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Genetics

5-Bromouridine ्र और Immunoprecipitation का उपयोग कर आरएनए संश्लेषण की जांच

Published: May 3, 2018 doi: 10.3791/57056
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

Summary

इस विधि से आरएनए संश्लेषण का उपाय किया जा सकता है । 5-Bromouridine कोशिकाओं को जोड़ा और संश्लेषित आरएनए में शामिल किया गया है । आरएनए संश्लेषण तुरंत लेबलिंग के बाद आरएनए निष्कर्षण द्वारा मापा जाता है, उल्टे प्रतिलेखन और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा लेबलित आरएनए और विश्लेषण के 5-Bromouridine-लक्षित immunoprecipitation द्वारा पीछा किया.

Abstract

जब स्थिर राज्य आरएनए स्तर दो शर्तों के बीच तुलना कर रहे हैं, यह अंतर है कि परिवर्तन उत्पादन या आरएनए के क्षरण में बदलाव के कारण होते हैं कि भेद करने के लिए संभव नहीं है. यह प्रोटोकॉल आरएनए उत्पादन की माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है, immunoprecipitation द्वारा पीछा आरएनए के 5-Bromouridine लेबलिंग का उपयोग कर, जो एक छोटी समय सीमा के भीतर संश्लेषित आरएनए की जांच में सक्षम बनाता है (उदा., 1 ज) । α-amanitin और actinomycin डी जैसे विषैले transcriptional अवरोधकों के उपयोग पर 5-Bromouridine-लेबलिंग और immunoprecipitation का लाभ यह है कि अल्प अवधि के उपयोग के दौरान कोशिका व्यवहार्यता पर कोई या बहुत कम प्रभाव नहीं होते हैं । हालांकि, क्योंकि 5-Bromouridine-immunoprecipitation केवल लघु लेबलिंग समय के भीतर उत्पादित आरएनए कब्जा, धीरे के रूप में अच्छी तरह से उत्पादित के रूप में तेजी से नीचा आरएनए इस विधि द्वारा मापने के लिए मुश्किल हो सकता है. 5-Bromouridine-बला आरएनए 5 द्वारा कब्जा-Bromouridine-immunoprecipitation रिवर्स प्रतिलेखन, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । आरएनए के सभी प्रकार की जांच की जा सकती है, और विधि इस उदाहरण में प्रस्तुत किया जाता है के रूप में mRNA को मापने के लिए सीमित नहीं है ।

Introduction

5-Bromouridine (बरू) immunoprecipitation (आईपी) संक्षिप्त लेबलिंग अवधि1,2के दौरान सेल फिजियोलॉजी पर कोई या बहुत सीमित प्रभाव के साथ कोशिकाओं में आरएनए उत्पादन के अध्ययन की अनुमति देता है । विधि एंटी-बरू एंटीबॉडी (चित्रा 1) का उपयोग कर बला शाही आरएनए के आईपी द्वारा पीछा किया सिंथेटिक uridine व्युत्पंन बरू में नव संश्लेषित आरएनए के निगमन पर आधारित है.

यह दशकों के लिए जाना जाता है कि प्रोटीन संश्लेषण transcriptionally विनियमित किया जा सकता है, और प्रतिलेखन कारकों के अस्तित्व से अधिक ५० साल पहले की परिकल्पना की गई थी3. आज, यह ज्ञात है कि कई बीमारियों प्रतिलेखन और आरएनए स्थिरता के dysregulation की वजह से कर रहे हैं (पूरक आंकड़ा एस 4 संदर्भ में1, 2), और आरएनए उत्पादन में परिवर्तन को मापने की क्षमता रोग को समझने में बहुत महत्व का है विकास.

दूसरी ओर, आरएनए उत्पादन को विनियमित करने के लिए उपकरण बहुत कम या बहुत ज्यादा प्रोटीन अभिव्यक्ति, या पार्किंसंस रोग (पीडी) में जैसे प्रोटीन संचय की वजह से रोगों के इलाज के लिए नई संभावनाएं प्रदान करते हैं । प्रमुख प्रोटीन पीडी में अघुलनशील समुच्चय के रूप में जमते α-synuclein है, और α-synuclein के स्तर सीधे रोग से जुड़ा हुआ है, के रूप में α-synuclein जीन के जीन गुणा पारिवारिक पीडी5का कारण बनता है । इसके अलावा, एक एकाग्रता निर्भर तरीके से α-synuclein समुच्चय । Downregulation α-synuclein mRNA स्तरों इसलिए एक दिलचस्प चिकित्सीय रणनीति है, जो सफलतापूर्वक आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग करने के लिए पीडी मूषक में न्यूरॉन सेल नुकसान को कम करने के लिए प्राप्त किया गया है6,7.

