Summary
בשיטה זו ניתן למדוד את סינתזת RNA. 5-Bromouridine הוסיף לתאים, שולבו RNA מסונתז. סינתזת RNA נמדד על ידי RNA חילוץ מיד לאחר labelling, ואחריו immunoprecipitation 5-Bromouridine-ממוקד של RNA וניתוח עם תוויות ברורות על ידי שעתוק במהופך ואת תגובת שרשרת פולימראזית כמותית.
Abstract
כאשר רמות מצב יציב RNA מושווים בין שני תנאים, אין אפשרות להבחין בין אם השינויים נגרמים שינויים ייצור או השפלה של RNA. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת ייצור RNA, באמצעות 5-Bromouridine תוויות של RNA ואחריו immunoprecipitation, אשר מאפשר חקירה של RNA מסונתז בתוך פרק זמן קצר (למשל, 1 h). היתרון של immunoprecipitation ו- 5-Bromouridine-תוויות על השימוש של מעכבי תעתיק רעילים, כגון אמניטין α וואקטינומיצין D, היא שאין שום או אפקטים נמוך מאוד על יכולת הקיום תא במהלך שימוש לטווח קצר. עם זאת, כי 5-Bromouridine-immunoprecipitation רק לוכד RNA שהופק במסגרת הזמן labelling קצר, לאט המיוצר וכן במהירות השפיל RNA יכול להיות קשה למדוד בשיטה זו. ניתן לנתח את הרנ א. 5-Bromouridine-מתויג שנתפסו על ידי 5-Bromouridine-immunoprecipitation על ידי שעתוק במהופך, כמותית של תגובת שרשרת פולימראזית רצף הדור הבא. כל סוגי RNA יכול ייחקרו, השיטה אינה מוגבלת מדידה mRNA כפי מוצג בדוגמה זו.
Introduction
5-Bromouridine (אחי) immunoprecipitation (IP) מאפשר חקר ייצור RNA בתאים ללא או השפעות מוגבלת מאוד על תא פיזיולוגיה במהלך התקציר labelling תקופה1,2. השיטה מבוססת על התאגדות של הנגזרת uridine סינתטי ברו לתוך RNA מסונתז לאחרונה עקב על ידי ה-IP של RNA שכותרתה באמצעות נוגדנים anti-ברו (איור 1).
זה כבר ידוע כי עשרות שנים את סינתזת החלבון להיות מוסדרות transcriptionally, קיום גורמי שעתוק היה שיערו לפני יותר מ 50 שנה3. כיום, ידוע כי כמה מחלות נגרמות על ידי dysregulation של שעתוק ויציבות RNA (משלים איור S1 הפניה4), ואת היכולת למדוד שינויים בייצור ה-RNA הוא בעל חשיבות רבה הבנה במחלה פיתוח.
מצד שני, כלי כדי לווסת את ייצור RNA מספקים אפשרויות חדשות לטיפול במחלות שנגרמו על ידי ביטוי חלבון קטן מדי או גדול מדי, או הצטברות חלבונים כגון מחלת פרקינסון (PD). החלבון השולט צבירת אגרגטים מסיסים כמו ב- PD α-synuclein, הרמה של α-synuclein מקושר ישירות המחלה, כמו ג'ין הכפלה של הגן α-synuclein גורמת PD משפחתית5. יתר על כן, α-synuclein אגרגטים באופן תלוי ריכוז. Downregulation של רמות ה-mRNA α-synuclein לכן אסטרטגיה טיפולית מעניינת, אשר בהצלחה הושגה באמצעות התערבות RNA כדי להקטין את איבוד תאים עצביים ב- PD מודלים מכרסמים6,7.
חשוב שניתן יהיה למדוד את השינויים בתחום ייצור RNA נגרם על-ידי מחלה או התערבויות טיפוליות. המדינה של אמנות שיטות מדידת רמות מצב יציב של RNA, כגון שעתוק במהופך ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (RT-qPCR), אינם מסוגלים להבחין בין השינויים שנגרמו על ידי רגולציה תעתיק או משתנה יציבות הרנ א. שיטה בשימוש נרחב לחקירה של RNA הניוון חוסם של מכונות תעתיק באמצעות תרכובות כגון אמניטין α או ואקטינומיצין D ואחריו מדידות RNAs רקובה. עם זאת, ישנם כמה בעיות הקשורות של חסימה הכוללת של שעתוק בתאים, כגון אינדוקציה של אפופטוזיס8,9. לצד ההשפעות ציטוטוקסיות, מעכבי תעתיק גם להציג מספר בעיות טכניות, כגון ספיגת הסלולר איטי של α אמניטין וחוסר יחודיות של ואקטינומיצין D (נבדקה תוך התייחסות10).
