Summary
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע
Abstract
שלד התא, המורכב אקטין שמתרגם microtubules, חוטים ביניים (אם), ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על צורת התא קוטביות, תנועתיות. הארגון של רשתות אקטין, microtubule נחקרה בהרחבה, אבל זה של IFs לא עדיין במלואו מאופיין. אם יש קוטר ממוצע של 10 ננומטר וטופס רשת חובק הציטופלסמה של התא. הם קשורים פיזית עם אקטין, microtubules דרך המנועים המולקולריים, cytoskeletal linkers. חזק זו בלב מנגנוני הרגולציה להבטיח ברגולציה מתואמת של שלוש הרשתות cytoskeletal הדרושים עבור רוב הפונקציות התא. לכן חשוב להמחיש IFs לבד וגם עם כל אחד cytoskeletal הרשתות האחרות. עם זאת, אם רשתות הן וצפופה רוב סוגי תאים, במיוחד בתאי גליה, מה שהופך את הרזולוציה שלה מאוד קשה להשיג עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה (לרוחב ברזולוציה של ~ 250 ננומטר). ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (dSTORM) היא טכניקה המאפשרת רווח רוחבי ברזולוציה של סדר גודל אחד. כאן, אנו מראים כי dSTORM הלטראלי הרזולוציה מספיקה לפתור הארגון צפופה של הרשתות אם ושל, בפרט, אם חבילות סביב microtubules. איגוד חזק כזה סביר להניח להשתתף בוויסות מתואמת של שתי רשתות אלה מאי, להסביר איך vimentin IFs תבנית לייצב את הארגון microtubule וכן יכולת להשפיע microtubule תלויים vesicular סחר. באופן כללי יותר, אנו מראים איך התצפית של שני רכיבים cytoskeletal בטכניקה בצבעים dual dSTORM מביאה תובנה חדשה שלהם אינטראקציה הדדית.
Introduction
Cytoplasmic ביניים (IFs) זיריהם nm 10-קוטר הומו - או heteropolymers של קבוצת תאים סוג משנה ספציפית של אם חלבונים. IFs להשתתף מגוון רחב של פונקציות הסלולר כגון תגובות תנועתיות, התפשטות, מתח התא. תפקידם מפתח מודגשת על ידי העובדה כי מחלות אנושיות יותר מ-90 נגרמות ישירות על ידי מוטציות בחלבונים אם; למשל, שינויים בהרכב אם מלווה בצמיחה הגידול והפצת1,2,3. שם גדל ראיות שלוש מערכות שלד התא לעבוד בשיתוף פעולה כדי הפונקציות הסלולר כגון תא קיטוב, מחלקת ההגירה2,3. מאז יש זוג חזק בין אדריכלות מרחבי פונקציות, זה הכרחי לקבל תובנות בארגון המבני של IF זיריהם אחרים ולהבין טוב יותר את cytoskeletal צולבות לדבר. מאמר זה מספק פרוטוקול לבצע את dSTORM כפול-צבע (ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ) טכניקה רזולוציה סופר4 , איך זה משמש כדי לחקור את האינטראקציה בין אם ו microtubules, קבוע, תרבותי תאים ובדו מימד (2D).
פותחו מספר שיטות זיהוי סופר האחרונות בעשור התגליות שם היו על המקור של פרס נובל לכימיה בשנת 20145. בין כל שיטות אלה שקרים השיטות מבוססות על לוקליזציה מולקולה בודדת כמו פאלם6 (Photo-Activated לוקליזציה מיקרוסקופ) העושה שימוש photoswitchable פלורסנט חלבונים, סופה7 עם זוגות של fluorophores או dSTORM4 עם fluorophores קונבנציונלי. כל שיטות אלה מבוססות על אותו עיקרון אשר מורכב (i) הבורר של רוב הכתבים פלורסנט למצב "כבוי" "(הלא-פלורסנט), (ii) ההפעלה סטוכסטי של קבוצת משנה של אותם לתוך פלורסנט המדינה כדי להתאים לשפה שלהם מיקום מרחבי עם דיוק ננומטר, וכן (iii) החזרה על התהליך הזה על מנת להפעיל כמה שיותר קבוצות משנה של fluorophores ככל האפשר. תמונה סופית הוא שיחזר באמצעות כל הגרסא המקומית של מולקולות מופעל, מתן החלטה לרוחב ל ~ 20-40 ננומטר. מספר מערכות אופטיות ממוסחר ומאפשר דקל/סופה זמינים כעת עבור ביולוגים לניסויים שגרתית. . מערכת אחת כזאת שימשה ללמוד איגוד מבניים microtubules, IFs. בין כל מולקולה בודדת המבוסס על לוקליזציה השיטות, הטכניקה dSTORM כפול-צבע נבחר, כי זה גם מתאים להתבונן אזורים מחליפי דק מאוד (< 1 מיקרומטר) של תאים חסיד יכולה לספק שיפור משמעותי של רזולוציית תמונה השקעה מינימלית של זמן וכסף. אכן, dSTORM היא טכניקה צדדי ונוח מאוד תואם תקן צבעים אורגניים בשימוש שגרתי עבור צביעת סלולרית ו- immunofluorescence.