यह या तो रोग या उपचारात्मक हस्तक्षेप की वजह से आरएनए उत्पादन में परिवर्तन को मापने के लिए सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसे रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) के द्वारा पीछा के रूप में, आरएनए के स्थिर राज्य स्तर को मापने के लिए कला विधियों के राज्य, transcriptional विनियमन के कारण परिवर्तन के बीच भेद करने में सक्षम नहीं हैं या बदल द्वारा आरएनए स्थिरता । आरएनए क्षय दरों की जांच के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि क्षय RNAs की माप के बाद α-amanitin या actinomycin डी के रूप में यौगिकों का उपयोग transcriptional मशीनरी के अवरुद्ध है. हालांकि, कुछ कोशिकाओं में प्रतिलेखन की एक समग्र रुकावट के साथ जुड़े समस्याओं, ऐसे apoptosis8,9की प्रेरण के रूप में कर रहे हैं । साइटोटोक्सिक प्रभाव के बगल में, transcriptional अवरोधकों को भी इस तरह के धीमी गति सेलुलर α-amanitin और actinomycin डी की विशिष्टता की कमी के रूप में कई तकनीकी मुद्दों, वर्तमान (संदर्भ में की समीक्षा की10) ।

प्रतिलेखन की समग्र रुकावट से बचने के लिए, न्यूक्लियोटाइड एनालॉग उपयोग किया गया है, जैसे 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), और बरू. ये आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा लिया और नव संश्लेषित आरएनए में शामिल कर रहे हैं, एक विशिष्ट समय-सीमा के भीतर आरएनए के पल्स लेबलिंग को सक्षम करने. बरू 5-यूरोपीय संघ और 4-टू से भी कम विषाक्त है, यह पसंद की पसंदीदा एनालॉग11,12बना रही है ।

बरू-आईपी आरएनए संश्लेषण और स्थिरता की दर दोनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह कुल आरएनए में परिवर्तन के अंतर्निहित कारणों के बीच भेद । इस अनुच्छेद आरएनए संश्लेषण की माप पर ध्यान दिया जाएगा और आरएनए स्थिरता की जांच पर विवरण के लिए2 संदर्भ को संदर्भित करता है । शाही सेना के संश्लेषण की जांच करने के लिए, कोशिकाओं के साथ बरू उदाहरण के लिए 1 एच बरू-आईपी1 (चित्रा 1C) के बाद के लिए संक्षेप में लेबल कर रहे हैं. यह छोटी लेबलिंग समय के भीतर संश्लेषित आरएनए के माप में सक्षम बनाता है और मनाया परिवर्तन आर सी-qPCR द्वारा कुल आरएनए में परिवर्तन को मापने की तुलना में आरएनए संश्लेषण में विनियमों का एक बेहतर अनुमान दे देंगे. हालांकि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि भले ही लेबलिंग समय है, उदाहरण के लिए, केवल 1 ज, क्षरण अभी भी आरएनए स्तर पर एक प्रभाव हो सकता है मनाया ।

बरू-IP प्रयोगों से आरएनए दोनों आरटी-qPCR1 या अगली पीढ़ी अनुक्रमण2,13द्वारा बहाव विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं । अन्य मानक आरएनए खोज विधियों, जैसे कि उत्तरी सोख्ता या ribonuclease संरक्षण परख, कुछ RNAs के लिए भी लागू हो सकता है ।

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Protocol

नोट: जब तक अंयथा न कहा गया हो और बर्फ पर या फ्रिज में (एसडीएस युक्त रेफरेंस बफर से छोड़कर) पर सभी चरणों का पालन करें । प्रोटोकॉल 5 वर्गों में विभाजित है: आरएनए नमूनों की तैयारी; आईपी के लिए मोतियों की तैयारी; मोतियों को बरू-बला आरएनए का बंधन; 3 चरणों द्वारा आबद्ध बरू-बला आरएनए का रेफरेंस और शुद्धिकरण phenol-phenol/क्लोरोफॉर्म-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण; आरएनए का विश्लेषण (RT-qPCR का उपयोग करके इस उदाहरण में)

