Summary
Denne metode kan bruges til at måle RNA syntese. 5-Bromouridine er føjet til celler og indarbejdet i syntetisk RNA. RNA syntese er målt af RNA udvinding umiddelbart efter mærkning, efterfulgt af 5-Bromouridine-målrettet immunoprecipitation af mærket RNA og analyse af reverse transkription og kvantitative polymerase kædereaktion.
Abstract
Når steady state RNA niveauer sammenlignes mellem to betingelser, er det ikke muligt at skelne mellem om ændringer, der skyldes ændringer i produktionen eller nedbrydning af RNA. Denne protokol beskriver en metode til måling af RNA produktion, ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning af RNA efterfulgt af immunoprecipitation, som giver mulighed for undersøgelse af RNA syntetiseret inden for en kort tidshorisont (fx, 1 h). Fordelen ved 5-Bromouridine-mærkning og immunoprecipitation over brugen af giftige transcriptional hæmmere, såsom α-amanitin og actinomycin D, er, at der er ingen eller meget lav effekter på celle levedygtighed under kortvarig brug. Men, fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation kun fanger RNA produceret inden for den korte tid, mærkning, langsomt produceret samt hurtigt nedbrudt RNA kan være vanskeligt at måle ved denne metode. Den 5-Bromouridine-mærket RNA fanget af 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres ved reverse transkription, kvantitative polymerase kædereaktion og næste generation sequencing. Alle typer af RNA kan blive undersøgt, og metoden er ikke begrænset til måling mRNA, som præsenteres i dette eksempel.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) giver mulighed for undersøgelse af RNA produktion i celler med ingen eller meget begrænset indvirkning på celle fysiologi under den korte mærkning periode1,2. Metoden er baseret på inkorporering af den syntetiske uridine afledte BrU i nyligt syntetiserede RNA efterfulgt af IP af mærket RNA ved hjælp af anti-BrU antistoffer (figur 1).
Det har været kendt i årtier at proteinsyntesen transcriptionally kan reguleres, og eksistensen af transkriptionsfaktorer var hypotese mere end 50 år siden3. I dag, er det kendt, at flere sygdomme er forårsaget af dysregulering af transskription og RNA stabilitet (supplerende figur S1 i reference4), og evnen til at måle ændringer i RNA produktion er af stor betydning i forståelse sygdom udvikling.
På den anden side giver værktøjer til at regulere RNA produktion nye muligheder for behandling af sygdomme forårsaget af for lidt eller for meget protein udtryk eller protein akkumulering som i Parkinsons sygdom (PD). Den fremherskende protein akkumulere så uopløselige aggregater i PD er α-synuclein, og niveauet af α-synuclein er direkte forbundet med sygdommen, da genet multiplikation af α-synuclein genet forårsager familiær PD5. Desuden aggregater α-synuclein i en koncentration afhænger af måde. Downregulation af α-synuclein mRNA niveauer er derfor en interessant terapeutisk strategi, der er opnået med succes ved hjælp af RNA-interferens for at mindske neuronal celletab i PD gnavere modeller6,7.
Det er vigtigt at være i stand til at måle ændringer i RNA produktion forårsaget af enten sygdom eller terapeutiske indgreb. State of the art metoder ændret for måling steady state niveauer af RNA, som reverse transkription efterfulgt af kvantitative Polymerasekædereaktionen (RT-qPCR), ikke er i stand til at skelne mellem ændringer forårsaget af transkriptionel regulering eller RNA stabilitet. En udbredt metode til undersøgelse af RNA henfald satser blokering af transcriptional maskinen ved hjælp af forbindelser såsom α-amanitin eller actinomycin D efterfulgt af målinger af de rådnende RNA'er. Men der er nogle problemer i forbindelse med en generel blokering af transkription i celler, såsom induktion af apoptose8,9. Ved siden af de cytotoksiske virkninger præsentere transcriptional hæmmere også flere tekniske spørgsmål, såsom langsom cellulære optagelse af α-amanitin og manglende specificitet af actinomycin D (gennemgik i reference10).
For at undgå den samlede blokering af transskription, har været brugt nukleotid analoger, som 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) og BrU. Disse er let tages op af pattedyrceller og indarbejdet i nyligt syntetiserede RNA, aktivering af puls-mærkning af RNA inden for en bestemt tidsramme. BrU er mindre giftigt end 5-EU og 4-TU, hvilket gør det til det foretrukne analoge valg11,12.
