Summary
Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van RNA-synthese. 5-Bromouridine is toegevoegd aan de cellen en opgenomen in gesynthetiseerde RNA. RNA-synthese wordt gemeten door RNA extractie onmiddellijk na de etikettering, gevolgd door 5-Bromouridine-gerichte immunoprecipitation van gelabelde RNA en analyse door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve polymerase-kettingreactie.
Abstract
Steady-state RNA niveaus zijn vergelijking tussen de twee voorwaarden, is het niet mogelijk om te onderscheiden of wijzigingen worden veroorzaakt door wijzigingen in de productie of degradatie van RNA. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van RNA productie, met 5-Bromouridine etikettering van RNA gevolgd door immunoprecipitation, waarmee onderzoek van RNA gesynthetiseerd binnen een korte termijn (bijvoorbeeld, 1 h). Het voordeel van 5-Bromouridine-etikettering en immunoprecipitation over het gebruik van giftige transcriptionele-remmers, zoals α-amanitine en actinomycin D, is dat er geen of weinig gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen tijdens kortstondig gebruik. Omdat 5-Bromouridine-immunoprecipitation alleen RNA geproduceerd binnen de korte etikettering vastlegt, langzaam geproduceerd, evenals snel gedegradeerd kan RNA echter moeilijk te meten door deze methode. De 5-Bromouridine-geëtiketteerd RNA gevangen genomen door 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan worden geanalyseerd door omgekeerde transcriptie, kwantitatieve polymerase-kettingreactie, en de volgende generatie sequencing. Alle soorten RNA kunnen worden onderzocht, en de methode is niet beperkt tot het meten van de mRNA zoals in dit voorbeeld wordt gepresenteerd.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) maakt de studie van RNA productie in cellen met geen of zeer beperkte effecten op cel fysiologie tijdens de briefing etikettering van periode1,2. De methode berust op de opname van de afgeleide van de synthetische uridine BrU in nieuw samengestelde RNA gevolgd door IP van gelabelde RNA met anti-BrU antilichamen (Figuur 1).
Het is al bekend voor decennia die eiwitsynthese transcriptionally kan worden geregeld, en het bestaan van transcriptiefactoren was meer dan 50 jaar geleden hypothetische3. Vandaag, het is bekend dat verschillende ziekten worden veroorzaakt door disregulatie van transcriptie en RNA stabiliteit (aanvullende figuur S1 in referentie4), en de mogelijkheid voor het meten van veranderingen in RNA productie is van groot belang in het begrip ziekte ontwikkeling.
Aan de andere kant, bieden tools voor het regelen van RNA productie nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van ziekten veroorzaakt door te weinig of te veel eiwit expressie, of ophoping van eiwitten zoals in ziekte Parkinson's (PD). De overheersende eiwit zich ophopen als onoplosbare aggregaten in PD is α-synuclein, en het niveau van α-synuclein is direct gekoppeld aan de ziekte, zoals gene vermenigvuldiging van de α-synuclein-gen familiale PD-5 veroorzaakt. Bovendien, α-synuclein aggregaten in een concentratie afhankelijke wijze. Downregulatie van α-synuclein mRNA niveaus is dan ook een interessante therapeutische strategie, die met succes met behulp van RNA-interferentie geboekt te verlagen van neuronale cel verlies in PD knaagdier modellen6,7.
Het is belangrijk om het meten van de veranderingen in de productie van RNA veroorzaakt door ziekte of therapeutische ingrepen te kunnen. State of the art methoden voor meten steady-state niveaus van RNA, zoals omgekeerde transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR), zijn niet in staat zijn onderscheid te maken tussen wijzigingen veroorzaakt door transcriptionele verordening of gewijzigd RNA stabiliteit. Een veel gebruikte methode voor het onderzoek van RNA verval tarieven is het blokkeren van de transcriptionele machine met behulp van verbindingen zoals α-amanitine of actinomycin D gevolgd door metingen van de rottende RNAs. Er zijn echter enkele problemen in verband met een totale blokkade van transcriptie in cellen, zoals inductie van apoptosis8,9. Naast de cytotoxische effecten presenteren transcriptionele remmers ook verschillende technische problemen, zoals trage cellulaire verbreiding van α-amanitine en gebrek aan specificiteit van actinomycin D (herzien in verwijzing10).