1. आरएनए के नमूनों की तैयारी

  1. 10 मिलीलीटर वृद्धि मीडिया में एक 10 सेमी पेट्री डिश में एक स्वचालित सेल काउंटर और बीज ३,५००,००० कोशिकाओं का उपयोग कर HEK293T कोशिकाओं की गणना (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से पूरक 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और ५० µ g/mL पेनिसिलिन/streptomycin) की कुल प्राप्त करने के लिए > 40 µ जी आरएनए पर निष्कर्षण ४८ ज बाद में । ३७ ° c और 5% CO2पर कक्षों को बनाए रखें ।
  2. ४८ एच बोने के बाद, महाप्राण 8 मिलीलीटर विकास मीडिया और बाहर कोशिकाओं सुखाने से बचने के लिए 2 मिलीलीटर पीछे छोड़ दें । 8 एमएल aspirated ग्रोथ मीडिया में 2 एमएम बरू और किसी भी उपचार को जोड़ें, और 8 एमएल बरू युक्त ग्रोथ मीडिया को दोबारा लागू करने से पहले कोशिकाओं से अवशिष्ट 2 मिलीलीटर निकाल लें । कोशिकाओं को बरू के आवेदन पर ताजा मीडिया के उपयोग से बचें, क्योंकि यह जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन पैदा कर सकता है.
  3. बरू और उपचार के साथ 1 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन । 5 मिलीलीटर हांक के बफर में कोशिकाओं को धो लें और 2 मिलीलीटर ०.०५% trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं trypsinize । 8 मिलीलीटर वृद्धि मीडिया जोड़ें प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण, और 2 मिनट के लिए नीचे स्पिन कोशिकाओं १,००० एक्स जी में ।
  4. supernatant निकालें और सेल गोली से कुल आरएनए एक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) या किसी भी अन्य पसंदीदा विधि, और elute में RNase-free H2ओ. की दुकान पर आरएनए-८० ° c को आगे बढ़ने के लिए तैयार है जब तक.

2. आईपी के लिए मोतियों की तैयारी

  1. नमूनों की संख्या के लिए बैचों में मोती तैयार प्लस एक pipetting और मिश्रण के दौरान नुकसान के लिए खाते में अतिरिक्त जांच की जानी है । विरोधी माउस आईजीजी चुंबकीय मोती अच्छी तरह से चक्कर मिश्रण से reसस्पेंड और एक RNase मुक्त १.५ एमएल ट्यूब में नमूना प्रति 20 µ एल मोतियों बाहर ले । एक चुंबकीय स्टैंड में १.५ मिलीलीटर ट्यूब प्लेस और लगभग 20 एस मोतियों की ओर को इकट्ठा करने के लिए छोड़ दें ।
  2. supernatant निकालें, चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब बाहर ले, और ४०० µ l 1x बरू-IP बफर में pipetting द्वारा reसस्पैंड । एक तालिका शीर्ष केंद्रापसारक में 2 एस के लिए बहुत संक्षेप में ट्यूब स्पिन, यह चुंबकीय स्टैंड में वापस जगह है, और supernatant हटा दें । एक बार धुलाई कदम दोहराएं ।
  3. ब्लॉक विशिष्ट हेपरिन का उपयोग मोतियों को बाध्यकारी । 1 मिलीलीटर 1x बरू में मोतियों को पुनः निलंबित-आईपी + 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन बफर, और 30 मिनट के लिए घूर्णन छोड़ दो मोतियों को एक बार, के रूप में चरण २.२ में धो लो ।
    नोट: हेपरिन एक नकारात्मक शुल्क बहुलक है, जो बाध्यकारी के लिए RNAs के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे । बहाव आवेदन अनुक्रमण नहीं है, तो tRNA या अन्य अप्रासंगिक RNAs भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. 1 मिलीलीटर 1x बरू-IP बफर में मोतियों को पुनः निलंबित और १.२५ µ g/नमूना एंटी-α-Bromodeoxyuridine एंटीबॉडी, जो भी बरू पहचानता है. 1 ज के लिए मोतियों की मशीन घूर्णन करते हुए, या कमरे के तापमान पर रात भर ।
  5. २.२ चरण के रूप में तीन बार मोतियों को धो लें । ५० µ l/नमूना 1x बरू में मोतियों को फिर से स्थगित-1 मिमी बरू के साथ पूरक और 30 मिनट के लिए घूर्णन छोड़ने के लिए एंटीबॉडी की संवेदनशीलता को कम करने के मोतियों को बाध्य और इसके द्वारा आईपी के दौरान विशिष्ट बाध्यकारी के जोखिम ।
  6. २.२ चरण में के रूप में तीन बार मोतियों को धो लें, और ५० µ l/नमूना 1xBrU-IP बफ़र में reसस्पैंड ।

3. मोतियों को बरू-बला आरएनए का बंधन

  1. आरएनए के अर्क में आरएनए सांद्रता चरण १.३ से पराबैंगनी-दृश्यमान spectrophotometry का उपयोग कर, और RNase में प्रत्येक नमूने से ४० µ g आरएनए पतला-नि: शुल्क एच2O २०० µ l की कुल मात्रा को मापने ।
  2. ८० ° c पर 2 मिनट के लिए एक शाही सेना के नमूने को विकृत करने के लिए और एक तालिका में संक्षेप में स्पिन । Add २०० µ l 2x बरू-IP + BSA/RNAse अवरोधक ।
  3. जोड़ें ५० µ l reसस्पैंड और एक नमूना के लिए २.६ कदम से तैयार मोती और 1 ज. धो मोती चार बार के रूप में चरण २.२ में घूर्णन छोड़ दें ।