בעוד תמונות dSTORM צבע אחד הם פשוטים יחסית להשיג באמצעות fluorophore את, Alexa6478, dSTORM צבע כפול דורש כדי למטב את תנאי הניסוי כך שני צבעי יכולה למצמץ כראוי במאגר שבחרת, במיוחד כאשר יש מוגבלת עוצמת הלייזר. ניירות מעולה כבר זמינים על שיטות כדי להגדיר צבע רב הדמיה עם dSTORM9,10,11,12,13, הניירות האלה להסביר בפירוט את מקורות אפשריים רזולוציית תמונה מפורק והאיורים וכן כיצד להתגבר עליהם. מאמר זה, התנאים ניסיוני אופטימלית קיבוע תאים, immunostaining, הכנת הדוגמא, הדמיה רכישה ושחזור תמונות מתוארות על מנת לרכוש תמונות של רשתות צפופות אם cytoplasmic microtubules ב גלייה עם dSTORM צבע כפול. בקצרה, שיטת החילוץ/קיבוע המתוארים Chazeau ואח12 היה מותאם גלייה ומשמש בצעד קיבוע שאחרי, ריכוז נוגדנים ממוטבת, מאגר סערה עם 10 מ מ MEA שמתואר דמפסי9 ואח שהיה מצא אופטימלי כדי להפוך את ניסיוני להגדיר סוג הדגימה.
גלייה אקספרס בעיקר שלושה סוגים של חלבונים אם: vimentin, nestin ו- GFAP (חלבון fibrillary חומצי גליה). חלבונים אלה שלושה הראו להם במשותף פולימריזציה האסטרוציטים14. הראנו קודם לכן באמצעות רזולוציה סופר מובנה תאורה מיקרוסקופ (SR SIM) כי ניתן למצוא חלבונים אם שלושת אלה באותה נימה אם יחיד, כי הם מציגים את דומה הפצה ודינמיקה תאי גליה 15. בשל הדמיון בין החלבונים אם שלוש, vimentin מכתים שימש ככתב עבור הרשת אם כל. שימוש dSTORM, הצלחנו לפתור כמה צרורות אם טופס לאורך microtubules, דבר שלא היה אפשרי עם עקיפה מוגבלת מיקרוסקופ טכניקות15. תצפיות אלה עשוי לעזור כדי להבין איך vimentin IFs תבנית microtubules ולווסת את מסלול הצמיחה שלהם, לקידום שמירה על ציר קוטביות במהלך ההעברה תא16. תמונות ברזולוציה סופר סיפק מידע מפתח האינטראקציה הדדית של שתי תת-מערכות cytoskeletal, והביא תובנה הקישור בין האגודה מרחבי פונקציה מקומיים אשר יכול להיות הסלולרי-סוג ספציפי17. באופן כללי, ניתן להשתמש בצבעים dual dSTORM ללמוד crosstalk בין אלמנטים cytoskeletal או סוגים אחרים של organelles, ובלבד תנאים טובים immunostaining נגישים מבחינת צפיפות וספציפיות. טכניקה זו יהיה שימושי כדי לאפיין טוב יותר את השינויים שלד התא במהלך astrogliosis, ב גליובלסטומה, הגידול הנפוץ ביותר, ממאיר ביותר של מערכת העצבים המרכזית, איפה הביטוי של חלבונים אם שינו 18 ,19,20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coverslips הכנה (יום 1, 30 דקות)
- במקום coverslips זכוכית של 18 מ מ nº1.5H (170 מיקרומטר + /-5µm) דקה על מתלה פלסטיק.
- לשים ארון התקשורת גביע 100-mL מלא עם אצטון ומשרים למשך 5 דקות.
- העברת ארון התקשורת גביע 100-mL מלא עם אתנול מוחלטת ומשרים למשך 5 דקות.
- להעביר את המדף גביע 100 מ ל חדש מלא עם אתנול מוחלטת ולמקם את הספל מכשיר אולטרה סאונד נקי יותר (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר. הקש "על" והמתן 10 דקות.
- המתלה תחת תא למינארי וניתן על coverslips יבש או יבש על coverslips עם זרימת אוויר מסונן.
- לשים על האצטבה עם coverslips מכשיר נקי פלזמה. . הפעילי את משאבת ואקום, סגור את הדלת, להמתין 3 דקות להפוך את שואב האבק ולעבור על מסך הפלזמה עבור 1 הגבלת שימוש coverslips זמן קצר לאחר הניקוי. אין לאחסן אותם.
2. תאי ציפוי (יום 1, 20 דקות)
- צומחים תא גליה הקו U373 ב מינימום הכרחי בינוני (מאמ) עם 10% סרום שור עוברית, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 1% חומצת אמינו שאינן הכרחיות בקוטר 10 ס מ פלסטיק פטרי.
- הכנס coverslips זכוכית נקי דקה 12-ובכן הצלחות מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית ולהוסיף 1 מ"ל של טרופה תא בינוני לכל טוב.
- לקחת מנה המכילה תאים מן החממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
- להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל PBS.