Om te voorkomen dat de totale blokkade van transcriptie, zijn nucleotide analogen gebruikt, zoals 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) en BrU. Deze zijn gemakkelijk in beslag genomen door de cellen van zoogdieren en opgenomen in de nieuw samengestelde RNA, waardoor pulse-etikettering van RNA binnen een bepaald tijdsbestek. BrU is minder toxisch dan 5-EU- en 4-TU, waardoor het de voorkeur analogon van keuze11,12.
BrU-IP kan worden gebruikt om de onderzoeken van zowel het tarief van de RNA-synthese en stabiliteit, en dus onderscheid worden gemaakt tussen de onderliggende oorzaken van veranderingen in de totale RNA. Dit artikel zal zich richten op de meting van RNA-synthese en verwijst als u verwijst naar de2 voor meer informatie over het onderzoek van RNA stabiliteit. Om te onderzoeken RNA-synthese, worden de cellen kort geëtiketteerd met BrU bv voor 1 h gevolgd door BrU-IP-1 (Figuur 1 c). Hierdoor kunnen metingen van RNA gesynthetiseerd in de korte tijd van de etikettering en waargenomen wijzigingen zal een betere raming van de verordeningen in RNA synthese dan door het meten van veranderingen in totaal RNA door RT-qPCR. Dient te worden vermeld, echter, dat hoewel de etikettering tijd, bijvoorbeeld, slechts 1 h is, afbraak nog steeds een invloed op de waargenomen niveaus van RNA hebben kan.
RNA van BrU-IP experimenten zijn geschikt voor downstream analyse door zowel de RT-qPCR1 of de volgende generatie sequencing-2,13. Andere standaard RNA detectiemethoden, zoals het noordelijke bevlekken of ribonuclease bescherming assay, kunnen ook gelden voor bepaalde RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle stappen bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld en houden van buffers op ijs of in de koelkast (met uitzondering van de elutie van de buffer waarin SDS). Het protocol is verdeeld in 5 secties: voorbereiding van RNA monsters; voorbereiding van kralen voor IP; binding van BrU-gelabelde RNA aan kralen; elutie en zuivering van afhankelijke BrU-gelabelde RNA door 3 stappen fenol-fenol/chloroform-chloroform extractie; analyse van RNA (in dit voorbeeld met behulp van RT-qPCR)
1. bereiding van de monsters van RNA
- Graaf HEK293T cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller en zaad van 3,500,000 cellen in een petrischaal 10 cm in 10 mL groei media (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 50 µg Mo/mL penicilline/streptomycine) voor een totaal van > 40 µg RNA na extractie 48 uur later. Houden cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- 48 uur na het zaaien, 8 mL groei media gecombineerd en 2 mL achterlaten om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Voeg 2 mM BrU en elke behandeling om de 8 mL aanzuiging groei media, en de resterende 2 mL uit de cellen te verwijderen alvorens het opnieuw toepassen van de 8 mL BrU met groei media. Vermijd het gebruik van nieuwe media op verzoek van de BrU op de cellen, aangezien dit leiden wijzigingen in genexpressie tot kan.
- Incubeer de cellen gedurende 1 uur met BrU en behandeling. Wassen van de cellen in 5 mL Henks buffer en trypsinize van de cellen met behulp van 2 mL 0,05% trypsine. 8 mL groei media zet de reactie stop, de cellen overbrengen in een tube van 15 mL en spin down de cellen gedurende 2 minuten op 1000 x g toevoegen.
- Verwijder het supernatant en totaal RNA uittreksel uit de pellet van de cel met behulp van een RNA-isolatie kit (Zie Tabel van materialen) of enige andere methode de voorkeur, en elueer in RNase-vrije H2O. winkel de RNA-80 ° c tot klaar om verder te gaan.
2. voorbereiding van kralen voor IP
- Kralen in batches voorbereiden op het aantal monsters worden onderzocht plus één extra ter compensatie van verlies tijdens pipetteren en dwarrelen mengen. Resuspendeer anti-muis IgG magnetische kralen grondig door het mengen van de werveling en neem uit 20 µL kralen per monster in een tube 1,5 mL RNase-vrij. Plaats de buis 1,5 mL in een magnetische standaard en laat ongeveer 20 s voor de kralen te verzamelen aan de kant.