כדי למנוע את החסימה הכללי של שעתוק, נוקלאוטיד מקבילים היו בשימוש, כגון 5-ethynyl uridine (5-האיחוד האירופי), 4-thiouridine (4-טו) וברו. אלה בקלות נלקח על ידי בתרבית של תאים, שולבו לאחרונה מסונתז RNA, הפעלת הדופק-תוויות של RNA בתוך פרק זמן מסוים. ברו רעיל פחות מ 5-האיחוד האירופי, 4-טו, הפיכתה של אנלוגי המועדפת של הבחירה11,12.
ברו-IP יכול לשמש כדי לחקור את קצב סינתזת RNA ויציבות, וכך להבדיל בין הגורמים הבסיסיים של שינויים ב- RNA הכולל. מאמר זה יתמקד המידה של סינתזת RNA ומתייחס להפנות2 פרטים על החקירה של יציבות הרנ א. לחקור סינתזה RNA, התאים הם בקצרה בלוחיות ברו למשל עבור h 1 ואחריו ברו-IP1 (איור 1C). דבר זה מאפשר מדידות של RNA מסונתז בתוך זמן קצר labelling וייתן שינויי אומדן טוב יותר של תקנות ב סינתזה RNA מאשר על ידי מדידת שינויים ב- RNA הכולל מאת RT-qPCR. יש לציין, עם זאת, כי למרות הזמן labelling הוא, לדוגמה, רק 1 h, השפלה יכולים עדיין יש השפעה על רמות ה-RNA שנצפו.
RNA של ברו-IP ניסויים מתאימים לניתוח במורד הזרם על ידי שני RT-qPCR1 או2,רצף הדור הבא13. תקן RNA לזיהוי בשיטות אחרות, כגון סופג בצפון או ribonuclease הגנה assay, עשוי גם להיות ישימים עבור RNAs מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צויין אחרת ולשמור על מאגרי על קרח או במקרר (למעט מ • תנאי מאגר המכיל מרחביות). הפרוטוקול מחולק למקטעים 5: הכנה של RNA דגימות; הכנה של חרוזים IP; איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים; • תנאי וטיהור של RNA מתויג ברו המאוגד על-ידי מיצוי פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים; ניתוח של RNA (בדוגמה זו באמצעות RT-qPCR)
1. הכנת דוגמאות RNA
- HEK293T ספירת תאים באמצעות תא אוטומטיות מונה, זרע 3,500,000 תאים בצלוחית 10 ס מ בתקשורת הצמיחה 10 מ"ל (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco בתוספת 10% עגל עוברית סרום ו פניצילין µg/mL 50/סטרפטומיצין...) כדי לקבל סכום כולל של > 40 µg RNA על החילוץ 48 שעות מאוחר יותר לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%2.
- 48 שעות לאחר זריעה, תשאף 8 mL צמיחה מדיה ולהשאיר את 2 מ"ל מאחור כדי למנוע ייבוש התאים. להוסיף 2 מ מ ברו, כל טיפול 8 מ ל aspirated צמיחה מדיה, ולהסיר את השארית 2 מ"ל מתאי לפני החלת mL 8 ברו המכיל צמיחה מדיה. הימנע משימוש מדיה טריים על היישום של ברו התאים, מאז זה יכול לגרום שינויים בביטוי הגנים.
- דגירה את התאים עבור h 1 עם ברו וטיפול. לשטוף את התאים במאגר של 5 מ"ל האנק, trypsinize את התאים באמצעות טריפסין 0.05% 2 מ"ל. הוסף 8 מ ל מדיה הצמיחה כדי לעצור את התגובה, להעביר את התאים צינור 15 מ"ל ו ספין למטה התאים למשך 2 דקות ב g 1,000 x.
- הסר את תגובת שיקוע ולחלץ RNA הכולל מ בגדר התא באמצעות בידוד RNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה ולאחר elute נטולת RNase H2O. החנות את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכנים להמשיך.