- להסיר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA.
- מקם את המנה חזרה החממה למשך 2-3 דקות.
- להוסיף 10 מ של מדיום חם טרופה-37 מעלות צלזיוס על המנה, resuspend את התאים.
- תאים 100 000 על הזרע לכל טוב (~ 150 µL של תאים) לוחית 12-ובכן המכילים את coverslips.
- המתן לפחות 6 שעות (או לילה) לאפשר הפצת התא.
3. תא קיבעון (יום 2, 2h)
- הכנת המאגר שלד התא בצינורות 80 מ"מ, 7 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA, 150 מ"מ NaCl, ולהתאים את ה-pH ל 6.9.
- לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
- להסיר את PBS ולהוסיף בעדינות 1 מ"ל לכל טוב של פתרון החילוץ/קיבעון (0.25% גלוטראלדהיד, 0.3% טריטון X-100 במאגר של שלד התא) טרופה ב 37 º C.
- תקופת דגירה של 60 s בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון ולהוסיף בעדינות 1 מ"ל לכל טוב של טרופה המוכנים באופן טרי 4% מחברים (paraformaldehyde) פתרון מדולל במאגר של שלד התא.
התראה: שימוש בכפפות ולעבוד מתחת למכסה המנוע כימי. - מקם את הצלחת 12-ובכן בחזרה בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להסיר את כדורגלן ולהוסיף 3 מ"ל של PBS לכל טוב.
הערה: לעבוד מתחת למכסה המנוע כימי עם כפפות ולשים את כדורגלן ממוחזר סל ספציפיים. - לשטוף פעמיים עם PBS.
- להסיר את PBS ולהוסיף הטרי 10 מ מ NaBH4 הפתרון מדולל ב- PBS כדי להרוות את autofluorescence מגיע גלוטראלדהיד.
- תקופת דגירה של 7 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכניסו את NaBH ממוחזרים4 סל ספציפיים.
- רחץ שלוש פעמים, חמש דקות עם PBS.
- להסיר את PBS ולהוסיף את הפתרון חסימה (5% פתרון BSA PBS).
- תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר (או למשך הלילה ב 4 ° C).
הערה: המאגר שלד התא ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים. מחברים, NaBH4 , גלוטראלדהיד כדאי לבצען באמצעות טיפול מיוחד (הוד, כפפות, פחי מיחזור ספציפי). פתרונות צריך להיות נוספו והוסרו בעדינות על מנת לשמור על השלמות של התאים. חשוב לא לתת את התאים יבש.
4. Immunostaining (יום 2, 5 שעות)
- להכין את הפתרון של נוגדנים הראשי באמצעות אנטי-vimentin, אנטי-טובולין לדילול שבערך בפתרון חסימה.
- שים µL 100, טיפות מדולל נוגדנים העיקרי בשכבה הסרט פרפין ולמקם את coverslips מעליהם עם תאים מופנות כלפי מטה.
- דגירה תאים עם נוגדנים העיקרי עבור 2 ה Put coverslips בחזרה לתוך צלחת 12-ובכן מלא עם PBS. שטיפה שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם ב- PBS בטמפרטורת החדר על תפקודי לב / נשימה.
- בינתיים, מכינים את הפתרון נוגדנים משניים באמצעות אנטי-העכבר Alexa647 ו- Alexa555 אנטי חולדה לדילול 1:1, 000 בפתרון חסימה. דגירה תאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר. המשך כמו 4.2. הגנה על התאים מפני אור.
- תחזיר coverslip בצלחת 12-ובכן מלא PBS. שטיפה שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם ב- PBS בטמפרטורת החדר על תפקודי לב / נשימה. להסיר את PBS ולהוסיף 0.5 מ של PBS מעורבבים עם 1 µL של 0.1 חרוזים tetraspeck מיקרומטר.
- לשים הבארות תפקודי לב / נשימה במשך 30 דקות יש לשטוף עם PBS. הסר את PBS, דגירה את התאים עבור חמש דקות עם פתרון PFA 4% ב- PBS. לשטוף שלוש פעמים ב- PBS.
הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן מספר שבועות ב- PBS ב 4 º C. Immunostaining צריך להיעשות ברגע האחרון.
5. משאבות (יום 3, 5 דקות)
- לשים את aliquots של מאה (cysteamine, 1 מ', pH 8.3), גלוקוז אוקסידאז (100 x, 50 מ"ג/מ"ל), קטלאז (500 x, 20 מ"ג/מ"ל) בסל קרח.
- הכנת 50 מ של מאגר טריס-NaCl (50 מ מ. טריס, 10 מ מ NaCl, pH = 8) בתוספת 10% של גלוקוז (100 מ"ג/מ"ל).
- להכין 1.2 מ של הדמיה מאגר לפני הדמיה עם 10 מ מ MEA, 0.5 מ"ג/מ"ל (75 U/mL) גלוקוז אוקסידאז, µg/mL 40 קטלאז (80-200 U/mL) במאגר טריס-NaCl עם גלוקוז 10%.