- Verwijder het supernatant, nemen de buis van de magnetische standaard en resuspendeer in 400 µL 1 x BrU-IP buffer door pipetteren. Draai de buis kort voor 2 s in een centrifuge tafelblad, plaatst u deze terug in de magnetische standaard en verwijder het supernatant. De wassen stap eenmaal herhaald.
- Blok aspecifieke binding aan de parels met behulp van heparine. Resuspendeer de kralen in 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparine buffer en laat draaien voor 30 min. Wash de kralen eens, zoals in stap 2.2.
Opmerking: Heparine is een negatief-geladen polymeer, die met RNAs voor een inbinding concurreren zal. tRNA of andere irrelevante RNAs kunnen ook worden gebruikt als de downstream toepassing is niet sequencing. - Resuspendeer de kralen in 1 mL 1 x BrU-IP buffer en 1,25 µg/monster anti-α-Bromodeoxyuridine antilichaam, die herkent ook BrU toe te voegen. Incubeer de kralen voor 1 h terwijl het draaien of overnachting bij kamertemperatuur.
- Wassen van de kralen driemaal zoals in stap 2.2. Resuspendeer de kralen in 50 µL/monster 1 x BrU-IP buffer aangevuld met 1 mM BrU en laat draaien voor 30 min te verlagen van de gevoeligheid van het antilichaam gebonden aan de kralen en hierbij het risico van aspecifieke bindende onderzoektijdvak.
- Wassen van de kralen driemaal zoals in stap 2.2 en resuspendeer in 50 µL/monster 1xBrU-IP-buffer.
3. bindende van BrU-gelabelde RNA aan kralen
- RNA concentraties in RNA extracten van stap 1.3 meten met behulp van UV-zichtbaar spectrofotometrie, en 40 µg RNA van elk monster in RNase-vrije H2O tot een totaal volume van 200 µL verdunnen.
- Verwarm RNA monsters gedurende 2 minuten bij 80 ° C tot het denatureren van RNA en spin kort in een tafelblad centrifuge. Voeg 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse remmer.
- Voeg 50 µL geresuspendeerde en kralen uit stap 2.6 aan elk monster bereid en laat draaien 1 h. Wash de kralen viermaal zoals in stap 2.2.
4. elutie en zuivering van RNA door 3 stappen fenol-fenol/Chloroform-chloroform extractie
-
Elueer RNA en fenol extractie uit te voeren
- Resuspendeer de kralen in 200 µL elutie buffer Elueer van RNA, en snel daarna voeg 200 µL fenol, pH 6.6 (Let op: giftig, zie opmerking hieronder stap 4.1.2) te verwijderen van een niet-RNA-moleculen uit het monster.
- Werveling mix het monster, en spin 3 min op 25.000 x g in een tafelblad centrifuge.
Opmerking: Fenol is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast dragen van bescherming van de huid. De licht zure pH-waarde zorgt ervoor dat alleen RNA en DNA niet, wordt gewonnen. Het RNA blijft in de bovenste waterfase het hydrofiele karakter van kosten. De hydrofobe kernen van eiwitten zal binden van fenol en verplaatsen naar de lagere biologische fenol-fase.
-
Uitvoeren van fenol-chloroform extractie
- Gecombineerd zoveel Opper-fase mogelijk (ongeveer 190 µL van de 200 µL, afhankelijk van ervaring in behandeling) en verplaats het naar een buis met 200 µL fenol/chloroform, pH 6.6 (Let op: giftig, zie opmerking). Zorg ervoor dat hetzelfde bedrag in verschillende steekproeven gecombineerd.
- Werveling Meng het monster en de spin voor 3 min op 25.000 x g.
Opmerking: Chloroform is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast dragen van bescherming van de huid. Chloroform wordt toegevoegd aan het verwijderen van fenol, die kan invloed hebben op de downstream-analyse van RNA door remming van omgekeerde transcriptie14 en polymerase kettingreactie15.