4.3 चरणों द्वारा आरएनए का रेफरेंस और शुद्धिकरण Phenol-Phenol/क्लोरोफॉर्म-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण

  1. Elute आरएनए और प्रदर्शन phenol निष्कर्षण
    1. elute आरएनए के लिए २०० µ एल रेफरेंस बफर में मोतियों को फिर से सस्पेंड, और जल्दी से उसके बाद २०० µ एल phenol, पीएच ६.६ (चेतावनी: विषाक्त, कदम 4.1.2 नीचे नोट देखें) के नमूने से किसी भी गैर आरएनए अणुओं को हटाने के लिए ।
    2. चक्कर मिश्रण नमूना है, और स्पिन 3 मिनट में २५,००० x जी में एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक ।
      नोट: Phenol विषाक्त है और एक धुएं हुड पहने हुए त्वचा की सुरक्षा में नियंत्रित किया जाना चाहिए । थोड़ा अंलीय पीएच सुनिश्चित करता है कि केवल आरएनए, और नहीं डीएनए, निकाला जाता है । आरएनए प्रभार के हाइड्रोफिलिक प्रकृति के कारण ऊपरी जलीय चरण में रहेगा । प्रोटीन के hydrophobic कोर phenol बांध और कम कार्बनिक phenol चरण में ले जाएगा ।
  2. प्रदर्शन phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण
    1. महाप्राण के रूप में अधिक संभव के रूप में उच्च चरण (२०० µ एल के लगभग १९० µ एल, हैंडलिंग में अनुभव पर निर्भर करता है) और यह २०० µ एल phenol के साथ एक ट्यूब के लिए कदम/क्लोरोफॉर्म, पीएच ६.६ (सावधानी: विषाक्त, नोट देखें) । नमूने भर में एक ही राशि महाप्राण करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. चक्कर मिश्रण नमूना और 3 मिनट के लिए स्पिन पर २५,००० x जी
      नोट: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है और एक धुएं हुड पहने हुए त्वचा की सुरक्षा में नियंत्रित किया जाना चाहिए । क्लोरोफॉर्म phenol को दूर करने के लिए जोड़ा गया है, जो रिवर्स प्रतिलेखन14 और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं15बाधा द्वारा आरएनए के बहाव विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं ।
  3. पहले के रूप में जलीय ऊपरी चरण aspirating द्वारा क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन (अब लगभग १८० µ एल), और एक ट्यूब २०० µ एल क्लोरोफॉर्म युक्त करने के लिए स्थानांतरण । चक्कर मिश्रण नमूना और स्पिन 3 मिनट में २५,००० एक्स जी
  4. पहले के रूप में जलीय ऊपरी चरण महाप्राण (अब लगभग १७० µ एल) और एक 17 µ l (1/10 volume) 3 एम CH3COONa, पीएच ६.० युक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण । बेअसर और जलीय समाधान से शाही सेना हाला, 2 µ l ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/एमएल), जो आरएनए के साथ एक साथ होता है और आरएनए गोली अधिक दिखाई देता है जोड़ें ।
  5. जोड़ें ५०० µ एल ९६% इथेनॉल नमक आयनों और आरएनए के बीच बाध्यकारी और मिश्रण ट्यूब पलटने से समय की एक जोड़ी को बढ़ाने के लिए । पर रात भर ट्यूब छोड़-20 ° c या सूखी बर्फ पर 15 मिनट ।
  6. २५,००० एक्स जी, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्पिन परेशान गोली के बिना supernatant त्याग और १८५ µ एल ७५% इथेनॉल में गोली धोने के लिए किसी भी अवशिष्ट नमक हटा दें । २५,००० x जी, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ।
  7. supernatant पूरी तरह से गोली परेशान बिना त्यागें और एक खुले ढक्कन के साथ 5-10 मिनट सूखी गोली छोड़ दें । 10 µ l RNase-free H2में reसस्पैंड गोली परेशान से बचने के लिए ट्यूब के पक्ष पर लागू किया ।

5. आरएनए का विश्लेषण

  1. एक सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर सीडीएनए तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) या किसी अन्य पसंदीदा विधि का उपयोग कर 2 µ l आरएनए नमूना और सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के लिए वाहक आरएनए के रूप में 1 µ जी खमीर कुल आरएनए (अगर सीडीएनए अगली पीढ़ी sequencing के लिए उपयोग किया जाता है). इसी इनपुट की तैयारी सीडीएनए के लिए खमीर आरएनए के बिना 1 µ जी आरएनए का उपयोग करें ।
  2. पतला सीडीएनए 1:25 और मिश्रण 9 µ l पतला सीडीएनए के साथ 10 µ l qPCR मास्टर मिक्स और 1 µ l fluorogenic जांच, दोनों में निर्दिष्ट सामग्री की तालिका।
    नोट: सीडीएनए कमजोर पड़ने सीडीएनए तैयारी और qPCR विधि इस्तेमाल पर निर्भर करता है ।
  3. निंन qPCR प्रोग्राम चलाएं (उदा., ७५०० पर एक तेज़ रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम या समतुल्य): ५० ° c में 2 मिनट, ९५ ° c पर 20 s, 3 s का ४० चक्र ९५ ° c और 30 s पर ६० ° c ।