2. הכנה של חרוזים IP
- להכין חרוזים בקבוצות במספר הדגימות להיחקר פלוס אחד נוסף בחשבון הפסד במהלך pipetting, להסתחרר ערבוב. Resuspend העכבר אנטי איג beads מגנטי ביסודיות על ידי סיבוב ערבוב, להוציא 20 µL חרוזי לדגימה צינור 1.5 mL RNase-חופשית. המקום הצינור 1.5 mL מעמד מגנטי ו להשאיר כ 20 s עבור החרוזים לאסוף בצד.
- הסר את תגובת שיקוע, להוציא את הצינור מדוכן מגנטי, resuspend במאגר ברו-IP 1 x µL 400 על-ידי pipetting. לסובב את הצינור קצר עבור 2 s ומפרידה שולחני, מניחים אותה בחזרה דוכן העדים מגנטי, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם אחת.
- בלוק לא ספציפי מחייב החרוזים קרישת דם. Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x BrU-IP + 1 מ"ג/מ"ל מאגר הפארין, ולהשאיר סיבוב במשך 30 דקות לשטוף את החרוזים פעם אחת, כמו שלב 2.2.
הערה: הפרין הוא פולימר טעונים שלילית, אשר יתחרו עם RNAs לכריכה. tRNA או RNAs לא רלוונטיים אחרים ניתן להשתמש גם אם היישום במורד הזרם לא והרצף. - Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x ברו-IP מאגר ולהוסיף 1.25 נוגדן anti-α-Bromodeoxyuridine µg/המדגם, אשר גם מזהה ברו. דגירה של חרוזי 1 h תוך כדי סיבוב, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2. Resuspend את החרוזים במאגר 50 x 1 µL/מדגם ברו-IP בתוספת 1 מ"מ ברו ולהשאיר סיבוב למשך 30 דקות להוריד את הרגישות של הנוגדן מאוגד החרוזים, בזאת את הסיכון של איגוד לא ספציפי במהלך ה-IP.
- לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2, resuspend במאגר µL/מדגם 1xBrU-IP 50.
3. איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים
- למדוד ריכוזים RNA ב RNA תמציות מהשלב 1.3 באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול-גלוי, למהול 40 µg RNA של כל דגימה ללא RNase H2O את הנפח הכולל של 200 µL.
- מחממים את דגימות ה-RNA למשך 2 דקות ב- 80 ° C עד denature RNA ו ספין בקצרה ב צנטריפוגה שולחן. להוסיף 200 µL 2 x ברו-IP + BSA/RNAse מעכב.
- הוסף 50 µL resuspended, להכין חרוזים מהשלב 2.6 כל מדגם ולהשאיר סיבוב ח' 1 לשטוף את החרוזים ארבע פעמים כמו שלב 2.2.
4. • תנאי וטיהור של RNA הפקת פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים
-
Elute RNA ולבצע פנול החילוץ
- Resuspend את החרוזים במאגר • תנאי µL 200 כדי elute RNA, במהירות לאחר מכן להוסיף 200 µL פנול, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה להלן צעד 4.1.2) כדי להסיר כל מולקולות RNA שאינן מן המדגם.
- סיבוב תמהיל המדגם, ספין 3 דקות ב g x 25,000 ומפרידה שולחן.
הערה: פנול הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. ה-pH חומצי מעט מבטיח כי רק RNA, ו לא ה-DNA, מופק. הרנ א יישאר בשלב מימית העליון בשל אופיו הידרופילית של חיובים. ליבת הידרופובי חלבונים לאגד פנול ולעבור לשלב התחתון אורגנים פנול.
-
מבצע החילוץ פנול-כלורופורם
- האחות העליונה-שלב רב ככל האפשר (190 כ µL של µL 200, תלוי ניסיון בטיפול) והעבר אותו לרכבת התחתית עם 200 µL פנול/כלורופורם, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה). ודא לרוקן את אותה כמות מדגמים.
- ניסיון לערבב את הדגימה ספין למשך 3 דקות ב 25,000 x g.
הערה: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. כלורופורם נוסף כדי להסיר פנול, אשר יכולים להשפיע על ידי עיכוב שעתוק במהופך14 ופולימראז תגובות שרשרת15ניתוח במורד הזרם של RNA.