- Chloroform extractie uit te voeren door het aspirating van de bovenste waterfase als vóór (nu ongeveer 180 µL) en overbrengen in een buis met 200 µL chloroform. Werveling Meng het monster en spin 3 min op 25.000 x g.
- De bovenste waterfase als vóór (nu ongeveer 170 µL) gecombineerd en overbrengen naar een buis met 17 µL (1/10 volume) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Toevoegen om te neutraliseren en RNA precipiteren uit de waterige oplossing, 2 µL glycogeen (20 mg/mL), die samen met RNA precipitaten en de RNA-pellet zichtbaarder maakt.
- Voeg toe 500 µL 96% ethanol te verhogen van binding tussen de zout ionen en RNA en meng door het omkeren van de buis een paar keer. Laat de buis 's nachts bij-20 ° C of 15 min op droog ijs.
- Draai het monster bij 25.000 x g, 4 ° C gedurende 30 min. Discard bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en wassen van de pellet in 185 µL 75% ethanol te verwijderen van alle resterende zout. Draaien op 25.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Vloeistof wordt weggeworpen volledig zonder de pellet te verstoren en laat de pellet te drogen van 5-10 minuten met een open deksel. Resuspendeer in 10 µL RNase-vrije H2O toegepast aan de kant van de buis om te voorkomen dat de pellet te verstoren.
5. analyse van RNA
- Bereiden van cDNA met behulp van een omgekeerde transcriptie van cDNA kit (Zie Tabel van materialen) of een andere voorkeur methode met behulp van 2 µL RNA steekproef en totaal RNA van 1 µg gist als drager RNA voor de cDNA synthese reactie (niet gebruikt als cDNA wordt gebruikt voor het rangschikken van volgende generatie). Gebruik 1 µg RNA zonder gist RNA voor cDNA voorbereiding van overeenkomstige input.
- Verdunde cDNA 1:25 en mix de cDNA 9 µL verdund met 10 µL qPCR Master mix en 1 µL fluorogenic sonde, beide opgegeven in de Tabel van materialen.
Opmerking: De cDNA verdunning hangt de cDNA voorbereiding en qPCR methode die wordt gebruikt. - Voer het volgende qPCR-programma (bijvoorbeeld op een 7500 snel Real-time PCR-systeem of gelijkwaardige): 2 min bij 50 ° C, 20 s bij 95 ° C, 40 cycli van 3 bij 95 ° C en 30 s s bij 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze eerste tests van BrU-etikettering tijd werden uitgevoerd in de cellen van de AsPC-1. De cellen werden behandeld met BrU voor 0, 1, 2 en 4.5 h, gevolgd door de totale RNA extractie en BrU-IP. GAS5 en GAPDH werden gemeten in BrU-IP RNA, die aangetoond dat 1 h etikettering voldoende was om het bereiken van een ongeveer 9 - en 44 keer verandering in vergelijking met achtergrond (0 h) voor GAPDH en GAS5, respectievelijk.
BrU-IP en de analyse hierboven beschreven werden gebruikt om te onderzoeken of de wijzigingen ontdekt in stabiele toestand niveaus van α-synuclein mRNA van Polo-achtig kinase 2 (PLK-2) remming werden veroorzaakt door wijzigingen in mRNA synthese1. Een etikettering tijd van 1 h werd gekozen omdat dit voldoende etikettering in vergelijking met achtergrond (Figuur 2 biedt) en maakt het ook mogelijk de behandeltijd gevolgen kunnen hebben. 2 mM BrU behandeling heeft geen morfologische wijzigingen in HEK293T cellen voor 1 h of de langere 4 h behandeling (figuur 3A) veroorzaken.
