Summary
Este método puede utilizarse para medir la síntesis de ARN. 5-Bromouridine se añade a las células e incorporado en el RNA sintetizado. Síntesis de ARN se miden por la extracción de RNA inmediatamente después del etiquetado, seguido de la inmunoprecipitación de 5 Bromouridine-orientada con RNA y análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
Abstract
Cuando se comparan los niveles de estado estacionario RNA entre dos condiciones, no es posible distinguir si los cambios son causados por alteraciones en la producción o degradación de RNA. Este protocolo describe un método para la medición de la producción de RNA, utilizando 5-Bromouridine etiquetado de RNA seguido por la inmunoprecipitación, que permite la investigación de ARN sintetizado en un corto plazo (p. ej., 1 h). La ventaja de 5-Bromouridine-etiquetado e inmunoprecipitación sobre el uso de tóxicos inhibidores transcripcionales, como α-amanitin y actinomicina D, es que hay no o muy poco efectos sobre la viabilidad celular durante el uso a corto plazo. Sin embargo, porque 5-Bromouridine-inmunoprecipitación solo captura RNA producido en el corto plazo etiquetado, producido lentamente como degrada rápidamente RNA puede ser difícil de medir por este método. El RNA marcado con el 5-Bromouridine capturado por la 5-Bromouridine-inmunoprecipitación puede analizarse por transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuencia de la generación siguiente. Todos los tipos de ARN pueden ser investigados, y el método no se limita a medir mRNA como se presenta en este ejemplo.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) inmunoprecipitación (IP) permite el estudio de la producción de RNA en células con n o efectos muy limitados sobre la fisiología de la célula durante el breve período1,2de etiquetado. El método se basa en la incorporación del derivado sintético de la uridina BrU en el RNA recién sintetizado seguido por IP de ARN marcada con anticuerpos anti-BrU (figura 1).
Se ha sabido por décadas que la síntesis de proteínas puede ser regulada transcripcionalmente, y la existencia de factores de transcripción fue presumida hace más de 50 años3. Hoy en día, se sabe que varias enfermedades son causadas por la desregulación de la estabilidad del RNA y transcripción (suplementario S1 figura en la referencia4), y la capacidad para medir los cambios en la producción de RNA es de gran importancia en la enfermedad de comprensión desarrollo.
Por otro lado, las herramientas para regular la producción de RNA proporcionan nuevas posibilidades para el tratamiento de enfermedades causadas por la expresión de proteína demasiado o muy poco, o acumulación de la proteína tales como la enfermedad de Parkinson (EP). La proteína predominante de acumulación de agregados insolubles como en la EP es la α-sinucleína, y el nivel de α-sinucleína está directamente relacionado con la enfermedad, como la multiplicación del gen del gen α-sinucleína causa familiar PD5. Por otra parte, α-sinucleína agregados de manera dependiente de la concentración. Regulación a la baja de niveles de mRNA de α-sinucleína, resulta una estrategia terapéutica interesante, que se ha logrado con éxito utilizando ARN de interferencia para disminuir la pérdida de células neuronales en modelos de roedores de PD6,7.
Es importante poder medir los cambios en la producción de RNA causado por enfermedad o intervenciones terapéuticas. Estado de la técnica métodos para medir niveles de estado estacionario del ARN, como transcripción reversa seguida de reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (RT-qPCR), no son capaces de distinguir entre los cambios causados por la regulación transcripcional o alterado Estabilidad del RNA. Un método ampliamente utilizado para la investigación de las tasas de decaimiento de RNA está bloqueando de la maquinaria transcripcional con compuestos tales como α-amanitin o actinomicina D seguido de medidas de los RNAs que se decae. Sin embargo, hay algunos problemas asociados con una obstrucción total de la transcripción en células, como la inducción de apoptosis8,9. Al lado de los efectos citotóxicos, transcripcionales inhibidores también presentan varios problemas técnicos, como la lenta absorción celular de α-amanitin y falta de especificidad de la actinomicina D (revisado en la referencia10).
Para evitar la obstrucción total de la transcripción, se han utilizado análogos de nucleótido, como 5-ethynyl uridina (UE 5), 4-thiouridine (4-TU) y BrU. Estos son fácilmente tomados por las células mamíferas e incorporados en el RNA recién sintetizado, que pulso-etiquetado de ARN dentro de un marco de tiempo específico. BrU es menos tóxico que la UE-5 y 4-TU, lo que es el análogo recomendado: opción11,12.