- לבצע כלורופורם חילוץ על ידי כ רפה בעברית השלב העליון מימית כמו לפני (µL כעת כ- 180), ולהעביר שפופרת המכילה כלורופורם µL 200. ניסיון לערבב את הדגימה, ספין 3 דקות ב g 25,000 x.
- האחות השלב העליון מימית כמו בעבר (עכשיו כ 170 µL), להעביר אותו צינור המכיל 17 µL (כרך 1/10) 3 מ' CH3COONa, pH 6.0. כדי לנטרל לזרז RNA מהפתרון מימית, להוסיף 2 הגליקוגן µL (20 מ"ג/מ"ל), אשר ארגונייט שוקע יחד עם ה-RNA והופכת בגדר RNA גלוי יותר.
- להוסיף 500 אתנול 96% µL להגדיל מחייב בין יונים מלח ו RNA מיקס על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. להשאיר את צינור לילה ב-20 ° C או 15 דקות קרח יבש.
- ספין המדגם ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר ולשטוף בגדר 185 µL 75% אתנול כדי להסיר את כל משקעי מלח. ספין ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע לחלוטין מבלי להפריע בגדר, בגדר להתייבש 5-10 דקות עם מכסה פתוח להשאיר. Resuspend ב 10 µL ללא RNase H2O חלה בצד הצינור כדי להימנע מהפרעה בגדר.
5. ניתוח של RNA
- להכין cDNA באמצעות תיעוד הפוכה cDNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה באמצעות 2 מדגם ה-RNA µL, 1 µg שמרים RNA הכולל כנשא RNA עבור התגובה סינתזה cDNA (לא משמש אם cDNA משמש עבור רצף הדור הבא). השתמש µg 1 RNA ללא שמרים RNA להכנה cDNA של קלט המתאימים.
- CDNA שתדללו 1:25 ו- cDNA של µL 9 מדולל לערבב עם 10 µL qPCR מאסטר מיקס, בדיקה 1 µL fluorogenic, שניהם המצוין בטבלה של חומרים.
הערה: דילול cDNA תלוי cDNA הכנה ואת שיטת qPCR. - הפעל את התוכנית qPCR הבאים (למשל, על מערכת מהר בזמן אמת PCR 7500 או שווה ערך): 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 20 s ב 95 ° C, 40 מחזורי 3 s ב 95 ° C ו- 30 s-60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפי הבדיקות הראשוניות של זמן labelling ברו בוצעו בתאים AsPC-1. התאים טופלו על-ברו על 0, 1, 2, ו- 4.5 h, ואחריו הכולל החילוץ-RNA, ברו-IP. GAS5, GAPDH נמדדו ב- RNA ברו-IP, אשר הראו כי 1 h labelling הספיק להגיע כ 9 - ו 44 פי שינוי לעומת הרקע (0 h) עבור GAPDH ו- GAS5, בהתאמה.
ברו-IP הניתוח שתוארו לעיל שימשו כדי לחקור אם גילה השינויים ברמות מצב יציב של mRNA α-synuclein על פולו דמוי קינאז 2 (PLK 2) עיכוב נגרמו שינויים סינתזת mRNA1. זמן labelling 1 h נבחר בגלל זה מספק מספיק labelling לעומת הרקע (איור 2) ומאפשר גם זמן הטיפול יש השפעה. 2 מ מ ברו הטיפול לא לגרום שינויים מורפולוגיות בתאים HEK293T. 1 h או את הטיפול עוד 4 שעות (איור 3 א).
Α-Synuclein transfected HEK293T תאים בחרדה h 1 עם דימתיל סולפוקסיד או מעכב ספציפי PLK-2 (PLK-2i) בנוכחות ברו לתייג RNA טרי מסונתז. תאים נבצרו להלן, הכולל RNA שהופק. מתויג ברו RNA שהופק במסגרת הטיפול 1 h נאסף באמצעות IP-ברו ("ברו-IP" ב- 3B איור) מן הבריכה הכולל של RNA ("קלט" ב- 3B איור). הכמות של RNA המתקבל עם ברו-IP 40 µg החל החומר משתנה בין שורות תאים שונים, אנו בדרך כלל להשיג 500 בקירוב ng מתאי HEK293T, אבל רק 10-50 ng מתאי הלה. PLK-2 עיכוב גרמה עלייה α-synuclein mRNA הקלט והן ברו-IP (איור 3B) המציעה כי העלייה במדינה יציב ש-RNA נגרמת על ידי עלייה סינתזה של RNA. כדי להבטיח כי PLK-2i לא רק לגרום לעלייה הכוללת בייצור ה-RNA, היו 3 גנים אנדוגני נוספים (ACTB, HMBS ו- NADH) הנמדד (איור 4). גם הגנים האלה היה גדל קלט (איור 4A), ברו-IP (איור 4B) על טיפול PLK-2i.