Α-Synuclein transfected cellen werden behandeld voor 1 h met DMSO of een specifieke PLK-2-remmer (PLK-2i) in aanwezigheid van BrU om vers gesynthetiseerde RNA label HEK293T. Cellen zijn hierna geoogst en totaal RNA is uitgepakt. BrU-gelabelde RNA geproduceerd binnen de 1U behandeling werd verzameld met behulp van BrU-IP ("BrU-IP" in figuur 3B) van de totale pool van RNA ('Input' in figuur 3B). Het bedrag van RNA verkregen met BrU-IP 40 µg grondstof varieert tussen verschillende cellijnen, en we krijgen over het algemeen ongeveer 500 ng van HEK293T cellen, maar slechts 10-50 ng van HeLa cellen. PLK-2 inhibitie veroorzaakt een toename van α-synuclein mRNA in zowel de invoer als BrU-IP (figuur 3B) suggereren dat de verhoging in de steady-state die RNA wordt veroorzaakt door een toename van de synthese van RNA. Gemeten om ervoor te zorgen dat de PLK-2i veroorzaakt geen enkel een algehele toename in RNA productie, 3 extra endogene genen (ACTB, HMBS en NADH) waren (Figuur 4). Geen van deze genen werd verhoogd in de Input (figuur 4A) en BrU-IP (figuur 4B) op PLK-2i behandeling.
Voor het valideren van de specificiteit van de BrU-IP, was een controle met non-BrU behandeld cellen opgenomen. De niveaus van 18sRNA gevangen door BrU-IP van BrU-behandeld en onbehandeld cellen werden vergeleken (Figuur 5). Dit toont duidelijk aan dat de BrU-IP zeer specifiek is en slechts een zeer klein deel van de niet-gelabelde RNA (Figuur 5 vangt).
Omdat de BrU-gelabelde RNA is alleen geproduceerd binnen 1 uur, is het belangrijk om te kiezen van een goede referentie-gen, aangezien sommige normaal geschikt genen kunnen worden uitgedrukt in ook lage concentraties betrouwbaar. 18sRNA werd gekozen als een referentie-gen voor de gegevens in figuur 3B en Figuur 4 vanwege haar hoge overvloed. Meerdere referentie genen werden, nochtans, getest, en sommige toonde hoge drempel cycli (> 30) (Figuur 6). Deze gegevens toont ook aan dat het verschil tussen BrU-gelabelde IP'ed RNA en totaal RNA bij het invoeren van de gegevens ongeveer 5 is Ct's en sommige RNAs uitgedrukt tegen lage bedragen in de cel kunnen daarom niet correct gedetecteerd na BrU-IP.
Figuur 1: beschrijving van BrU-IP voor onderzoek van RNA-synthese. (A) RNA wordt omgezet in cellen van DNA door RNA-polymerase. (B) na toevoeging aan de media, BrU is in beslag genomen door cellen en opgenomen in de nieuw getranscribeerde RNA. (C) voor het meten van RNA synthese tarieven: (1) nieuw samengestelde RNA is geëtiketteerd voor 1 h met BrU, (2) RNA wordt gewonnen uit de cellen direct na etikettering, (3) BrU-geëtiketteerd RNA is immunoprecipitated met anti-BrU antilichamen, (4) BrU-geëtiketteerd (en overeenkomend input) wordt RNA geanalyseerd door RT-qPCR of volgorde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beoordeling van etikettering tijd. Voorbeeld van een initiële beoordeling van BrU-etikettering tijd. AsPC-1 cellen gekweekt in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 50 U/mL / 50 µg Mo/mL penicilline/streptomycine werden behandeld met BrU op een eindconcentratie van 2 mM voor 0, 1, 2 en 4.5 h voor RNA extractie en analyse door RT-qPCR. Gegevens wordt gekwantificeerd als 2-Ct, en wordt gepresenteerd als het gemiddelde van technische triplicates ± standaardafwijking, n = 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve resultaten tonen van Input en BrU-IP RNA van DMSO en PLK-2i behandeld cellen. (A) 1 h en 4 h 2 mM BrU behandeling deed niet elke zichtbaar morfologische veranderingen bij HEK293T cellen veroorzaken. Schaal bar = 100 µm. (B) aangepast figuur van referentie1. 3,500,000 HEK293T cellen werden zaadjes per 10-cm schotel en transfected met een plasmide uiten van de α-synuclein 24 h na het zaaien. 24 h post transfectie cellen werden geïncubeerd voor 1 h met BrU in aanwezigheid van DMSO of PLK-2i, gevolgd door RNA extractie en BrU-IP. Analyse van RNA werd gedaan door RT-qPCR met behulp van sonde sets gericht tegen menselijke SNCA (α-synuclein) en 18sRNA. BrU-IP en Input SNCA werd gekwantificeerd ten opzichte van BrU-IP en Input van 18sRNA, respectievelijk, de 2-ΔΔCT -methode. Resultaten waren genormaliseerd naar de monsters van DMSO-behandeld. