 мкл fluorogenic зонд, оба указанных в Таблице материалов.
Примечание: CDNA разрежения зависит от подготовки cDNA и используемого метода ПЦР. - Запустите следующую программу ПЦР (например, на 7500 быстро Real-time PCR системы или эквивалент): 2 мин при 50 ° C, 20 s при 95 ° C, 40 циклов 3 s при 95 ° C и 30 s при температуре 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши первоначальные испытания BrU маркировки времени выполнялись в клетках AsPC-1. Клетки были относиться с BrU для 0, 1, 2 и 4,5 часа, следуют общей РНК добыча и Бру-IP. GAS5 и GAPDH были измерены в BrU-IP РНК, которая продемонстрировала, что 1 h маркировки было достаточно, чтобы достичь примерно 9 - и 44 раза изменения, по сравнению с фон (0 h) для GAPDH и GAS5, соответственно.
Бру-IP и анализ описанных выше были использованы для расследования, если обнаружены изменения в стационарном уровнях α-synuclein мРНК на поло как киназа 2 (ПЛК-2) ингибирование были вызваны изменениями в синтез мРНК1. 1 h маркировки время был выбран потому, что это обеспечивает достаточной маркировки, по сравнению с фона (рис. 2), а также позволяет время лечения иметь эффект. 2 мм BrU лечения не вызывает каких-либо морфологические изменения в клетках HEK293T за 1 ч или более 4 ч лечения (рис. 3A).
Α-Synuclein transfected HEK293T клетки обращались за 1 час с ДМСО или конкретные ПЛК-2 ингибиторов (ПЛК 2i) присутствии BrU маркировать свеже синтезированных РНК. Клетки были далее собирают и общая РНК была извлечена. Брю, меченного РНК, производится в течение 1 ч лечения собранных с помощью BrU-IP («BrU-IP» в рисунок 3B) из общего пула РНК («ввод» на рисунке 3B). Количество РНК полученные с BrU-IP 40 мкг, исходный материал варьируется от различных клеточных линий, и мы, как правило, получить около 500 нг от HEK293T клеток, но только 10-50 нг от НеЬа клетки. ПЛК-2 ингибирование вызвало увеличение α-synuclein мРНК в BrU-IP (рис. 3B), так и для ввода, предполагая, что увеличение в стационарном состоянии, которую РНК вызвано увеличением синтез РНК. Чтобы гарантировать ПЛК 2i просто не вызывают общее увеличение производства РНК, 3 дополнительные эндогенного генов (ACTB, HMBS и NADH) были измерены (рис. 4). Ни один из этих генов было увеличено в Input (рис. 4A) и Бру-IP (рис. 4B) после лечения ПЛК 2i.
Чтобы проверить специфика BrU-IP, элемент управления с клетками-Брю лечение был включен. Сопоставлялись уровни 18sRNA захвачен BrU-IP от BrU лечение и необработанных клеток (рис. 5). Это ясно показывает, что IP-Бру весьма конкретные и только захватывает очень малую часть не помечены РНК (рис. 5).
Потому что только Брю, меченного РНК производится в течение 1 ч, важно выбрать надлежащего ведения ген, так как некоторые обычно подходит генов может быть выражен в слишком низких концентрациях надежными. 18sRNA был выбран в качестве ссылки гена для данных, представленных в рисунке 3B и 4 из-за его высокой изобилия. Были однако, испытаны несколько ссылку генов, и некоторые показали высокий порог циклов (> 30) (рис. 6). Эти данные также показывает, что разница между BrU помечены IP'ed РНК и общая РНК на входе около 5 Ct и некоторые РНК, выраженных на небольшие суммы в ячейке может поэтому не обнаруживаться правильно после Бру-IP.