כדי לאמת את ייחודה של ברו-IP, נכללה פקד עם תאים שאינם-ברו מטופלים. רמות 18sRNA נתפס על ידי ברו-IP מתאי שטופלו ברו ולא טופלו הושוו (איור 5). זה מדגים בבירור כי ברו-IP ספציפי מאוד, מכסה רק חלק קטן מאוד של RNA שאינו מתויג (איור 5).
כי הרנ א מתויג ברו מיוצר רק בתוך 1 h, חשוב לבחור גן התייחסות נכונה, מאז כמה גנים מתאימים בדרך כלל עשוי להתבטא בריכוז נמוך מדי כדי להיות אמינה. 18sRNA נבחר גן הפניה עבור הנתונים שהוצגו ב- 3B איור , איור 4 בגלל שפע גבוהה. מספר גנים התייחסות, עם זאת, נבדקו, והראה כמה מחזורים סף גבוה (> 30) (איור 6). נתונים אלה גם מדגים כי ההבדל בין מתויג ברו IP'ed RNA ו- RNA הכולל בקלט הוא כ 5 של Ct וכמה RNAs הביע-כמות נמוכה בתא אולי לכן לא כראוי יזוהו בעקבות ברו-IP.
איור 1: תיאור של ברו-IP לחקירה של סינתזת RNA. (א) RNA הוא עיבד בתאים מ- DNA על ידי RNA polymerases. (B) על תוספת התקשורת, ברו הוא נלקח על ידי תאים, שולבו את הרנ א לאחרונה משועתקים. (ג) למדידת שיעורי סינתזה RNA: RNA (1) לאחרונה מסונתז מתויג לשעה עם ברו, רנ א (2) מופק התאים מיד לאחר תוויות, רנ א (3) ברו מתויג היא immunoprecipitated באמצעות נוגדנים anti-ברו, (4) ברו מתויג ( תואם קלט) RNA הוא נותחו על ידי RT-qPCR או רצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הערכה של תוויות הזמן. דוגמה הערכה ראשונית של זמן labelling ברו. תאים AsPC-1 גדל במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בתוספת סרום שור עוברית 10% ו- 50 U/mL / 50 µg/mL פניצילין/סטרפטומיצין שטופלו ברו-ריכוז סופי של 2 מ מ 0, 1, 2, ו- 4.5 h לפני החילוץ-RNA וניתוח לפי RT-qPCR. נתונים הוא לכמת כמו 2-Ct, מוצג הממוצע של סטיית תקן ± triplicates טכניים, n = 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג תוצאות מציג קלט הרנ"א ברו-IP דימתיל סולפוקסיד ו PLK-2i מטופלים תאים. 1 h (א) וטיפול ברו 4 h 2 מ מ לא לגרום שינויים מורפולוגיות גלויים בתאים HEK293T. סרגל קנה מידה = 100 Adapted איור מיקרומטר. (B) הפניה1. התאים HEK293T 3,500,000 היו נזרע לכל מנה ס מ-10, transfected עם פלסמיד לבטא α-synuclein 24 שעות לאחר זריעה. h 24 שעות ביממה פוסט תרביות תאים תאים היו מודגרות לשעה עם ברו בנוכחות דימתיל סולפוקסיד או PLK-2i, ואחריו החילוץ-RNA, ברו-IP. ניתוח של RNA נעשה על ידי RT-qPCR באמצעות ערכות בדיקה מכוונת נגד SNCA האנושית (α-synuclein), 18sRNA. ברו-IP קלט SNCA הייתה לכמת ביחס ברו-IP, קלט 18sRNA, בהתאמה, שימוש בשיטת-ΔΔCT 2. התוצאות היו מנורמל ל הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד. הנתונים מוצגים סטיות תקן ± רשע. השוואות סטטיסטי בוצעו באמצעות אינטראקצית t-test הסטודנט, * p < 0.001, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מדידה של גנים אחרים לא השתנה על-ידי PLK-2i. PLK-2i משנה גם את סה כ ולא מסונתז RNA