BrU-IP puede utilizarse para investigar tanto la tasa de síntesis de ARN y la estabilidad y así distinguir entre las causas de los cambios en el ARN total. Este artículo se centrará en la medición de la síntesis de ARN y se refiere a la referencia2 para más detalles sobre la investigación de la estabilidad del RNA. Para investigar la síntesis de ARN, las células se etiquetan brevemente con BrU por ejemplo para 1 h seguida de BrU-IP1 (figura 1). Esto permite mediciones de ARN sintetizado en el corto plazo etiquetado y cambios observados le dará una mejor estimación de las regulaciones en la síntesis de RNA que midiendo cambios en el ARN total por RT-qPCR. Sin embargo, debe mencionarse que a pesar de que el tiempo de etiquetado es, por ejemplo, sólo 1 h, degradación todavía puede tener una influencia en los niveles de RNA observados.
ARN de experimentos de BrU-IP son adecuados para análisis posterior por RT-qPCR1 o la siguiente generación de la secuencia2,13. Otros métodos de detección de RNA estándar, tales como el borrar norteño o ensayo de protección de ribonucleasa, también pueden ser aplicables para ciertos RNAs.
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Protocol
Nota: Realizar todos los pasos a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario y mantener reservas en hielo o en el frigorífico (excepto de la elución de búfer que contienen SDS). El protocolo se divide en 5 secciones: las muestras de la preparación de RNA; preparación de granos para IP; Unión de la ARN BrU-labelled para granos; elución y purificación de RNA encuadernado BrU-etiquetados por extracción con fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos; Análisis de ARN (en este ejemplo utilizando RT-qPCR)
1. preparación de las muestras de RNA
- Las células HEK293T cuenta con una célula automatizada el contador y la semilla 3.500.000 células en un plato de petri de 10 cm en medios de cultivo de 10 mL (medio modificado Eagle de Dulbecco suplementado con 10% suero fetal y 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina) para obtener un total de > 40 μg de RNA sobre extracción 48 h más tarde. Mantener las células a 37 ° C y 5% CO2.
- 48 h después de la siembra, aspirar el medio de crecimiento de 8 mL y dejar 2 mL para evitar la desecación de las células. Añadir 2 mM de BrU y cualquier tratamiento a los 8 mL aspirado medio de crecimiento y quitar el residual de 2 mL de las células antes de volver a aplicar el 8 mL BrU que contienen medios de cultivo. Evitar el uso de medios frescos sobre aplicación de la BrU a las células, ya que esto puede inducir cambios en la expresión génica.
- Incube las células durante 1 h con BrU y tratamiento. Lavar las células en buffer de 5 mL Hank y trypsinize las células utilizando tripsina de 0,05% de 2 mL. Añadir el medio de crecimiento de 8 mL para detener la reacción, transferir las células a un tubo de 15 mL y desactivación de las células por 2 min a 1.000 x g.
- Quite el sobrenadante y extraer ARN total pellets celulares utilizando un aislamiento de RNA kit (véase Tabla de materiales) o cualquier otro método de preferido y eluir en libre de Rnasa H2O. tienda el ARN a-80 ° C hasta que esté listo para proceder.
2. preparación de granos para IP
- El número de muestras a ser investigados más uno extra a la cuenta de pérdida durante el pipeteo y remolino mezcla preparar granos en lotes. Suspender granos magnéticos de anti-ratón IgG fondo mezclando torbellino y saque 20 granos μl por muestra en un tubo de 1,5 mL libre de Rnasa. Lugar el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y dejar aproximadamente 20 s para las cuentas a cobrar en el lado.
- Eliminar el sobrenadante, sacar el tubo del soporte magnético y resuspender en 400 μL de tampón de BrU-IP x 1 mediante pipeteo. Girar el tubo muy brevemente para 2 en una centrífuga de mesa, colóquelo en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez.
- Unión inespecífica de bloque a los granos con heparina. Resuspender los granos en 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparina de tampón y deja girar para lavado de 30 minutos los granos una vez, como en el paso 2.2.
Nota: La heparina es un polímero cargado negativamente, que competirá con RNAs para el enlace. tRNA u otros RNAs irrelevantes pueden utilizarse también si la aplicación aguas abajo no está secuenciando. - Suspender los granos en 1 mL 1 x buffer de BrU-IP y agregar 1.25 μg/muestra del anticuerpo anti-α-bromodeoxiuridina, que también reconoce BrU. Incubar los granos para 1 h mientras gira, o durante la noche a temperatura ambiente.