- הר coverslip המכילות את התאים שכותרתו את המחזיק לדוגמה מגנטי (למשל chamlide קאמרית) ולהוסיף למאגר הדמיה כדי למלא לגמרי את התא. אשים את המכסה ולוודא שאין אין בועת האוויר בין המאגר הדמיה את המכסה.
- לנקות את החלק התחתון של הדגימה עם אתנול מוחלטת ואמת שאין דליפה. השתמש משחה כדי לאטום את בעל מדגם כראוי במידת הצורך.
הערה: להכין 1 מ' מניות של פתרון MEA (pH 8.3 יש להתאים באמצעות HCl), מלאי של גלוקוז אוקסידאז ב 50 מ"ג/מ"ל, מלאי של קטלאז-20 מ"ג/מ"ל מים, להפוך aliquots ואחסן אותם ב-20 ° C עד לחודש עבור MEA ושנה גלוקוז אוקסידאז, קטלאז. לא להקפיא מחדש aliquots. להכין מאגר טריס-NaCl מראש ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים. להוסיף גלוקוזה ביום של הניסוי (שלב 5.3).
6. תמונת רכישה (יום 3, ~ 1h בכל תא)
- . הפעילי את המיקרוסקופ לעבור על התוכנה רכישת והקש להפעיל מערכת.
- בחר הרחב בכרטיסיית רכישת כלי הדמיה ההתקנה בקבוצה כלי Setup Manager. בחר את מצב לייזר WF (שדה רחב) של רכישה. בחר את המטרה X 100 נה 1.46 . בחר את מצב TIRF u-HP אשר משתמשת קולימטור כדי להפחית את שדה הראיה להיות מואר, לרכז את האנרגיה לייזר לתוך אזור קטן יותר. השתמש את optovar עדשה 1.6 x שנותן בגודל בפיקסלים של 100nm.
- בחרו בכלי זמן סדרת ולהגדיר את זמן לשגות עם מסגרות 50 000 ו- ms 0.0 בין מסגרות. הרחב את הכלי ערוצי שבקבוצה רכישה פרמטר כלי ובחר 'הצג הכל'.
- הגדר את המסלול Alexa647: לבדוק את 642 ו 405 לייזר קווי עירור ולקבל כדי להפעיל אותם. בחר את מסנן פליטה "655 LP" ההתקנה הדמיה. לשנות את השם "647".
- לחץ על '+' בכלי של ערוצי ' כדי להוסיף מעבר אור נוסף ולבחור את המצב "למתג ההסטה כל: מסגרת" בכלי הדמיה ההתקנה . בדוק 561, 488, קווי לייזר 405 ומקבלים כדי להפעיל אותם. בחר "BP 570-650 + LP750" פליטת לסנן ולהשתמש optovar עדשה 1.6 x. בדוק מצב TIRF-uHP נבחרה. לשנות את המסלול "555".
- בחרו בכלי רכישה מצב ולהגדיר את גודל המסגרת 200 x 200 פיקסלים. בחרו בכלי מכשירים חדישים ואסטרטגיה ולהגדיר את המוקד מובהק למסגרות 1 000 (אם יש מערכת נעילת פוקוס).
- לשים שמן על המטרה, שים המדגם. בחר את הכרטיסיה אתר ופתח את התריס של המנורה זריחה. למצוא את המוקד וחפשו את התא כדי התמונה באמצעות העיינית של המצלמה. . שים אותה במרכז שדה הראייה באמצעות ג ' ויסטיק
- בחר את הכרטיסיה רכישה לחזור למצב רכישה. לבחור את המסלול "647", להגדיר את עוצמת הלייזר 642 0.2%, להגדיר את עוצמת הלייזר 405 ל- 0, להגדיר את זמן החשיפה 50 מילישניות, על הרווח של 50. בחר את מצב רכישה רציף כדי לבחון את התא על המסך. התאם את המוקד. כדי לוודא שאין חרוז tetraspeck אחת לפחות, שדה הראייה, להגדיל את החדות לראות אותם במידת הצורך. השתמש מצב התאם אוטומטית את גודל התצוגה. קחו תמונת wide-שדה epifluorescence של הרשת vimentin על ידי לחיצה על הצמד ולשמור אותו. כדי לבדוק את התאורה TIRF, לחץ על TIRF, לכוון את זווית תאורה ו/או קולימטור במידת הצורך יש שדה הומוגנית של תאורה ולשמור אותו.
הערה: חשוב כי הדימויים TIRF ו פלורסנטי הם באיכות גבוהה לפני התחלת רכישת נתונים גולמיים. חוטים מקוטע, שכותרתו שאינו אחיד יהיה להצמיח תמונות dSTORM באיכות ירודה. - המסלול "647", בחר נקה ובחר המסלול "555". לקחת תמונה epifluorescence של הרשת microtubule ולשמור אותו. לקחת תמונה TIRF ולשמור אותו יותר מדי.