Рисунок 1: описание BrU-IP для исследования синтеза РНК. (A) РНК в клетках от ДНК транскрибируются РНК-полимеразы. (B) при добавлении к СМИ, Брю take up клетками и включены в недавно транскрипции РНК. (C) для измерения цены синтеза РНК: (1) недавно синтезированных РНК обозначена на 1 час с Бру, (2) РНК добывается из клеток, сразу же после маркировки, (3) BrU помечены РНК — immunoprecipitated, с использованием антител анти Бру, (4) BrU маркировкой (и соответствующим входным) РНК анализируется RT-ПЦР или последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оценка маркировки время. Пример первоначальную оценку времени, Бру маркировки. AsPC-1 клеток, выращиваемых в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среднего дополнена плода бычьим сывороточным 10% и 50 ед/мл / 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина лечили Бру в конечной концентрации 2 мм, 0, 1, 2, и 4,5 ч до РНК добыча и анализ RT-ПЦР. Данные количественно как 2-Ctи представлен как среднее техническое triplicates ± стандартное отклонение, n = 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты показаны входные и РНК BrU-IP от ДМСО и ПЛК 2i лечение клетки. (A) 1 h и 4 h 2 мм BrU лечения не вызывает каких-либо видимых морфологических изменений в HEK293T клетках. Шкалы бар = 100 µm. (B) адаптация рисунок от ссылка1. 3,500,000 HEK293T клетки были посеяны на 10 см блюдо и transfected с плазмида, выражая α-synuclein 24 ч после посева. 24 h пост transfection клетки инкубировали за 1 час с BrU присутствии ДМСО или ПЛК 2i, следуют РНК добыча и Бру-IP. Был проведен анализ РНК по RT-ПЦР с помощью зонда наборы, направленные против человеческой SNCA (α-synuclein) и 18sRNA. Бру-IP и ввода SNCA был количественно относительно BrU-IP и ввод 18sRNA, соответственно, с помощью метода 2-ΔΔCТ . Результаты были нормализованы в ДМСО лечение образцы. Данные представлены как среднее ± стандартных отклонений. Статистические сопоставления были проведены с использованием студента непарных t теста, * p < 0,001, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: измерение других генов, не изменилась, ПЛК 2i. ПЛК 2i изменения ни общей, ни синтезированных РНК ACTB, HMBS и НАДН. (A) ACTB, HMBS, NADH РНК из входных данных измеряется в трех экземплярах в одном эксперименте и количественно по отношению к 18sRNA во входных данных с помощью метода 2-ΔΔCТ . Значения были нормализованы в ДМСО рассматриваются образцы и бары представляют собой среднее triplicates ± стандартных отклонений, n = 1. (B) ACTB, HMBS NADH были также измеряется в BrU-IP'ed РНК и количественно по отношению к 18sRNA в BrU-IP. Значения были нормализованы в ДМСО и представлены как A, n = 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: специфика IP-Бру. Для сравнения 18sRNA захвачен BrU-IP от BrU - и не Бру лечение клеток РНК из Бру-IP проверяются относительно ввода РНК для учета различий в исходный материал и далее нормированы Бру лечение образцов. Лишь очень небольшая часть (0,002) BrU меченного 18sRNA был immunoprecipitated, демонстрируя, что BrU-IP является весьма конкретной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: уровни различных мРНК в РНК BrU-IP, по сравнению с ввода РНК. Несколько потенциальных ссылка гены были протестированы, потому что некоторые РНК будет присутствовать в очень низких концентрациях в BrU-IP РНК из-за небольших объемов производства РНК в течение 1 ч BrU лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает использование BrU-IP для определения РНК производства, маркировки вновь производится РНК за 1 час с Бру, затем немедленное извлечение RNA и иммунопреципитации BrU помечены РНК. Этот метод был описан ранее в ссылка16, и эта статья включает в себя некоторые дополнительные шаги для увеличения IP специфичность и чистоту РНК, предварительно обрабатывая бисером с низкой концентрацией Бру, а также Фенол хлороформ очистки шаг к повышение чистоты РНК после IP. Кроме того, мы также представляем данные здесь демонстрируют специфику BrU-IP, сравнивая РНК, захватили из Бру и -Брю лечение клетки. Фенол хлороформ очистки это дешево, но с учетом низкого количества РНК, помечены Бру, увеличение сигналов в нижнем анализа могут быть получены с помощью РНК-очистки наборы вместо. Наш опыт является, однако, что наиболее близкие извлечения РНК через образцы получается с помощью фенола хлороформ очистки.