BrU-IP kan bruges til at undersøge både antallet af RNA syntese og stabilitet, og således skelne mellem de underliggende årsager til ændringer i total RNA. Denne artikel vil fokusere på måling af RNA syntese og refererer til at referere til2 for nærmere oplysninger om undersøgelsen af RNA stabilitet. For at undersøge RNA syntese, er celler kort mærket med BrU fx for 1 h efterfulgt af BrU-IP1 (figur 1 c). Dette giver mulighed for målinger af RNA syntetiseret inden for den korte tid, mærkning og observerede ændringer vil give et bedre skøn over forordninger i RNA syntese end ved at måle ændringer i total RNA af RT-qPCR. Det skal bemærkes, at selv om mærkning tiden er for eksempel kun 1 h, nedbrydning kan stadig have indflydelse på RNA niveauer overholdes.
RNA fra BrU-IP eksperimenter er egnet til downstream analyse af både RT-qPCR1 eller næste generation sequencing2,13. Andre standard RNA påvisningsmetoder, såsom nordlige blotting eller ribonuklease beskyttelse assay, kan også være gældende for visse RNA'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Udføre alle trinene ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet og holde buffere på is eller i køleskab (bortset fra eluering buffer indeholdende SDS). Protokollen er opdelt i 5 dele: forberedelse af RNA prøver; forberedelse af perler til IP; binding af BrU-mærket RNA til perler; eluering og rensning af bundne BrU-mærket RNA ved 3 trin phenol-phenol/chloroform-chloroform ekstraktion; analyse af RNA (i dette eksempel ved hjælp af RT-qPCR)
1. forberedelse af RNA prøver
- Grev HEK293T celler ved hjælp af en automatiseret celle counter og frø 3,500,000 celler i en 10 cm petriskål i 10 mL vækst medier (Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og 50 µg/mL penicillin/streptomycin) for at få alt > 40 µg RNA ved udvinding 48 timer senere. Vedligeholde celler ved 37 ° C og 5% CO2.
- 48 timer efter såning, Aspirér 8 mL vækst medier og efterlader 2 mL for at undgå udtørring af celler. Tilføj 2 mM BrU og enhver behandling til 8 mL indsugning vækst medier, og fjerne resterende 2 mL fra celler før ansøge 8 mL BrU indeholdende vækst medier. Undgå brug af friske medier efter anmodning af BrU til celler, da dette kan fremkalde ændringer i genekspression.
- Inkuber celler i 1 time med BrU og behandling. Vaske cellerne i 5 mL Hank buffer og trypsinize celler ved hjælp af 2 mL 0,05% trypsin. Tilsæt 8 mL vækst medier for at stoppe reaktionen, overføre cellerne til en 15 mL tube og spin ned celler for 2 min på 1.000 x g.
- Fjern supernatanten og udtrække total RNA fra celle pellet bruger et RNA isolering kit (Se Tabel af materialer) eller enhver anden foretrukket metode, og elueres i RNase-fri H2O. butik RNA ved-80 ° C indtil klar til at fortsætte.
2. fremstilling af perler til IP
- Forberede antallet stikprøver undersøges plus en ekstra højde for tab under pipettering og hvirvle blanding perler i partier. Resuspend anti-mus IgG magnetiske perler grundigt af hvirvel blanding og tegne 20 µL perler per prøve i en RNase-fri 1,5 mL tube. Sted 1,5 mL rør i en magnetisk stå og forlader ca 20 s for perlerne at indsamle på siden.
- Fjern supernatanten, tegne rør fra den magnetiske stå og resuspend i 400 µL 1 x BrU-IP buffer af pipettering. Spin tube meget kort for 2 s i en tabel-top centrifuge, læg det tilbage i den magnetiske stå, og Fjern supernatanten. Gentag trinnet vask en gang.
- Blok uspecifik binding til perlerne ved hjælp af heparin. Resuspend perlerne i 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparin buffer, og forlade roterende for 30 min. vask perlerne én gang, som i trin 2.2.
Bemærk: Heparin er et negativt ladede polymer, som vil konkurrere med RNA'er for bindende. tRNA eller andre irrelevant RNA'er kan også bruges, hvis programmet downstream ikke sekvensering. - Resuspend perlerne i 1 mL 1 x BrU-IP buffer og tilføje 1,25 µg/prøve anti-α-Bromodeoxyuridine antistof, som genkender også BrU. Inkuber perler i 1 timer mens roterende, eller natten ved stuetemperatur.