- בטל את הסימון של המסלול "555", בחר, לבדוק את המסלול "647" ולאחר מכן לחץ רציף. לשים את הרווח 0, זמן חשיפה גב' 10 להגדיר את עוצמת הלייזר 642-nm ל- 100% כדי לשאוב את מרבית צבעי Alexa647 המדינה כהה (~ 2 קילוואט/cm2). ברגע fluorophores מתחילה להבהב, לשים את החשיפה 15 ms ולהשיג ל-300. בחר את המצב TIRF של תאורה. השתמש במצב מחוון טווח ללא התאם אוטומטית את גודל כדי לוודא כי מולקולה בודדת אותות לא להרוות את המצלמה (שצוין על-ידי צבע אדום). במקרה כזה, להקטין את הרווח עד הרוויה נעלם. חרוזים Tetraspeck יישאר רווי בתחילת שנת הרכישה. הקש להפסיק לעצור את השגחה מתמדת של התא.
- להרחיב את הכלי עיבוד באינטרנט ולבדוק באינטרנט עיבוד דקל לדמיין את התמונה סערה במהלך הרכישה. השתמש בפרמטרים הבאים: 9 עבור גודל מסכת השיא (קוטר 9 פיקסלים) ו- 6 עבור שיא עוצמת רעש. תזות פרמטרים יגדירו את מולקולות נלקחים בחשבון בתהליך העיבוד (מספיק בהיר ולא חופפים). בכלי PAL-סטטיסטיקה , בחר סוג מגרש: היסטוגרמה, ומקור היסטוגרמה: דיוק. הקש התחל רכישה.
- במהלך הרכישה, להתמקד במידת הצורך (אם יש אף התקן נעילת פוקוס). להתאים את הפרמטרים (חשיפה, כוחות לייזר) בסופו של דבר לעבור על קו 405 ננומטר לייזר (החל ב- 0.001%) לשמור על צפיפות בינונית של fluorophores עם מרחק מינימלי של 1 מיקרומטר בין מולקולות יחיד (> 9 פיקסלים של 100 ננומטר, גודל מסכת השיא) ( איור 1A-B). אם הצפיפות מולקולה הוא קצת גבוה מדי, השתמש במצב חילו (גיליון מאוד נוטה, למינציה אופטי) של תאורה במקום TIRF. זה יגביר את עוצמת הלייזר על-ידי 20%. ודא כי הפסגה של לוקליזציה דיוק על ההיסטוגרמה מתחת לתמונה המשוחזרת ממורכזת מסביב או מתחת 10 ננומטר.
הערה: בדרך כלל מספר מולקולות פוחתת עם הזמן, הכוח 405 ננומטר לייזר הוא גדל לאט בהתאם. המטרה היא להקטין את מידת הדיוק של לוקליזציה (היסטוגרמה המוצגת מתחת לתמונה סופר רזולוציה) כמה שיותר לשיא מתחת 10 ננומטר (איור 1C). להגדיל את החדות של התמונה דקל במידת הצורך, אם חרוזים בהיר מדי נוכחים בשטח. - הקש להפסיק לעצור את הסרט, כאשר יותר מ- 10 הגרסא המקומית6 הושגו (בדרך כלל לאחר מסגרות 40 000). לשים את הלייזרים בחזרה ל- 0.2% (642 ננומטר) ו- 0 (405 ננומטר). שמור את הנתונים הגולמיים של רכישת סערה עם התבנית .czi. מסלול "647" בכלי ערוצים, ולא בחר נקה ובחר מסלול "555".
- הגדר את זמן החשיפה 25 ms ולהשיג ל- 0. לחץ על לחצן רציף ולהגדיר לייזרים 488 והן 561 ב- 100% כדי משאבת צבעי Alexa555 המדינה כהה (~ 2 קילוואט/cm2 כל אחד). ברגע fluorophores מתחילה להבהב, לשים הרווח של 250, השתמש במצב תאורה חילו ולבדוק כי מולקולות יחיד לא להרוות את המצלמה עם טווח מחוון מצב. אם זה המקרה, להקטין את הרווח. לחץ על עצור. להקטין את עוצמת הלייזר-488 כדי 50%.
- הקש התחל רכישה. במהלך הרכישה, להגדיל בהדרגה את הרווח יהיה תמיד על הגבול של רוויה. להגדיל צעד אחר צעד הכוח 405 ננומטר לייזר כדי לשמור על צפיפות בינונית של מולקולה בודדת בתוך שדה הראייה (ראה שלב 6.18). הנמך את עוצמת הלייזר 488 ל 20-30% כאשר הלייזר 405 הוא גבוה יותר 15%. ואז להפחית בהדרגה את 488 תוך הגדלת קו 405 לייזר על מנת לשמור על מהבהב של המולקולות מהר ככל האפשר. הקו לייזר 488 בשילוב עם הלייזר עירור 561 בעוצמה מירבית עולה על והן את שערי fluorophores, ואילו קו 405 לייזר מגבירה את קצב.
- עוצרים הרכישה כאשר הגרסא המקומית יותר מאשר 500 000 הושגו (אחרי בערך בגובה 20,000 מסגרות) או יותר כאשר מולקולות נוספות לא ממצמץ. שמור את הנתונים הגולמיים של רכישת סערה עם התבנית .czi.