- Lavar los granos tres veces como en el paso 2.2. Resuspender los granos en 50 μl de la muestra 1 x BrU-IP buffer suplementado con 1 mM de BrU y dejar girando durante 30 minutos reducir la sensibilidad del anticuerpo ligado a las cuentas y por este medio el riesgo de atascamiento inespecífica durante PI.
- Lavar los granos tres veces como en el paso 2.2 y resuspender en tampón de muestra/μl 1xBrU-IP 50.
3. Unión de ARN marcado con BrU a granos
- Medir las concentraciones de RNA en los extractos de RNA en el paso 1.3 usando espectrofotometría de ultravioleta-visible y diluir 40 μg RNA de cada muestra en libre de Rnasa H2O hasta un volumen total de 200 μl.
- Calentar las muestras de RNA por 2 min a 80 º C para desnaturalizar ARN y vuelta brevemente en una centrífuga de mesa. Añadir 200 μL de 2 x inhibidor de BrU-IP + BSA/Rnasa.
- Añadir 50 μl resuspendió y prepararon granos del paso 2.6 para cada muestra y dejar girar 1 h. lavado los granos cuatro veces como en el paso 2.2.
4. elución y purificación de RNA por la extracción de fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos
-
Eluir el RNA y realizar la extracción del fenol
- Suspender los granos en 200 μL de tampón de elución para eluir el RNA y rápidamente después de eso agregar fenol de 200 μL, pH 6.6 (PRECAUCIÓN: tóxico, ver nota abajo paso 4.1.2) para eliminar cualquier moléculas no-RNA de la muestra.
- Remolino mezcla la muestra y un exprimido a 3 min a 25.000 x g en una centrífuga de mesa.
Nota: El fenol es tóxico y debe manejarse en una campana de humos con protección de la piel. El pH ligeramente ácido asegura que sólo ARN y no ADN, se extrae. El RNA permanece en la fase acuosa superior debido a la naturaleza hidrofílica de las cargas. Los corazones hidrofóbicos de las proteínas se unen fenol y mover a la fenol-fase orgánica inferior.
-
Realizar extracción de fenol-cloroformo
- Aspirar tanto fase superior como sea posible (aproximadamente 190 μl de 200 μL, dependiendo de la experiencia en el manejo) y a un tubo con 200 μL fenol/cloroformo, pH 6.6 (PRECAUCIÓN: tóxicos, ver nota). Asegúrese de aspirar la misma cantidad a través de las muestras.
- Remolino de mezclar la muestra y el centrifugado por 3 min a 25.000 x g.
Nota: El cloroformo es tóxico y debe manejarse en una campana de humos con protección de la piel. Cloroformo se añade para eliminar el fenol, que puede afectar el análisis descendente de RNA por inhibición de la transcripción inversa14 y polimerasa de reacciones en cadena15.
- Realizar extracción de cloroformo aspirando la fase superior acuosa como antes (ahora aproximadamente 180 μL) y transferir a un tubo que contiene cloroformo μl 200. Hidromasaje mezcle la muestra y centrifugar 3min a 25.000 x g.
- Aspirar la fase superior acuosa como antes (ahora aproximadamente 170 μL) y transferir a un tubo que contiene 17 μl (volumen 1/10) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Para neutralizar y precipitar el RNA de la solución acuosa, añadir 2 μl del glicógeno (20 mg/mL), que precipita junto con RNA y hace más visible el pellet de RNA.
- Añadir 500 μl 96% de etanol para aumentar la unión entre los iones de sal y RNA y mezcla por inversión del tubo un par de veces. Dejar el tubo durante la noche a-20 ° C o 15 min en hielo seco.
- Girar la muestra a 25.000 x g, 4 ° C por 30 min descartar sobrenadante sin perturbar el pellet y lavar el pellet en 185 μl 75% de etanol para eliminar la sal residual. Gira a 25.000 x g, 4 º C durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante totalmente sin perturbar el sedimento y dejar el sedimento seco 5-10 minutos con una tapa abierta. Resuspender en 10 μl libre de Rnasa H2O aplicado en el lado del tubo para evitar perturbar el sedimento.
5. Análisis de ARN
- Preparar cDNA usando una cDNA de transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales) o cualquier otro preferido método 2 μl de muestra de RNA y RNA total de levadura 1 μg como portador del RNA para la reacción de síntesis de cDNA (no usada si cDNA se utiliza para la siguiente secuencia de generación). Utilice 1 μg de RNA sin levadura RNA para preparación de ADNc de entrada correspondiente.