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Representative Results

AsPC-1 कोशिकाओं में बरू-्र समय के हमारे प्रारंभिक परीक्षणों का प्रदर्शन किया गया । कोशिकाओं 0, 1, 2, और ४.५ एच, कुल आरएनए निष्कर्षण और बरू-आईपी के बाद के लिए बरू के साथ इलाज किया गया । GAS5 और GAPDH में मापा गया बरू-आईपी आरएनए, जो दिखा दिया है कि 1 ज ्र एक लगभग 9-और ४४ गुना परिवर्तन पृष्ठभूमि की तुलना में (0 एच) GAPDH और GAS5, क्रमशः के लिए तक पहुंचने के लिए पर्याप्त था ।

बरू-आईपी और ऊपर वर्णित विश्लेषण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया अगर परिवर्तन α के स्थिर राज्य स्तरों में पता चला-synuclein mRNA की तरह पोलो पर-कळेनासे 2 (PLK-2) निषेध mRNA संश्लेषण में परिवर्तन की वजह से थे1. A 1 h ्र समय चुना गया था क्योंकि यह पृष्ठभूमि की तुलना में पर्याप्त लेबलिंग प्रदान करता है (चित्र 2) और भी उपचार के समय को एक प्रभाव की अनुमति देता है । 2 मिमी बरू उपचार या तो 1 ज या अब 4 एच उपचार (चित्रा 3) के लिए HEK293T कोशिकाओं में किसी भी सुघड़ परिवर्तन प्रेरित नहीं किया ।

α-Synuclein transfected HEK293T कोशिकाओं के लिए 1 एच के साथ इलाज किया गया DMSO या एक विशिष्ट PLK-2 अवरोध करनेवाला (PLK-2i) बरू की उपस्थिति में हौसले से संश्लेषित आरएनए लेबल. कोशिकाओं के बाद काटा और कुल आरएनए निकाला गया था । १ एच उपचार के भीतर निर्मित बरू-बला आरएनए का उपयोग करते हुए, आरएनए के कुल पूल ("इनपुट" में चित्र3) से बरू-ip ("बरू-ip" का प्रयोग करके एकत्र किया गया था) । ४० µ जी से बरू-आईपी के साथ प्राप्त आरएनए की राशि शुरू सामग्री अलग सेल लाइनों के बीच बदलता है, और हम आम तौर पर HEK293T कोशिकाओं से लगभग ५०० एनजी प्राप्त करते हैं, लेकिन केवल 10-50 हेला कोशिकाओं से एनजी । PLK-2 निषेध दोनों इनपुट और बरू-आईपी में α-synuclein mRNA में वृद्धि हुई (चित्र 3 बी) सुझाव है कि स्थिर राज्य आरएनए में वृद्धि आरएनए के संश्लेषण में वृद्धि के कारण होता है. यह सुनिश्चित करने के लिए कि PLK-2i केवल आरएनए उत्पादन में एक समग्र वृद्धि का कारण नहीं बनता है, ३ अतिरिक्त अंतर्जात जीन (ACTB, HMBS, और नध) मापा गया (चित्रा ४). इन जीनों का न तो इनपुट (चित्र 4a) और बरू-IP (चित्रा 4B) पर PLK-2i उपचार में वृद्धि हुई थी ।

बरू-IP की विशिष्टता को मान्य करने के लिए गैर-बरू स्वास्थ्यकर्मी कोशिकाओं के साथ एक नियंत्रण शामिल किया गया. बरू-स्वास्थ्यकर्मी और अनुपचारित कोशिकाओं से बरू-IP द्वारा छीना 18sRNA के स्तरों की तुलना (चित्रा ५) की गई. यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि बरू-IP अत्यधिक विशिष्ट है और केवल गैर-बला आरएनए (चित्र ५) का एक बहुत छोटा अंश कैप्चर करता है.