הערה: תמיד להתחיל עם הגל גבוה יותר כדי למנוע הלבנת (או הפעלה) של צבעים אחרים. מאז תא chamlide לא אטום, זה אפשרי לשנות את המאגר הדמיה באופן קבוע, למשל כדי לבדוק תנאים מאגר שונים. באמצעות קו לייזר 488 כדי לרוקן את צבעי אלקסה 555 נחוץ רק כאשר עוצמת הלייזר 561 מוגבל (עם לייזרים 100 מגה-וואט).
7. תמונת שחזור (5 דקות)
- בכלי PAL-להיסחף , השתמש בסוג התיקון מבוסס מודל מקטעים אוטומטי עם הגודל המרבי של 8. לחץ החל מספר פעמים ברציפות עד נסחפים מתוקן. תיקון זה מבוסס על מודל החלת אלגוריתם מבוסס על ניתוח קרוס-המתאם אשר מתקנת את הסחף.
- באמצעות הכלים PAL-מסנן , לשפר את המראה של התמונה סערה על-ידי בחירה רק מולקולות אשר נרשמו נקודתית בצורה הטובה ביותר. לדוגמה, להגביל את דיוק לוקליזציה ל- 30 nm ו את PSF ל 120-180 ננומטר.
- השתמש רזולוציה פיקסל של 5 או 10 ננומטר הכלי PAL-רינדור , כמו גם מצב תצוגה לפי עקומת גאוס, עם גורם הרחבה של 1 PSF. לבחור רינדור אוטומטית טווח דינמי HR עם ערך של 95%, רינדור אוטומטית טווח דינמי SWF עם ערך של 90%. בחר רינדור באיכות הטובה ביותר.
- בחר להמיר דקל, בתפריט דקל של הכרטיסיה עיבוד (מצב עיבוד דפוס). לחץ על בחר ולאחר מכן החל. לשמור את התמונה שנוצר באמצעות תבנית. LSM (וגם לא .czi, חשוב מאוד).
הערה: ניתן לבצע שחזור התמונה מיד אחרי הרכישה או מאוחר יותר באמצעות מצב עיבוד תמונה של רכישת התוכנה. בשורה כיבוי מצב עיבוד דפוס, זה אפשרי לנתח מחדש את הערימות עם ערכים שונים של פרמטרים (גודל מסכת השיא, שיא עוצמת רעש). תמיד לבחור "למחוק את מולקולות חופפים", לא "ממוצע לפני לוקליזציה".
8. הערכה של מידת הדיוק לוקליזציה של תמונת סערה (10 דקות)
- פתח את הנתונים הגולמיים של סערה, להשתמש בתמונה עיבוד בכרטיסיית בחר בשיטת דקל ולאחר מכן דקל שוב. לחץ על בחר.
- לחץ על החל כדי להפעיל את השחזור באמצעות מסיכת שיא גודל של 9 ועוצמה שיא רעש של 6 (או את הפרמטרים שאתה בוחר עבור התמונה).
- בחר בכלי מלבן גרפיקה, צייר מלבן על התמונה הגולמיים סביב מולקולה בודדת הנוכחי על משטח זכוכית. יש בדרך כלל כמה מולקולות יחיד שם.
- העיתונות, החל שוב, רק מולקולות נוכח בתוך אזור מלבן ינותחו.
- בכלי PAL-סטטיסטיקה , בחר סוג מגרש: היסטוגרמה, ומקור היסטוגרמה: X עמדה או מיקום Y, כדי להמחיש את היסטוגרמות עמדה.
- שמור את הטבלה עם רשימת הגרסא המקומית מצד שמאל מתחת לתמונות.
- באמצעות תוכנה של ניתוח נתונים, ליצור היסטוגרמות של X ו Y עמדות (איור 1D).
- מתאים ההפצות מאת Gaussian ולשמור σX וערכיY σ. Σ דיוק לוקליזציהSMLM מוערך על ידי (σX *σY) ^ 0.5.
- חזור על שלב 8.3-8.8 על מולקולות רבות ככל האפשר ולחשב ממוצע של σSMLM
9. ערוץ רישום (5 דקות)
- פתחו את התמונה סופה של כל צבע באמצעות התוכנה פיג'י (תמונה J).
- בחר בכלי מטה כדי למדוד את העמדות של כל חרוזי tetraspeck.
- לחשב את המשמרות X ו- Y עבור כל חרוז, ממוצע אותם.
- השתמש בפקודה "לתרגם" לתרגם את התמונה השניה עם המחושבים משמרות X ו- Y.
- למזג שתי תמונות באמצעות הפקודה ' מזג ערוצים '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופ מצויד עם 50 mW 405 ננומטר ו- 100 מגוואט 488, 561, 642 nm solid-state לייזרים, EMCCD 512 x 512 מצלמה, אלפא מתכננים Apo 100 X / 1.46 אובייקטיבית, הלהקה לעבור 570-650 / ארוך מסננים פליטה 655 שימשו את התוצאות נציג שיובאו להלן.