- CDNA diluidos 1:25 y mix 9 μl diluir cDNA con 10 μl qPCR Master mix y 1 μl fluorógenos sonda, ambos especifican en la Tabla de materiales.
Nota: La dilución de cDNA depende de la preparación de ADNc y método de qPCR. - Ejecutar el siguiente programa de qPCR (por ejemplo, en un sistema Fast PCR en tiempo real 7500 o equivalente): 2 minutos a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 ciclos de 3 s a 95 ° C y 30 s a 60 ° C.
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Representative Results
Nuestras pruebas iniciales de tiempo etiquetado BrU fueron realizados en células AsPC-1. Las células fueron tratadas con BrU, para 0, 1, 2 y 4.5 h, seguida por la extracción de RNA total y BrU-IP. Midieron a GAS5 y GAPDH en el ARN de BrU-IP, que ha demostrado que 1 h etiquetado era suficiente para alcanzar un cambio aproximadamente 9 - y 44 veces en comparación con fondo (0 h) de GAPDH y GAS5, respectivamente.
BrU-IP y el análisis descrito anteriormente fueron utilizados para investigar si los cambios descubrieron en estado estacionario los niveles de mRNA de α-sinucleína en Polo-como quinasa 2 (PLK-2) inhibición fueron causados por cambios en la síntesis de mRNA1. Un tiempo de 1 h etiquetado fue elegido porque esto proporciona suficiente etiquetado frente a fondo (figura 2) y también permite que el tiempo de tratamiento tener un efecto. tratamiento de BrU 2 mM no indujo cambios morfológicos en las células HEK293T 1 h o el tratamiento más de 4 h (Figura 3A).
Α-sinucleína transfected HEK293T células fueron tratadas durante 1 h con DMSO o un inhibidor específico de PLK-2 (PLK-2i) en presencia de BrU a etiqueta de RNA recién sintetizada. Las células se cosecharon en adelante y se extrajo ARN total. BrU-etiquetados RNA producido en el tratamiento de 1 h se recopiló utilizando BrU-IP ("BrU-IP" en la figura 3B) de la piscina total del ARN ("entrada" en la figura 3B). La cantidad de RNA obtenido con BrU-IP 40 μg a partir de material varía entre diferentes líneas celulares, y generalmente obtenemos aproximadamente 500 ng de células HEK293T, pero sólo el 10-50 ng de células HeLa. PLK-2 inhibición causó un aumento de mRNA α-sinucleína en la entrada y la BrU-IP (figura 3B), sugiriendo que el aumento en el RNA es causada por un aumento en la síntesis de ARN de estado estacionario. Para asegurar que PLK-2i no sólo provoca un aumento global en la producción de RNA, genes endógenos adicionales 3 (ACTB HMBS y NADH) fueron medidos (figura 4). Ninguno de estos genes se incrementó en la entrada (Figura 4A) y BrU-IP (Figura 4B) sobre el tratamiento de PLK-2i.
Para validar la especificidad de la BrU-IP, se incluyó un control con células no tratada de BrU. Se compararon los niveles de 18sRNA capturados por BrU-IP de células BrU-tratadas y no tratadas (figura 5). Esto demuestra claramente que la BrU-IP es altamente específica y solo captura una fracción muy pequeña del RNA no etiquetados (figura 5).
Porque el RNA BrU-etiquetado sólo se produce dentro de 1 h, es importante elegir un gen de referencia apropiada, puesto que algunos genes normalmente convenientes podrían ser expresados en concentraciones demasiado bajas para ser confiable. 18sRNA fue elegido como un gen de referencia de los datos presentados en la figura 3B y 4 de la figura debido a su gran abundancia. Varios genes de referencia, sin embargo, probaron, y algunos mostraron ciclos de umbral alto (> 30) (figura 6). Esta información también demuestra que la diferencia entre etiquetados BrU IP'ed ARN y ARN total en la entrada es de aproximadamente 5 del Ct y de algunos RNAs en bajas cantidades en la célula podrían por lo tanto no bien detectarse después de BrU-IP.