Бру маркировки и - IP, в отличие от анализа всего уровней РНК, способного расследовать причины изменения уровня устойчивого состояния РНК. Метод не имеет или ограниченное воздействие на физиологии клетки, в отличие от использования transcriptional ингибиторов таких как α-аманитин и актиномицин д Было предложено, что сравнение недавно синтезированных РНК в стационарном уровнях могут использоваться для расчета РНК распада ставки17, и описанный здесь метод BrU-IP позволяет одновременное определение РНК синтеза и распада в одном assay.
На рисунке 5мы продемонстрировали, что РНК-это только IP'ed от BrU лечение клетки, показывая, что действительно Бру, включены в РНК в клетки линии используется здесь. Однако мы предлагаем проведение первоначального испытания BrU включения в РНК в других клеточных линий перед выполнением BrU-IP. Это может например, сделано с помощью антител анти Брю для количественного определения BrU всего РНК экстрактов через точку пятно или энзим соединенный assay иммуносорбента.
Здесь мы не представили испытание эффективности BrU-IP через образцы, но это могут быть исследованы с помощью BrU помечены шипы в РНК либо производятся в пробирке или из другого организма, например Drosophila melanogaster. Эта РНК может также использоваться течению количественной и нормировок.
Правильные методы дозирования имеют решающее значение при выполнении высокочувствительный количественных анализов, например IP-Бру и RT-ПЦР, и следует предпринять особые усилия для выполнения равных дозирование различных образцов. Фенол хлороформ извлечений требовать некоторый опыт, но после неудовлетворительных закупорить, водный и фенол/хлороформ фазы может быть Перемиксована и вновь центрифугируют.
Этот протокол предполагает BrU маркировки на 1 ч при измерении синтез РНК. Эта маркировка время дает приблизительную оценку изменений в транскрипции, так как большинство человека и мышей mRNAs оценкам иметь период полураспада > 6 h18,19. Осторожность следует, однако, осуществляться при интерпретации данных, полученных, так как многие РНК полураспада < 1 h18,19, например несколько стенограмм, вызванных липидов A, которые быстро увеличить после стимуляции и сокращаться обратно базовые уровни в течение 2 ч после индукции20. Чтобы снизить риск влияния от РНК деградации, Бру маркировка время может быть уменьшено, однако, это также важно для обозначения достаточно РНК, чтобы иметь возможность различать РНК, полученные от фона (который был получен после 1 h маркировки в наших руках (BrU-IP Рисунок 2)). Другой вариант заключается в измерении РНК синтеза и распада гена интереса, используя Бру маркировки и IP, последний метод описан в2. Данные из этих двух подходов дополняют друг друга, и если измерить изменения в синтезе между двумя условиями, но никаких изменений наблюдается в упадок ставки, можно сделать вывод, что измеренная изменения РНК были вызваны регуляции синтеза. Однако важно помнить, что обе методики измерить только функциональность РНК путем оценки уровня РНК и полностью пренебрегают расследовать другие механизмы, влияющие на РНК функций, таких как химические модификации14.
Поскольку клетки инкубируют с BrU только 1 h, очень медленно производимых мРНК могут быть трудно измерить с помощью метода BrU-IP. Это одна точка, где использование transcriptional ингибиторы, такие как α-аманитин и дактиномицин D может быть предпочтительным через Бру-IP, однако, они только может использоваться для измерения изменений в деградации и измерить непосредственно не производства РНК. Низкий уровень BrU помечены РНК также могут быть преодолены, увеличивая время инкубации с Бру, хотя, длительный инкубационный раз увеличивают риск влияний РНК деградации. В этом случае это больше не возможно знать ли изменения в BrU помечены РНК вызваны изменениями в производстве РНК или распада.
В этом примере вниз по течению анализа захваченных BrU помечены РНК выполняется с помощью RT-ПЦР, однако, следующее поколение последовательности также широко используемый метод течению экран изменения в большом бассейне RNAs2,13. Аналогично метод анализа мРНК не ограничивается, но может анализировать все типы РНК2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Фонд компании «Лундбек», Орхусе университет, Dandrite и Lundbeck антиспама поддерживает эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