של ACTB, HMBS ו- NADH. (א) ACTB, HMBS ו- NADH RNA של קלט היו נמדדים שהפקידים בניסוי אחד, לכמת ביחס 18sRNA ב Input בשיטת-ΔΔCT 2. הערכים היו מנורמל ל הדגימות דימתיל סולפוקסיד מטופלים, העמודות מייצגות ממוצע של סטיות תקן ± triplicates, n = 1. (B) ACTB, HMBS ו- NADH היו גם למדוד את הרנ א ברו-IP'ed, לכמת ביחס 18sRNA ב ברו-IP. הערכים היו מנורמל ל דימתיל סולפוקסיד והציג כמו A, n = 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ייחודה של ברו-IP- לשם השוואה של 18sRNA נתפס על ידי ברו-IP מתאי ברו - ו שאינם ברו-מטופלים, RNA של ברו-IP מאומת יחסי הקלט RNA להביא בחשבון הבדלים החל חומר, מנורמל להלן כדי דגימות שטופלו ברו. רק חלק קטן מאוד (0.002) של הלא-ברו-מתויג 18sRNA היה immunoprecipitated, הוכחת כי ברו-IP הוא ספציפי מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: רמות של mRNAs שונים ב- RNA ברו-IP בהשוואה ל- RNA קלט. מספר גנים התייחסות פוטנציאליים נבדקו כי כמה RNAs יהיה נוכח בריכוזים מאוד נמוכים ברו-IP RNA בשל כמויות קטנות של RNA שהופק במסגרת האחד עשר ברו טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש ברו-IP עבור נחישות של RNA הייצור על ידי תוויות של לאחרונה לייצור RNA 1 h עם ברו, ואחריו פינוי מיידי של RNA ו- immunoprecipitation של RNA מתויג ברו. שיטה זו שתיארנו קודם לכן ההפניה16, מאמר זה מכיל שלבים נוספים להגברת IP ירידה לפרטים וטוהר RNA, על ידי חרוזים מראש לטיפול עם ריכוזים נמוכים של ברו, כמו גם צעד פנול-כלורופורם טיהור להגדיל את טוהר RNA בעקבות ה-IP. בנוסף, אנו מציגים גם נתונים כאן הפגנת יחודיות של ברו-IP על-ידי השוואת את הרנ א שנלקחו ברו וברו מטופלים תאים. טיהור פנול-כלורופורם הוא זול, אך בהתחשב בכמויות נמוכות של RNA עם ברו, אותות מוגברת בניתוח במורד הזרם אולי ניתן להשיג באמצעות ערכות ניקיון RNA במקום. הניסיון שלנו הוא, עם זאת, החילוץ הכי שווה של RNA מדגמים מתקבל באמצעות פנול-כלורופורם טיהור.
Labelling ברו - IP הם, בניגוד ניתוח הכולל רמות ה-RNA, המסוגלת לחקור את הגורמים הבסיסיים של שינויים ברמות מצב יציב RNA. השיטה לא או מוגבלת אפקטים על פיזיולוגיה של התא, בניגוד לשימוש של מעכבי תעתיק כזה כמו אמניטין α ו- d ואקטינומיצין יש סוברים כי השוואה של RNA לאחרונה מסונתז רמות מצב יציב יכול לשמש כדי לחשב את ה-RNA דעיכה המחירים17, השיטה ברו-IP המתוארים כאן מאפשר נחישות סימולטני של סינתזת RNA וגם להירקב בתוך אחד וזמינותו.
איור 5, אנחנו הראו כי ה-RNA הוא שרק IP'ed מברו מטופלים תאים, המראים כי אכן ברו שולבו את הרנ א בקו התא המשמש כאן. עם זאת, אנו ממליצים ביצוע מבחן הראשונית של ברו השתלבות RNA בשורות תאים אחרים לפני ביצוע ברו-IP. אפשר, למשל, ניתן לעשות זאת באמצעות נוגדנים anti-ברו לכמת ברו ב הכולל תמציות RNA באמצעות נקודה כתם או מקושרים-אנזים immunosorbent assay.