Figura 1: Descripción de BrU-IP para la investigación de síntesis de ARN. (A) RNA es transcrito en las células de ADN por ARN Polimerasas. (B) además de los medios de comunicación, BrU es tomado por las células e incorporado en el RNA recién transcrito. (C) para medir las tasas de síntesis de RNA: RNA (1) recién sintetizado se denomina durante 1 h con BrU (2) RNA se extrae de las células inmediatamente después de etiquetado, (3) BrU-etiquetados RNA immunoprecipitated utilizando anticuerpos anti-BrU, (4) BrU-etiquetado (y correspondiente entrada) RNA es analizada por RT-qPCR o secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: evaluación del etiquetado tiempo. Ejemplo de una evaluación inicial de tiempo etiquetado BrU. AsPC-1 las células cultivadas en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% suero fetal bovino y 50 U/mL / 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina fueron tratados con BrU a una concentración final de 2 mM de 0, 1, 2 y 4.5 h antes de la extracción de RNA y análisis por RT-qPCR. Datos se cuantifica como 2-Cty se presenta como el promedio de técnicos triplicados ± desviación estándar n = 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados representativos mostrando entrada y BrU-IP RNA del DMSO y PLK-2i trataron células. Tratamiento de BrU 1 h y 4 h 2 mM (A) no indujo cambios morfológicos visibles en células HEK293T. Barra de escala = 100 μm. (B) figura adaptado de referencia1. Células HEK293T 3.500.000 fueron sembradas por el plato de 10 cm y transfectadas con un plásmido de expresión de α-sinucleína 24 h después de la siembra. las células de la transfección de post 24 h se incubaron durante 1 h con BrU en presencia de DMSO o PLK-2i, seguida por la extracción de RNA y BrU-IP. Análisis de RNA se realizó por RT-qPCR usando sistemas de la sonda contra SNCA humano (α-sinucleína) y 18sRNA. BrU-IP y entrada SNCA se cuantificó en relación con BrU-IP y había entrada 18sRNA, respectivamente, utilizando el método deΔΔC -T 2. Resultados se normalizaron a las muestras tratadas con DMSO. Datos se presentan como medias ± desviaciones de estándar. Las comparaciones estadísticas se realizaron con el de impar-prueba de t Student, * p < 0.001, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: medición de otros genes no cambiado por PLK-2i. PLK-2i cambia ni el total ni síntesis ARN de ACTB HMBS y NADH. ACTB (A), HMBS NADH ARN de entrada se midió por triplicado en un experimento y cuantificada en relación con 18sRNA en la entrada mediante el método deΔΔC -T 2. Valores se normalizaron a las muestras de tratados DMSO y las barras representan la media de los triplicados ± desviación estándar, n = 1. ACTB (B), HMBS, NADH se mide en el RNA de BrU-IP'ed y cuantificada en relación con 18sRNA en la BrU-IP. Valores fueron normalizados a DMSO y presentados como en A, n = 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: especificidad de BrU-IP. Para la comparación de 18sRNA capturados por BrU-IP de BrU - y no-BrU-las células tratadas, ARN de BrU-IP fue validado en relación con la entrada de ARN para tener en cuenta las diferencias en el material de partida y de ahora en adelante normalizada a muestras tratadas con BrU. Sólo una fracción muy pequeña (0,002) de 18sRNA etiqueta de BrU no era immunoprecipitated, demostrando que la BrU-IP es altamente específica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: niveles de diferentes mRNAs en RNA de BrU-IP comparado con RNA entrada. Se analizaron varios genes potenciales de referencia porque algunos RNAs estará presentes en concentraciones muy bajas de ARN BrU-IP debido a pequeñas cantidades de RNA producido dentro de la 1 h BrU tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe el uso de BrU-IP para determinación de la producción de RNA por etiquetado de nuevo produce RNA para 1 h con BrU, seguido por la inmediata extracción de RNA e inmunoprecipitación de ARN marcado con BrU. Este método ha sido descrito previamente en la referencia16, y este artículo incluye algunos pasos adicionales para aumentar la especificidad IP y pureza del RNA, por granos pre-tratamiento con concentraciones bajas de BrU, así como un paso de purificación de fenol-cloroformo para aumentar la pureza del RNA después de IP. Además, también presentamos los datos aquí demostrar la especificidad de la BrU-IP mediante la comparación del ARN de BrU y BrU no tratados las células. Purificación de fenol-cloroformo es barato, pero teniendo en cuenta las cantidades bajas de ARN marcado con BrU, señales de creciente en el análisis de aguas abajo pueden obtenerse utilizando kits de limpieza de RNA en lugar de otro. Sin embargo, nuestra experiencia es que la extracción más igual de ARN en las muestras se obtiene mediante purificación de fenol-cloroformo.