- Vaske perlerne tre gange som i trin 2.2. Resuspend perlerne i 50 µL/prøve 1 x BrU-IP buffer suppleret med 1 mM BrU og forlade roterende for 30 min til at sænke følsomheden af antistof bundet til perlerne og hermed risikoen for uspecifik bindende i undersøgelsesperioden.
- Vaske perlerne tre gange som i trin 2.2, og pelleten i 50 µL/prøve 1xBrU-IP buffer.
3. bindende af BrU-mærket RNA til perler
- Måle RNA koncentrationer i RNA ekstrakter fra trin 1.3 ved hjælp af ultraviolet-synlige spektrofotometri, og fortynd 40 µg RNA fra hver prøve i RNase-fri H2O til en samlet maengde paa 200 µL.
- Varme RNA prøver for 2 min. ved 80 ° C til at denaturere RNA og spin kort i en bordplade centrifuge. Tilføje 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse inhibitor.
- Tilsæt 50 µL genopslemmes og forberedt perler fra trin 2,6 til hver prøve og forlade roterende 1 h. vask perler fire gange som i trin 2.2.
4. eluering og oprensning af RNA ved 3 trin Phenol-phenol/Chloroform-chloroform ekstraktion
-
Elueres RNA og udføre phenol udvinding
- Resuspend perlerne i 200 µL eluering buffer at eluere RNA, og hurtigt derefter tilføje 200 µL phenol, pH 6.6 (forsigtighed: giftige, se note nedenfor trin 4.1.2) til at fjerne enhver ikke-RNA molekyler i stikprøven.
- Hvirvel mix prøven, og spin 3 min på 25.000 x g i en bordplade centrifuge.
Bemærk: Phenol er giftigt og bør håndteres i et stinkskab, iført hudbeskyttelse. Lidt sure pH-værdi sikrer, at kun RNA, og ikke DNA er ekstraheret. RNA forbliver i den øverste vandig fase på grund af afgifter hydrofile karakter. De hydrofobe kerner af proteiner vil binde phenol og flytte til den nederste organiske phenol-fase.
-
Udføre phenol-chloroform udvinding
- Opsug som meget øverste-fase som muligt (ca 190 µL af de 200 µL, afhængig af erfaring i håndtering) og flytte det til et rør med 200 µL fenol/chloroform, pH 6.6 (forsigtighed: giftige, se note). Sørg for at Opsug den samme mængde på tværs af prøver.
- Hvirvel Bland prøven og spin i 3 min. 25.000 x g.
Bemærk: Chloroform er giftigt og bør håndteres i et stinkskab, iført hudbeskyttelse. Chloroform er føjet til fjerne phenol, der kan påvirke downstream analyse af RNA ved at hæmme reverse transkription14 og polymerase kædereaktion15.
- Udføre chloroform udvinding af sugning den øverste vandfasen som før (nu ca 180 µL), og Overfør til et rør, der indeholder 200 µL chloroform. Hvirvel proeven blandes og spin 3 min på 25.000 x g.
- Opsug den øverste vandfasen som før (nu ca 170 µL) og overføre det til et rør, der indeholder 17 µL (1/10-diskenhed) 3 M CH3COONa, pH 6.0. For at neutralisere og bundfald RNA fra den vandige opløsning, tilføje 2 µL glykogen (20 mg/mL), som udfældes sammen med RNA og synliggør RNA pellet.
- Tilsættes 500 µL 96% ethanol for at øge bindingen mellem salt ioner og RNA og blandes ved at vende røret et par gange. Forlade tube overnatning på-20 ° C eller 15 min på tøris.
- Spin prøve på 25.000 x g, 4 ° C i 30 min. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten og vaske pelleten i 185 µL 75% ethanol til at fjerne enhver resterende salt. Spin på 25.000 x g, 4 ºC i 5 min.
- Kassér supernatanten helt uden at forstyrre pelleten og forlade pellet at tørre 5-10 min med en åben låget. Resuspend i 10 µL RNase-fri H2O anvendes på siden af røret for at undgå at forstyrre pelleten.
5. analyse af RNA
- Forberede cDNA ved hjælp af en cDNA reverse transkription kit (Se Tabel af materialer) eller enhver anden foretrukket metode ved hjælp af 2 µL RNA prøve og 1 µg gær total RNA som bærestof RNA til cDNA syntese reaktion (ikke bruges hvis cDNA bruges til næste generation sequencing). Brug 1 µg RNA uden gær RNA til cDNA forberedelse af tilsvarende input.