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van Student ongepaarde t-test, * p < 0.001, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: meting van andere genen niet gewijzigd door PLK-2i. PLK-2i verandert noch de totale noch gesynthetiseerde RNA van ACTB, HMBS en NADH. (A) ACTB, HMBS, NADH RNA van input werden gemeten in drievoud in één experiment en gekwantificeerd ten opzichte van 18sRNA in de Input aan de hand van de 2-ΔΔCT -methode. Waarden zijn genormaliseerd naar de monsters DMSO behandeld en staven gemiddelde van triplicates ± standaardafwijking; n = 1. (B) ACTB werden, HMBS, NADH ook gemeten in de BrU-IP'ed-RNA en gekwantificeerd ten opzichte van 18sRNA in de BrU-IP. Waarden zijn genormaliseerd naar DMSO en weergegeven als in A, n = 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: specificiteit van BrU-IP. Voor de vergelijking van de 18sRNA gevangen genomen door BrU-IP van BrU - en niet-BrU-behandelde cellen, was RNA van BrU-IP gevalideerd ten opzichte van Input RNA ter verantwoording voor verschillen in grondstof en hierna genormaliseerd naar monsters BrU-behandeld. Slechts een zeer klein deel (0.002) van niet-BrU-gelabelde 18sRNA was immunoprecipitated, waaruit blijkt dat de BrU-IP zeer specifiek is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: niveaus van verschillende mRNAs in BrU-IP RNA t.o.v. Input RNA. Meerdere mogelijke verwijzing genen werden getest omdat sommige RNAs aanwezig in zeer lage concentraties in BrU-IP RNA als gevolg van kleine hoeveelheden geproduceerde RNA binnen de 1 h BrU behandeling zal zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol bevat een beschrijving van het gebruik van BrU-IP voor bepaling van RNA productie door etikettering van nieuw RNA voor 1 h met BrU geproduceerde, gevolgd door onmiddellijke RNA extractie en immunoprecipitation van BrU-gelabelde RNA. Deze methode is eerder beschreven in referentie16en dit artikel bevat enkele extra stappen ter verbetering van de specificiteit van de IP- en RNA zuiverheid, door vooraf behandelen kralen met lage concentraties van BrU, alsmede de zuivering van een fenol-chloroform om te RNA zuiverheid na IP vergroten Daarnaast presenteren we ook hier de specificiteit van de BrU-IP reeds is aangetoond door het vergelijken van het RNA gevangen van BrU en niet-BrU cellen behandeld. Fenol-chloroform zuivering is goedkoop, maar gezien de lage bedragen van RNA voorzien van BrU, verhoogde signalen in de downstream-analyse kunnen worden verkregen met behulp van RNA-opschonen kits in plaats daarvan. Onze ervaring is echter dat de hoogste gelijk extractie van RNA in verschillende steekproeven wordt verkregen met behulp van fenol-chloroform zuivering.
BrU-etikettering en -IP te zijn, in tegenstelling tot de analyse van de totale RNA niveaus, geschikt voor het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van veranderingen in de steady-state RNA. De methode heeft geen of beperkte effecten op celfysiologie, in tegenstelling tot het gebruik van transcriptionele remmers dergelijke als α-amanitine en actinomycin overleden Er is gesuggereerd dat de vergelijking van de nieuw samengestelde RNA tot steady-state niveaus kan worden gebruikt voor het berekenen van RNA verval tarieven17, en de hier beschreven methode van BrU-IP gelijktijdige bepaling van zowel de RNA-synthese en verval in één assay kunt.
In Figuur 5, we laten zien dat RNA dat alleen IP'ed van BrU behandeld cellen is, waaruit blijkt dat er inderdaad sprake is van BrU opgenomen in het RNA in de cellijn gebruikt hier. Wij stellen echter voor uitvoeren van een eerste test van BrU opneming RNA in andere cellijnen alvorens de BrU-IP uit te voeren. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren met behulp van anti-BrU antilichamen te kwantificeren BrU in totaal RNA extracten via stip vlek of de enzym-verbonden immunosorbent analyse.