Etiquetado de BrU y - IP son, en contraste con el análisis de los niveles de RNA total, capaces de investigar las causas de los cambios en los niveles de estado estacionario RNA. El método no tiene ningún o limitada efectos sobre la fisiología de la célula, en cambio para el uso de inhibidores transcripcionales tales como α-amanitin y actinomicina D. Se ha sugerido que la comparación del ARN recién sintetizado a nivel de estado estacionario puede utilizarse para el cálculo de las tasas de decaimiento de RNA17, y el método de BrU-IP aquí descrito permite la determinación simultánea de la síntesis de ARN y decaimiento en un ensayo.
En la figura 5, demostró que el ARN es que solo IP'ed de BrU tratar células, demostrando que en efecto es BrU incorporado en el RNA en la línea celular utilizada aquí. Sin embargo, sugerimos llevar a cabo una prueba inicial de incorporación de BrU en el RNA en otras líneas celulares antes de realizar la BrU-IP. Esto podría hacerse por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos anti-BrU BrU de cuantificar en los extractos de RNA total mediante punto borran o análisis enzima-ligado del inmunosorbente.
Aquí no hemos presentado una prueba de eficacia de BrU-IP a través de muestras, pero esto puede ser investigado utilizando picos BrU-labelled en RNA producido ya sea en vitro o de otro organismo, como Drosophila melanogaster. Este RNA podría también utilizarse en el downstream cuantificaciones y normalizar.
Técnicas de pipeteo correctas son cruciales cuando se realizan ensayos cuantitativos altamente sensibles, tales como BrU-IP y RT-qPCR, y debe hacer un esfuerzo especial para llevar a cabo el pipeteo igual a través de muestras. La extracción de fenol-cloroformo exige cierta experiencia, pero sobre pipeteo insatisfactoria, las fases acuosas y fenol/cloroformo pueden volver a mezclar y centrifugar nuevamente.
Este protocolo sugiere BrU-etiquetado para 1 h cuando se mide la síntesis de ARN. Esta vez etiquetadora permite una estimación aproximada de los cambios en la transcripción, ya que la mayoría de humanos y ratones mRNAs se han estimado que Half-Life > 6 h18,19. PRECAUCIÓN, sin embargo, debe ejercerse cuando la interpretación de los datos obtenidos, ya que muchos RNAs tienen vida media < h 118,19, como varias transcripciones inducida por el lípido A, que rápidamente aumentan sobre el estímulo y rechazar a niveles de línea de base dentro de 2 h después de la inducción20. Para disminuir el riesgo de influencias de la degradación del RNA, el tiempo de BrU-etiquetado se puede disminuir, sin embargo, también es importante suficiente RNA para poder distinguir RNA obtenido por BrU-IP del fondo (que se obtuvo después de 1 h etiquetado en nuestras manos (de la etiqueta Figura 2)). Otra opción es medir la síntesis de ARN y la decadencia del gen de interés mediante etiquetado BrU y IP, este último método se describe en2. Los datos de estos dos enfoques complementan mutuamente, y si se mide un cambio en la síntesis entre dos condiciones, pero ningún cambio se observa en las tasas de descomposición, se puede concluir que los cambios registrados en el ARN eran debido a la regulación de la síntesis. Sin embargo, es importante recordar que ambas técnicas sólo medir funcionalidad de RNA mediante la estimación de niveles de ARN y descuidan totalmente a investigar otros mecanismos que influyen en las funciones del RNA como modificaciones químicas14.
Puesto que las células se incuban con BrU durante sólo 1 h, mRNAs producido muy lentamente pueden ser difíciles de medir mediante el método de BrU-IP. Este es un punto donde el uso de inhibidores transcripcionales como α-amanitin y actinomicina D podría ser preferido sobre BrU-IP, sin embargo, sólo pueden ser utilizados para medir los cambios en la degradación y no directamente medir la producción de RNA. También se pueden superar los bajos niveles de ARN marcado con BrU al aumentar el tiempo de incubación con BrU, sin embargo, tiempos de incubación prolongados aumentan el riesgo de influencias por degradación de RNA. En ese caso, ya no es posible saber si los cambios en el ARN marcado con BrU son causados por cambios en la producción de RNA o decaimiento.
En este ejemplo, el análisis descendente del ARN marcado con BrU capturado se realiza utilizando RT-qPCR, sin embargo, próxima generación secuenciación es también un método ampliamente utilizado aguas abajo a pantalla para cambios en una gran piscina de RNAs2,13. Asimismo, el método no se limita al análisis de mRNAs, pero puede analizar todos los tipos de RNAs2.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La Fundación Lundbeck, Universidad de Aarhus, Dandrite y Lundbeck A/S apoyaron este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
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