- Fortyndet cDNA 1:25 og mix 9 µL fortyndet cDNA med 10 µL qPCR Master mix og 1 µL fluorogenic sonde, begge angivet i Tabel af materialer.
Bemærk: CDNA fortynding afhænger af cDNA forberedelse og qPCR metode anvendes. - Kør følgende qPCR program (f.eks. på en 7500 hurtigt Real-time PCR system eller tilsvarende): 2 min. ved 50 ° C, 20 s ved 95 ° C, 40 cyklusser af 3 s på 95 ° C og 30 s ved 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores første test af BrU-mærkning tid blev udført i AsPC-1 celler. Cellerne blev behandlet med BrU til 0, 1, 2 og 4,5 h, efterfulgt af total RNA udvinding og BrU-IP. GAS5 og GAPDH blev målt i BrU-IP RNA, som viste, at 1 h mærkning var tilstrækkelige til at nå en ca 9 - og 44 - gange ændring i forhold til baggrunden (0 h) for GAPDH og GAS5, henholdsvis.
BrU-IP og analysen ovenfor beskrevne blev brugt til at undersøge hvis ændringerne opdaget i steady state niveauer af α-synuclein mRNA på Polo-lignende kinase 2 (PLK-2) hæmning var forårsaget af ændringer i mRNA syntese1. Gangen 1 h mærkning blev valgt, fordi det giver tilstrækkelig mærkning i forhold til baggrunden (figur 2) og giver også mulighed for behandling tid til at have en effekt. 2 mM BrU behandling ikke fremkalde morfologiske ændringer i HEK293T celler til enten 1 time eller længere 4 h behandling (figur 3A).
Α-Synuclein transfekteret HEK293T celler blev behandlet for 1 h med DMSO eller en bestemt PLK-2 hæmmer (PLK-2i) i nærværelse af BrU at mærke frisk syntetiserede RNA. Celler blev herefter høstes og total RNA blev udvundet. BrU-mærket RNA er produceret i 1 h behandling blev indsamlet ved hjælp af BrU-IP ("BrU-IP" i figur 3B) fra den samlede pulje af RNA ("Input" i figur 3B). Mængden af RNA opnås med BrU-IP fra 40 µg starter materiale varierer mellem forskellige cellelinjer, og vi generelt får ca 500 ng fra HEK293T celler, men kun 10-50 ng fra HeLa celler. PLK-2 hæmning forårsagede en stigning i α-synuclein mRNA i både Input og BrU-IP (figur 3B) tyder på, at stigningen i steady state RNA er forårsaget af en stigning i syntesen af RNA. At sikre, at PLK-2i forårsager ikke blot en generel stigning i RNA produktion, 3 ekstra endogene gener (ACTB, HMBS og NADH) blev målt (figur 4). Ingen af disse gener blev øget i Input (figur 4A) og BrU-IP (figur 4B) på PLK-2i behandling.
For at validere specificiteten af BrU-IP, var en kontrol med ikke-BrU behandlede celler inkluderet. Niveauer af 18sRNA fanget af BrU-IP fra BrU-behandlede og ubehandlede celler blev sammenlignet (figur 5). Dette viser klart, at BrU-IP er meget specifikke og kun fanger en meget lille brøkdel af de ikke-mærket RNA (figur 5).
Fordi den BrU-mærket RNA er kun produceret inden for 1 time, er det vigtigt at vælge et korrekt reference gen, da nogle normalt passende gener kan udtrykkes i for lav koncentration skal være pålidelige. 18sRNA blev valgt som en reference genet for data præsenteret i figur 3B og figur 4 på grund af sin høje overflod. Flere reference gener var, dog testet, og nogle viste høj tærskel cyklusser (> 30) (figur 6). Denne data viser også, at forskellen mellem BrU-mærket IP'ed RNA og total RNA i input er ca 5 Ct's, og nogle RNA'er udtrykt på lavt beløb i cellen kan derfor ikke korrekt påvises efter BrU-IP.