איור 1A נותן דוגמא של מולקולה צפיפות, אות לרעש יחס זה אמור לשמש במהלך ייבוא תמונות raw. תמונות באיכות טובה מתקבלים עם מינימום של ~ 1 מיקרומטר בין מולקולות שכנות. בתנאים טובים מהבהב, fluorophores צריך להיות נוכח במסגרת אחת בלבד. מהבהב טוב דורש כדי להתאים את התנאים מאגר הדמיה (pH, הסוכן חותכות, ניקוי מערכת חמצן) ו לייזר כוחות, אשר משפיעים על - ואת חופש-שיעור של fluorophores, ולכן החובה מחזור (חלק מהיממה בזמן fluorophore נמצא המדינה ב)9,11. איור 1B, להפך, נותן דוגמא של תמונת raw שבו צפיפות מולקולה גבוהים מדי, מולקולה בודדת אינה יכולה להיפתר.
איור 1C הצגת היסטוגרמה טיפוסי של לוקליזציה הוכשרו עבור כל המולקולות זוהה, נותחו על ידי יצרן התוכנה מערימה של מסגרות בגובה 20,000. היסטוגרמה זו מקבילה על התמונה dSTORM של הרשת microtubule שמוצג באיור 3B. הערכים של לוקליזציה הוכשרו שסופקו על-ידי יצרן התוכנה הם בהסכם טוב עם ערכים מוערך בשלב הבא 8, באמצעות דיוק הצבעה של מולקולה בודדת מקומי נקודות זמן שונות22 (איור 1D).
איור 2A מראה דוגמה אופיינית dSTORM תמונה של vimentin immunolabeled חוטים עם Alexa647. הגדלת רזולוציה יכול ללא ספק להיות שנצפו על השוואה עם התמונה רכשה עם מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטיים (איור 2B-C). הפרופילים עוצמת קרינה פלואורסצנטית מיוצג באיור 2D מראים כי הדמיה מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה מאפשר פתרון vimentin חבילות. הרזולוציה dSTORM מספיקה לספור את מספר חוטים נוכח חבילות.
איור 3 מראה דוגמה טיפוסית של תמונה כפול-צבע dSTORM של vimentin וטובולין, רשתות immunolabeled עם Alexa647 ו- Alexa555 בהתאמה. הכיסוי של שתי הרשתות מראה כי חבילות vimentin בדרך כלל נקודתיים לאורך microtubules, מתן מידע מבניים מפתח צימוד בין מערכות משנה שני שלד התא.
איור 4 מדגימה דוגמאות שונות של dSTORM תמונות של microtubules שהושגו בתנאים בלתי אופטימאליים. ראשית, שימוש Alexa488, מאגר עם 143 מ מ בטא-mercaptoethanol (עוד סוכן ממעיט בשימוש במקום מאה9,10,11) ומערכת חמצן הניקוי (מורכב של 0.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז אוקסידאז µg 40/mL קטלאז), fluorophores היו למצמץ אבל לא היו מספיק פיקח. להיות בדיוק מקומי (מספר נמוך מדי פוטון) (איור 4A). שנית, באמצעות Alexa555 עם 143 מ מ בטא-mercaptoethanol, 50 מ מ MEA וחמצן ניקוי מערכת, fluorophores יכול להיות באטרף למצבם כהה ולא לכן להיות טוב במרחב מופרדים (מחזור חיים גבוה מדי, כלומר השבר של זמן במצב דלוק" ארוך מדי) (איור 4B). לבסוף באמצעות Alexa568, עם 143 מ מ בטא-mercaptoethanol, 50 מ מ MEA וחמצן ניקוי המערכת, fluorophores לא היו בהירים, היו מהבהב לאט עם מאוד זמן "על", "את" הברית (פוטון נמוך מספר וגבוה מדי מחזור) (איור 4C). אלה בכל תנאי בלתי אופטימאליים, הרשת microtubule שניתנו היה לקוי של תמונות סופר רזולוציה. לסיכום, תנאים אופטימליים דורשים fluorophores עם מספר גבוה פוטון, מחזור עבודה נמוך9,10 במאגר הדמיה המתאימה. שימו לב כי אופטימיזציה תיוג צפיפות והדמיה מאגר תנאים כדי להשיג תנאים טובים מהבהב נוהל סטנדרטי של dSTORM כפול-צבע, אינה ספציפית כדי אם-microtubule הדמיה.