Hier hebben we niet een test van BrU-IP-efficiëntie gepresenteerd in verschillende steekproeven, maar dit kan worden onderzocht met behulp van BrU-gelabelde spikes in RNA hetzij geproduceerd in vitro of van een ander organisme, zoals Drosophila melanogaster. Dit RNA kan dan ook worden gebruikt in de stroomafwaartse ondermeer en belangrijk.
Juiste pipetting technieken zijn cruciaal bij het uitvoeren van hooggevoelige kwantitatieve tests, zoals BrU-IP en RT-qPCR, en een bijzondere inspanning moet worden gemaakt voor het uitvoeren van gelijke pipetteren in verschillende steekproeven. De fenol-chloroform extracties vragen enige ervaring, maar op onbevredigende pipetteren, de waterige en fenol/chloroform fasen kunnen worden opnieuw gemengd en het weer gecentrifugeerd.
Dit protocol stelt BrU-etikettering gedurende 1 uur bij het meten van RNA-synthese. Ditmaal etikettering kan een ruwe schatting van wijzigingen in de transcriptie, aangezien de meerderheid van de mens en muizen mRNAs hebben geraamd dat half-life > 6 h18,19. Let op evenwel worden betracht bij de interpretatie van de gegevens verkregen, aangezien vele RNAs halfwaardetijd < 1 h18,19, zoals verschillende afschriften geïnduceerd door lipide-A, die snel vergroten op stimulatie en dalen terug naar honk-lijn niveaus binnen 2 uur na de inductie20. Te verlagen van het risico van invloeden uit de aantasting van het RNA, de tijd van BrU-etikettering kunnen worden verlaagd, maar het is ook belangrijk om voldoende RNA te kunnen onderscheiden van RNA verkregen door BrU-IP van de achtergrond (die werd verkregen na 1 h etikettering in onze handen (label Figuur 2)). Een andere optie is om zowel RNA-synthese en verval van het gen van belang met behulp van BrU-etikettering en IP te meten, de laatste methode wordt beschreven in2. De gegevens uit deze twee benaderingen vullen elkaar, en als een verandering in de synthese tussen twee voorwaarden wordt gemeten, maar geen verandering te in verval tarieven zien is, kan worden geconcludeerd dat de gemeten veranderingen in RNA te wijten aan de verordening van synthese waren. Het is echter belangrijk te onthouden dat beide technieken alleen RNA functionaliteit meten door de schatten van RNA niveaus en volledig verwaarlozing te onderzoeken van andere mechanismen die RNA functies zoals chemische wijzigingen14te beïnvloeden.
Aangezien de cellen worden ge¨ uncubeerd met BrU alleen 1 h, kan heel langzaam geproduceerde mRNAs worden moeilijk te meten met behulp van de methode van BrU-IP. Dit is een punt waar het gebruik van transcriptionele remmers zoals α-amanitine en actinomycin D zou voorkeur over BrU-IP, zij kunnen echter alleen worden gebruikt voor het meten van veranderingen in de afbraak en RNA productie niet direct te meten. De lage niveaus van BrU-gelabelde RNA kunnen ook worden overwonnen door het verhogen van de incubatietijd met BrU, echter lange incubatie keer verhogen het risico van invloeden door aantasting van het RNA. In dat geval is het niet mogelijk om te weten of de veranderingen in BrU-gelabelde RNA worden veroorzaakt door wijzigingen in RNA productie of verval.
In dit voorbeeld de stroomafwaartse analyse van de vastgelegde BrU-gelabelde RNA wordt uitgevoerd met behulp van RT-qPCR, volgende generatie sequencing is echter ook een veelgebruikt downstream methode naar scherm voor wijzigingen in een grote pool van RNAs2,13. Ook de methode is niet beperkt tot de analyse van mRNAs, maar alle soorten RNAs2kan analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Stichting Lundbeck, Universiteit van Aarhus, Dandrite en Lundbeck A/S ondersteund dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