Figur 1: Beskrivelse af BrU-IP for undersøgelse af RNA syntese. (A) RNA er transskriberet i celler fra DNA af RNA polymeraser. (B) ved tilsætning til medierne, BrU er taget op af celler og indarbejdet i den nyligt transskriberede RNA. (C) til måling af RNA syntese satser: (1) nyligt syntetiserede RNA er mærket for 1 h med BrU, (2) RNA er udvundet fra cellerne umiddelbart efter mærkning, (3) BrU-mærket RNA er immunoprecipitated ved hjælp af anti-BrU antistoffer, (4) BrU-mærket (og tilsvarende input) er RNA analyseret af RT-qPCR eller sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af mærkning tid. Eksempel på en indledende vurdering af BrU-mærkning tid. AsPC-1 celler dyrkes i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% føtal bovint serum og 50 U/mL / 50 µg/mL penicillin/streptomycin blev behandlet med BrU i en endelig koncentration på 2 mM for 0, 1, 2 og 4,5 h før RNA udvinding og analyse af RT-qPCR. Data er kvantificeret som 2-Ct, og præsenteres som middelværdien af tekniske tre ± standardafvigelse, n = 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative resultater viser Input og BrU-IP RNA fra DMSO og PLK-2i behandlede celler. (A) 1 h og 4 h 2 mM BrU behandling ikke fremkalde nogen synlige morfologiske ændringer i HEK293T celler. Skalalinjen = 100 µm. (B) Adapted figur fra reference1. 3,500,000 HEK293T celler var seedet pr. 10 cm parabol og transfekteret med en plasmid udtrykker α-synuclein 24 h efter såning. 24 h post Transfektion celler blev inkuberet 1 h med BrU DMSO eller PLK-2i, efterfulgt af RNA udvinding og BrU-IP. Analyse af RNA blev udført af RT-qPCR bruge sonden sæt rettet mod menneskelige SNCA (α-synuclein) og 18sRNA. BrU-IP og Input SNCA var kvantificeret i forhold til BrU-IP og Input 18sRNA, henholdsvis ved hjælp af metoden 2-ΔΔCT . Resultaterne var normaliseret til DMSO-behandlede prøverne. Data præsenteres som mean ± standardafvigelser. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af studerendes uparret t-test, * p < 0,001, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: måling af andre gener ikke ændret af PLK-2i. PLK-2i ændrer hverken samlede eller syntetisk RNA af ACTB, HMBS og NADH. (A) ACTB, HMBS og NADH RNA fra input blev målt i tre eksemplarer i et eksperiment og kvantificeres i forhold til 18sRNA i Input ved hjælp af metoden 2-ΔΔCT . Værdier var normaliseret til DMSO behandlet prøver og barer repræsenterer gennemsnittet af tre ± standardafvigelser, n = 1. (B) ACTB, HMBS og NADH var også måles på BrU-IP'ed RNA og kvantificeres i forhold til 18sRNA i BrU-IP. Værdier var normaliseret til DMSO og præsenteret som i A, n = 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: specificiteten af BrU-IP. Til sammenligning af 18sRNA fanget af BrU-IP fra BrU - og BrU-ubehandlede celler, var RNA fra BrU-IP valideres i forhold til Input RNA for at tage højde for forskelle i begyndende materiale og herefter normaliseret til BrU-behandlede prøver. Kun en meget lille brøkdel (0,002) af ikke-BrU-mærket 18sRNA var immunoprecipitated, viser, at BrU-IP er meget specifikke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: niveauer af forskellige mRNAs i BrU-IP RNA i forhold til Input RNA. Flere potentielle reference gener blev testet, fordi nogle RNA'er vil være til stede i meget lave koncentrationer i BrU-IP RNA på grund af små mængder af producerede RNA inden for 1t BrU behandling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af BrU-IP for bestemmelse af RNA produktion af mærkning af nyligt produceret RNA for 1 h med BrU, efterfulgt af umiddelbar RNA udvinding og immunoprecipitation af BrU-mærket RNA. Denne metode er tidligere blevet beskrevet i reference16, og denne artikel indeholder nogle ekstra trin for at øge IP specificitet og RNA renhed, af pre behandling af perler med lave koncentrationer af BrU samt et phenol-chloroform rensning skridt til øge RNA renhed efter Undersøgelsesperioden. Derudover præsenterer vi også data, der her viser specificiteten af BrU-IP ved at sammenligne RNA erobret fra BrU og ikke-BrU behandlede celler. Phenol-chloroform rensning er billigt, men i betragtning af de ringe mængde af RNA mærket med BrU, øget signaler i den efterfølgende analyse kan hentes ved hjælp af RNA oprensning kits i stedet. Vores erfaring er dog at den mest lige udvinding af RNA på tværs af prøver er fremstillet ved hjælp af phenol-chloroform rensning.