क्योंकि बरू-बला आरएनए केवल 1 घंटे के भीतर उत्पादित है, यह एक उचित संदर्भ जीन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से कुछ सामान्य रूप से उपयुक्त जीन बहुत कम सांद्रता में व्यक्त किया जा सकता है के लिए विश्वसनीय हो. 18sRNA अपने उच्च बहुतायत की वजह से चित्रा 3 बी और चित्रा 4 में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए एक संदर्भ जीन के रूप में चुना गया था । कई संदर्भ जीन थे, हालांकि, परीक्षण, और कुछ उच्च थ्रेसहोल्ड चक्र दिखाया (> 30) (चित्र 6) । यह डेटा यह भी दर्शाता है कि इनपुट में बरू-बला IP'ed आरएनए और कुल आरएनए के बीच का अंतर लगभग 5 सीटी की है, और सेल में कम मात्रा में व्यक्त किए गए कुछ RNAs को बरू-IP के बाद ठीक से नहीं पाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: आरएनए संश्लेषण की जांच के लिए बरू-आईपी का विवरण । (ए) आरएनए polymerases द्वारा डीएनए से कोशिकाओं में लिखित है । (ख) मीडिया के अलावा, बरू कोशिकाओं द्वारा लिया और नव लिखित आरएनए में शामिल किया है । (ग) आरएनए संश्लेषण दरों को मापने के लिए: (१) नव संश्लेषित आरएनए के साथ १ एच के लिए बला है, (२) आरएनए को बला के बाद तुरंत कोशिकाओं से निकाला जाता है, (३) बरू-बला आरएनए विरोधी-बरू एंटीबॉडी का प्रयोग immunoprecipitated है, (४) बरू-बला (और इसी इनपुट) आरएनए RT-qPCR या अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: लेबलिंग समय का आकलन. बरू-्र समय के एक आरंभिक आकलन का उदाहरण । AsPC-1 रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में उगाई गई कोशिकाओं के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और ५० U/ml/५० µ g/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin के साथ 0 के लिए 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता पर बरू के साथ इलाज किया गया, 1, 2, और ४.५ एच आरएनए निष्कर्षण और विश्लेषण से पहले भ-qPCR. डेटा 2-सीटीके रूप में quantified है, और तकनीकी triplicates ± मानक विचलन, n = 1 के माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: DMSO और PLK-2i इलाज कोशिकाओं से इनपुट और बरू-आईपी आरएनए दिखा प्रतिनिधि परिणाम. (क) 1 ज और 4 ज 2 एमएम बरू उपचार HEK293T कोशिकाओं में किसी भी दृश्य सुघड़ परिवर्तन प्रेरित नहीं किया । स्केल बार = १०० µm. (B) संदर्भ से चित्रा1अनुकूलित । ३,५००,००० HEK293T कोशिकाओं प्रति 10-cm डिश और transfected एक प्लाज्मिड व्यक्त α-synuclein 24 ज के साथ बोने के बाद बीज बोने की थी । 24 एच पोस्ट अभिकर्मक कोशिकाओं DMSO या PLK-2i, आरएनए निष्कर्षण और बरू-आईपी के बाद की उपस्थिति में बरू के साथ 1 एच के लिए मशीन थे । आरएनए का विश्लेषण आरटी-qPCR द्वारा मानव SNCA (α-synuclein) और 18sRNA के खिलाफ निर्देशित जांच सेट का उपयोग करके किया गया था । बरू-आइपी तथा आगत SNCA २-ΔΔCटी पद्धति का प्रयोग करते हुए क्रमशः बरू-आइपी एवं आगत 18sRNA के सापेक्ष quantified किया गया. परिणाम DMSO उपचारित नमूनों को सामान्यीकृत किया गया । डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया है । छात्र के ख़राब t-परीक्षण, * p < 0.001, n = 3 का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय तुलना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: PLK-2i द्वारा नहीं बदला अन्य जीनों का मापन. PLK-2i परिवर्तन न तो कुल और न ही संश्लेषित आरएनए के ACTB, HMBS, और नध से होता है. (क) ACTB, HMBS, और नध से आरएनए को एक प्रयोग में तपसिल में मापा गया और quantified के सापेक्ष 18sRNA को २-ΔΔCटी पद्धति का प्रयोग करते हुए इनपुट में. मान DMSO इलाज नमूनों और सलाखों के लिए सामान्यीकृत थे triplicates ± मानक विचलन का मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं, n = 1. (ख) ACTB, HMBS, और नध में 18sRNA के सापेक्ष बरू-IP'ed आरएनए और quantified में भी रू. बरू-आई. पी. आई. मान DMSO को सामान्यीकृत किया गया और A, n = 1 में के रूप में प्रस्तुत की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: बरू की विशिष्टता-आई. पी. बरू-और गैर-बरू-इलाज कोशिकाओं से बरू-ip द्वारा छीना गया 18sRNA की तुलना के लिए, विआरएनए से बरू-ip को शुरू होने वाली सामग्री में अंतर के लिए खाता करने के लिए इनपुट आरएनए के सापेक्ष मान्य किया गया और इसके बाद बरू-इलाज के नमूनों को सामान्यीकृत कर दिया गया. केवल एक बहुत ही छोटा अंश (०.००२) गैर-बरू-बला 18sRNA का immunoprecipitated था, यह सुधरेगा कि बरू-IP अत्यधिक विशिष्ट है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: बरू-आईपी आरएनए में विभिन्न mRNAs के स्तर इनपुट आरएनए की तुलना में. कई संभावित संदर्भ जीनों का परीक्षण किया गया क्योंकि कुछ RNAs १ एच बरू उपचार के भीतर उत्पादित आरएनए की छोटी मात्रा के कारण बरू-आईपी आरएनए में बहुत कम सांद्रता में उपस्थित होंगे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के साथ 1 एच के लिए नव उत्पादित आरएनए के लेबलिंग से बरू के उत्पादन के निर्धारण के लिए रू-immunoprecipitation के उपयोग का वर्णन करता है, तत्काल आरएनए निष्कर्षण और बरू-बला आरएनए के बाद । इस पद्धति का संदर्भ16में पहले बताया जा चुका है, और इस आलेख में IP विशिष्टता और आरएनए शुद्धता बढ़ाने के लिए कुछ अतिरिक्त चरण शामिल हैं, जो पूर्व-उपचार मोतियों के साथ-साथ बरू की कम सांद्रता के साथ-साथ एक phenol-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण चरण को आई पी के बाद आरएनए शुद्धता बढ़ाएँ. इसके अतिरिक्त, हम यहां पर बरू और गैर-बरू स्वास्थ्यकर्मी कोशिकाओं से कब्जा कर लिया आरएनए की तुलना के द्वारा की विशिष्टता का प्रदर्शन भी यहाँ डेटा प्रस्तुत करते हैं. Phenol-क्लोरोफॉर्म शुद्धीकरण सस्ता है, लेकिन आरएनए की कम मात्रा को देखते हुए बरू के साथ बला, बहाव विश्लेषण में वृद्धि संकेतों के बजाय आरएनए साफ-अप किट का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. हमारा अनुभव है, तथापि, कि आरएनए के नमूने भर में सबसे बराबर निष्कर्षण phenol-क्लोरोफॉर्म शुद्धि का उपयोग कर प्राप्त की है ।