כאן לא הוצגו מבחן של יעילות ברו-IP מדגמים, אבל זה יכול ייחקרו באמצעות דוקרנים מתויג ברו RNA שהופק גם במבחנה או אורגניזם אחר, כגון melanogaster דרוזופילה. RNA הזה יכול לשמש לאחר מכן גם quantifications במורד הזרם, normalizations.
טכניקות pipetting הנכון חיוני בעת ביצוע מבחני כמותיים מאוד רגיש, כגון ברו-IP ו- RT-qPCR, מאמץ מיוחד צריך להיעשות כדי לבצע pipetting שווה מדגמים. הקוד שיחולץ פנול-כלורופורם דורש קצת ניסיון, אבל על pipetting משביעת רצון, שלבי מימית, פנול/כלורופורם יכול להיות מעורב מחדש, centrifuged שוב.
פרוטוקול זה מרמז ברו-תוויות עבור 1 h כאשר מודדים את סינתזת RNA. הפעם labelling מאפשר הערכה גסה של שינויים שעתוק, מאז הרוב המכריע של האדם ושל עכברים mRNAs יש כבר ההערכה יש זמן מחצית החיים > 6 h18,19. זהירות כדאי, עם זאת, ניתן לממש כאשר לפרש את הנתונים שהתקבלו, שכן RNAs רבים יש מחצית החיים < 1 h18,19, כגון מספר תעתיקים שנגזרות ליפיד A, אשר במהירות להגדיל על גירוי, מסרב לחזור רמות קו הבסיס בתוך שעתיים לאחר אינדוקציה20. כדי להקטין את הסיכון של השפעות מן הרנ א השפלה, הפעם labelling ברו הניתנות להפחתה, עם זאת, זה גם חשוב לה תווית RNA מספיק כדי להיות מסוגל להבחין RNA מתקבל על ידי ברו-IP מהרקע (אשר הושג לאחר 1 h labelling ב (הידיים שלנו איור 2)). אפשרות נוספת היא למדוד את סינתזת RNA והן דעיכה של הגן עניין באמצעות תוויות-ברו ו- IP, השיטה השנייה היא שמתואר2. הנתונים של שתי גישות אלה משלימים אחד את השני, אם בשינוי סינתזה בין שני תנאים נמדד אך אין שינוי נראה ב הניוון, ניתן להסיק שמקדם כי השינויים נמדד ב- RNA היו בהתאם לתקנה של סינתזה. עם זאת, חשוב לזכור כי בשתי הטכניקות רק למדוד RNA פונקציונליות על ידי הערכת רמות ה-RNA להזניח לגמרי לחקור מנגנונים אחרים המשפיעים על RNA פונקציות כגון שינויים כימיים14.
מאז התאים מודגרת עם ברו לשעה בלבד, mRNAs המיוצר לאט מאוד יכול להיות קשה למדוד באמצעות השיטה ברו-IP. זוהי נקודה אחת איפה השימוש של מעכבי תעתיק אמניטין α ו ואקטינומיצין D יכול להיות מועדף על ברו-IP, עם זאת, הם יכולים רק לשמש כדי למדוד שינויים השפלה ולמדוד ישירות ייצור RNA. רמות נמוכות של RNA מתויג ברו ניתן גם להתגבר על ידי הגדלת זמן הדגירה עם ברו, למרות, זמן הדגירה פעמים להגביר את הסיכון של השפעות על ידי RNA השפלה. במקרה הזה, זה כבר לא ניתן לדעת אם שינויים ב- RNA מתויג ברו נגרמים שינויים ייצור RNA או ריקבון.
בדוגמה זו, ניתוח במורד הזרם של הרנ א שנתפסו מתויג ברו מתבצעת באמצעות RT-qPCR, עם זאת, הדור הבא רצפי היא גם בשימוש נרחב במורד הזרם שיטת למסך לשינויים בבריכה גדולה של RNAs2,13. באופן דומה, השיטה אינה מוגבלת ניתוח של mRNAs, אך ייתכן לנתח כל סוגי RNAs2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
קרן לונדבק, אוניברסיטת ארהוס, Dandrite, לונדבק יצוק תמיכה עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