BrU-mærkning og -IP er, i modsætning til analyse af total RNA niveauer, i stand til at undersøge de underliggende årsager til ændringer i steady state RNA niveauer. Metoden har ingen eller begrænset effekter på celle fysiologi, i modsætning til brugen af transcriptional hæmmere sådan som α-amanitin og actinomycin D. Det er blevet foreslået, at sammenligning af nyligt syntetiserede RNA til steady state niveauer kan bruges til at beregne RNA henfald priser17, og BrU-IP metode beskrevet her muliggør samtidige bestemmelse af både RNA syntese og nedbrydning i én analyse.
I figur 5viste vi, at RNA er kun IP'ed fra BrU behandlede celler, viser, at der rent faktisk BrU indarbejdet i RNA i cellelinje bruges her. Vi foreslår dog foretage en indledende test af BrU indarbejdelse i RNA i andre cellelinjer før du udfører BrU-IP. Dette kunne for eksempel ske ved hjælp af anti-BrU antistoffer til at kvantificere BrU i total RNA ekstrakter via dot skamplet eller enzym-forbundet immunosorbent assay.
Her har vi ikke præsenteret en test af BrU-IP effektivitet på prøver, men dette kan undersøges ved hjælp af BrU-mærket pigge i RNA enten fremstillet in vitro- eller fra en anden organisme, såsom Drosophila melanogaster. Denne RNA kunne så også bruges i downstream kvantificeringer og normalizations.
Korrekte pipettering teknik er afgørende, når du udfører meget følsomme kvantitative assays, som BrU-IP og RT-qPCR, og en særlig indsats bør gøres til at udføre lige pipettering på tværs af prøver. Phenol-chloroform ekstraktioner kræver nogle erfaringer, men efter utilfredsstillende pipettering, de vandige og fenol/chloroform faser kan igen blandet og centrifugeres igen.
Denne protokol antyder BrU-mærkning for 1 h ved måling af RNA syntese. Denne mærkning tid giver et groft skøn over ændringer i transskription, da hovedparten af menneskelige og mus mRNAs er blevet anslået til har half-life > 6 h18,19. Forsigtighed bør dog, udøves når fortolke dataene opnået, da mange RNA'er har halveringstider < 1 h18,19, såsom flere afskrifter induceret af Lipid A, som hurtigt stige efter stimulation og falde tilbage til base-line niveauer inden for 2 h efter induktion20. For at nedsætte risikoen for påvirkninger fra RNA nedbrydning, BrU-mærkning tid kan være faldet, men det er også vigtigt at mærke nok RNA for at kunne skelne RNA fremstillet af BrU-IP fra baggrunden (som var opnået efter 1 h mærkning i vores hænder ( Figur 2)). En anden mulighed er at måle både RNA syntese og nedbrydning af interesse ved hjælp af BrU-mærkning og IP-genet, sidstnævnte metode er beskrevet i2. Data fra disse to tilgange supplerer hinanden, og hvis en ændring i syntesen mellem to betingelser er målt, men ingen ændring er set i forfald priser kan det konkluderes, at de målte ændringer i RNA var på grund af regulering af syntesen. Det er dog vigtigt at huske, at begge teknikker måler kun RNA funktionalitet ved forkalkulation RNA niveauer og helt undlader at undersøge andre mekanismer, der påvirker RNA funktioner såsom kemiske modifikationer14.
Da cellerne inkuberes med BrU i kun 1 h, kan meget langsomt producerede mRNAs være vanskeligt at måle ved hjælp af metoden BrU-IP. Dette er et punkt, hvor brugen af transcriptional hæmmere såsom α-amanitin og actinomycin D kan være foretrukne over BrU-IP, men de kan kun bruges til at måle ændringer i nedbrydning og ikke direkte måle RNA produktion. De lave niveauer af BrU-mærket RNA kan også løses ved at øge inkubationstiden med BrU, lang inkubationstid gange dog øge risikoen for påvirkninger af RNA nedbrydning. I så fald er det ikke længere muligt at vide om ændringer i BrU-mærket RNA er forårsaget af ændringer i RNA produktion eller forfald.
I dette eksempel downstream analyse af de erobrede BrU-mærket RNA udføres ved hjælp af RT-qPCR, men næste generation sequencing er også en udbredt downstream metode til skærmen for ændringer i en stor pulje af RNA'er2,13. Ligeledes metoden er ikke begrænset til analyse af mRNAs, men kan analysere alle typer af RNA'er2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Lundbeckfonden, Aarhus Universitet, Dandrite og Lundbeck A/S støttet dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