स्थिर राज्य आरएनए स्तर में परिवर्तन के अंतर्निहित कारणों की जांच करने में सक्षम कुल आरएनए स्तर के विश्लेषण के विपरीत बरू-लेबलिंग और आईपी, कर रहे हैं । विधि कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान पर कोई या सीमित प्रभाव पड़ता है, इसके विपरीत में α-amanitin और actinomycin डी के रूप में transcriptional अवरोधकों के उपयोग के लिए यह सुझाव दिया गया है कि नव संश्लेषित आरएनए की तुलना राज्य के स्तर को स्थिर करने के लिए आरएनए क्षय दर17की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बरू-आईपी विधि यहाँ वर्णित एक परख में दोनों आरएनए संश्लेषण और क्षय का एक साथ संकल्प सक्षम बनाता है.

चित्रा 5में, हम यह दर्शाता है कि आरएनए केवल बरू इलाज कोशिकाओं से IP'ed है, दिखा रहा है कि वहाँ वास्तव में उपयोग की जाने वाली सेल लाइन में आरएनए में शामिल किया गया है. तथापि, हम बरू-IP प्रदर्शन करने से पहले अन्य कोशिका रेखाओं में आरएनए में बरू निगमन की प्रारंभिक परीक्षा आयोजित करने का सुझाव देते हैं. उदाहरण के लिए, यह हो सकता है, विरोधी-बरू एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए कुल आरएनए के अर्क के माध्यम से डॉट दाग या एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख के माध्यम से बरू किया जाता है.

यहाँ हमने नमूनों में बरू-IP दक्षता का परीक्षण प्रस्तुत नहीं किया है, लेकिन इस तरह के Drosophila melanogasterके रूप में या तो इन विट्रो या किसी अन्य जीव से उत्पादित आरएनए में बरू-बला spikes का उपयोग कर जाँच की जा सकती है. इस आरएनए तो भी बहाव quantifications और सामान्यीकरण में इस्तेमाल किया जा सकता है.

सही pipetting तकनीक महत्वपूर्ण है जब अत्यधिक संवेदनशील मात्रात्मक परख, ऐसे बरू-आईपी और आरटी-qPCR के रूप में प्रदर्शन, और एक विशेष प्रयास करने के लिए नमूने भर में बराबर pipetting प्रदर्शन किया जाना चाहिए । phenol-क्लोरोफॉर्म निकालने कुछ अनुभव की मांग है, लेकिन असंतोषजनक pipetting पर, जलीय और phenol/क्लोरोफॉर्म चरणों फिर से मिश्रित किया जा सकता है और फिर से केंद्रापसारक ।

इस प्रोटोकॉल 1 ज के लिए बरू-्र पता चलता है जब आरएनए संश्लेषण को मापने । इस लेबलिंग समय प्रतिलेखन में परिवर्तन का एक मोटा अनुमान सक्षम बनाता है, के बाद से मानव और चूहों mRNAs के बहुमत के लिए आधा जीवन का अनुमान लगाया गया है > 6 एच18,19। सावधानी, तथापि, प्रयोग किया जाना चाहिए जब डेटा की व्याख्या प्राप्त है, क्योंकि कई RNAs आधा जीवन है < 1 h18,19, जैसे कई एक लिपिड, जो तेजी से उत्तेजना और गिरावट पर वृद्धि द्वारा प्रेरित टेप के रूप में वापस 20प्रेरण के बाद 2 एच के भीतर आधार लाइन स्तर । आरएनए क्षरण से प्रभावितों के जोखिम को कम करने के लिए, बरू-लेबलिंग का समय कम किया जा सकता है, तथापि, यह भी पर्याप्त आरएनए लेबल करने के लिए पृष्ठभूमि से बरू-आईपी द्वारा प्राप्त आरएनए भेद करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है (जो हमारे हाथों में 1 एच लेबलिंग के बाद प्राप्त किया गया था ( चित्र 2)) । एक अन्य विकल्प बरू-लेबलिंग और आई पी का उपयोग कर ब्याज की जीन की दोनों आरएनए संश्लेषण और क्षय को मापने के लिए है, उत्तरार्द्ध विधि2में वर्णित है । इन दो तरीकों से डेटा एक दूसरे के पूरक है, और अगर दो शर्तों के बीच संश्लेषण में परिवर्तन मापा जाता है लेकिन कोई परिवर्तन क्षय दरों में देखा जाता है, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि आरएनए में मापा परिवर्तन संश्लेषण के विनियमन के कारण थे. हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि दोनों तकनीक केवल आरएनए स्तर का आकलन करके आरएनए की कार्यक्षमता को मापने के लिए और रासायनिक संशोधनों के रूप में आरएनए कार्यों को प्रभावित करने वाले अन्य तंत्र की जांच करने के लिए पूरी तरह से उपेक्षा14.

के बाद से कोशिकाओं को केवल 1 घंटे के लिए बरू के साथ तैयार कर रहे हैं, बहुत धीरे से उत्पादित mRNAs बरू-आईपी विधि का उपयोग कर मापने के लिए मुश्किल हो सकता है. यह एक बिंदु है, जहां α-amanitin और actinomycin डी के रूप में transcriptional अवरोधकों का उपयोग बरू-IP पर पसंद किया जा सकता है, तथापि, वे केवल क्षरण में परिवर्तन को मापने के लिए और सीधे आरएनए उत्पादन उपाय नहीं किया जा सकता है । बरू-बला आरएनए के निम्न स्तरों को भी बरू के साथ मशीनी समय को बढ़ाने से दूर किया जा सकता है, हालांकि, लंबी गर्मी के समय आरएनए क्षरण से प्रभावित होने का खतरा बढ़ जाता है । उस स्थिति में अब यह जानना संभव नहीं है कि बरू-बला आरएनए में परिवर्तन आरएनए उत्पादन या क्षय में परिवर्तन के कारण होता है या नहीं.

इस उदाहरण में, कैप्चर किए गए बरू-बला आरएनए का अनुप्रवाह विश्लेषण RT-qPCR का उपयोग किया जाता है, तथापि, अगली पीढ़ी अनुक्रमण भी RNAs2,13के एक बड़े पूल में परिवर्तन के लिए स्क्रीन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल बहाव विधि है. इसी प्रकार, विधि mRNAs के विश्लेषण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन RNAs2के सभी प्रकार का विश्लेषण कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Lundbeck फाउंडेशन, आर्हस विश्वविद्यालय, Dandrite और Lundbeck ए एस इस काम का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribolock Rnase inhibitor ThermoFisher EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Life Technologies 11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody BD Bioscience 555627
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6 ThermoFisher AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 ThermoFisher AM9732
High Pure RNA isolation Kit Roche 11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher 4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444557 qPCR Master Mix
Taqman RNA probes ThermoFisher SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system Applied Biosystems
HEK293T cell line ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Lonza BE12-604F
Fetal calf serum Biochrom S0115
Penicillin/Streptomycin Biochrom A2213
Hank's buffer 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer 0.1% SDS in RNAse-free H2O

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References

  1. Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
  2. Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
  3. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
  5. Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
  6. Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
  7. Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
  8. Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
  9. Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
  10. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
  11. Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
  12. Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
  13. Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
  14. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
  15. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
  16. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
  17. Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
  18. Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
  19. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
  20. Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).

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आनुवंशिकी अंक १३५ आरएनए संश्लेषण 5-Bromouridine ्र immunoprecipitation phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
5-Bromouridine ्र और Immunoprecipitation का उपयोग कर आरएनए संश्लेषण की जांच
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Kofoed, R. H., Betzer, C., Lykke-Andersen, S., Molska, E., Jensen, P. H. Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (135), e57056, doi:10.3791/57056 (2018).

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