לפי משפט נייקוויסט-שאנון, זה חייב להיות fluorophores לפחות כל 10 ננומטר יש רזולוציה של 20 ננומטר. דמפסי ואח להרחיב מבנים דו-מימדית, העריך כי תיוג של fluorophores4 ~ 10 מיקרומטר2 לכל הכרחי. הרשת אם היא צפופה, זיריהם שלה רזה (10 ננומטר לעומת 25 ננומטר קוטר ללא נוגדנים ראשיים ומשניים) השווה ל הרשת microtubule, הבחנו כי פעמיים הגרסא המקומית יותר חיוניים לתאר את הרשת אם. נוכל לקבל תמונות טובות עם 5 000 הגרסא המקומית/מיקרומטר2 כי אם על הגרסא המקומית 2500/µm² עבור microtubules, שהושג עם מסגרות 40 000 ומסגרות בגובה 20,000 בהתאמה. התמונה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר הושג עם דיוק לוקליזציה של σSMLM ~ 8-12 ננומטר העריך בעקבות שלב 8 של הפרוטוקול (דיוק הצבעה של מולקולה בודדת לשפות אחרות בזמן שונה יצביע22). זו הערכה של דיוק לוקליזציה היה הסכם טוב עם הערכים שסופקו על-ידי יצרן התוכנה שמוצג היסטוגרמה של לוקליזציה הוכשרו שחולצו מן כל המולקולות שזוהו של הנתונים הגולמיים (למשל שמוצג באיור 1C). דיוק לוקליזציה כזה יכול לספק תמונה עם רזולוציה של ~ 30 ננומטר (2.35 * דיוק) אם צפיפות תיוג היא גבוהה מספיק. הבחנו באופן שגרתי vimentin הלהט ב חצי המרבי (FWMH) של ~ 40 ננומטר רוחב מלא ו- microtubules עם רוחב FWMH ~ 55 ננומטר. מאז רזולוציית התמונה תלוי לוקליזציה הדיוק והן את צפיפות לוקליזציה, אנו מספקים תנאים ניסיוני אשר מאפשרים את התוצאות הטובות ביותר לקחת בחשבון שני הקריטריונים.
איור 1 : צפיפות מיטבית של מולקולות יחיד במהלך רכישת ולוקליזציה שערוך דיוק.
(A-B) שמאל: נציג תמונות raw מתוך מסגרת אחת של צפיפות מיטבית של מולקולות יחיד במדינה בהיר () , עם צפיפות גבוהה מדי (ב') במהלך סערה רכישה (שלב 6.12.) של תאים U373 קבוע מוכתם anti-vimentin ועכבר נגד Alexa647. נכון: תמונות raw שבה מולקולות יחיד עם רמת קרינה פלואורסצנטית מעל עוצמת שיא לסף הרעש (מוגדר 6) מוקפים עיגולים (לבן או אדום). קוטר עיגול מוגדר על-ידי גודל מסכת השיא (ערכת לפיקסל 9) וקובע הצבע אם המולקולות חופפים (אדום) או לא (לבן). שימו לב כי צפיפות גבוהה של מולקולות יחיד (ב (B)) להוביל כמות גבוהה של חופפים מולקולות אשר לא נלקחים בחשבון עבור שחזור התמונה סערה. A פנימי: גרף המציג את פרופיל עוצמת קרינה פלואורסצנטית טיפוסי של מולקולה בודדת באדום, Gaussian שלה להשתלב שחור. בדוגמה זו, הדיוק לוקליזציה הוא σx = 6.7 ננומטר. סולם בר, 1 מיקרומטר. (ג) טיפוסי היסטוגרמה של לוקליזציה הוכשרו עבור כל המולקולות זוהה, נותחו על ידי יצרן התוכנה. זה להיות visualized ומתעדכן באופן קבוע במהלך רכישת הנתונים הגולמיים בזכות עיבוד מקוון. היסטוגרמה זו מקבילה על התמונה dSTORM של הרשת microtubule שמוצג באיור 3B. (ד) שמאל: סערה תמונה של מולקולה בודדת מציג במשטח זכוכית לאחר השיקום. נכון: היסטוגרמות של עמדות X ו- Y שהושג לאחר התאמה לפי עקומת גאוס. Gaussian הולם ההפצות X ו- Y לתת הערכה של מידת הדיוק לוקליזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : DSTORM נציג תמונה של רשת vimentin. תמונה dSTORM (א), תקן רחב-שדה מתאים תמונה (B) , כיסוי (ג) מציג בחוד החנית של U373 תא גליה קבוע כמפורט בפרוטוקול, מוכתם vimentin עם Alexa647. למטה: זום של האזור המסומן. פרופילים בעוצמה רוחבי (D) לאורך הקו הצהוב על תמונות מוגדלת ב A ו B. סולם בר, 2 מיקרומטר ו-500 nm, מרחק מתצוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : צבע כפול נציג תמונות dSTORM של vimentin ורשתות microtubule. (א) Vimentin רשת צבעונית עם Alexa647 (אותו כמו דמות 2A). רשת Microtubule (B) המסומנת Alexa555. שכבת-על (C) של vimentin (אדום), רשתות microtubule (ציאן) עם אזור זום בצד הימין. התמונה dSTORM של vimentin הושג עם ~1.5 מיליון של הגרסא המקומית מתוך מסגרות 40 000. התמונה dSTORM של microtubules הושג עם הגרסא המקומית 000 ~ 850 מתוך מסגרות בגובה 20,000. סולם בר, 2 מיקרומטר, 500 nm, מרחק מתצוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : דוגמאות של תנאי דימות בלתי אופטימאליים microtubules. מתי fluorophores למצמץ אבל אינם מספיק בהיר עם Alexa488 תיוג של טובולין גלייה U373 ו- 143 מ מ BetaMercaptoethanol ו חמצן נבלות במאגר הדמיה (א), כאשר fluorophores מבריקים מספיק אבל לא יכול להיות כמו שצריך מרוקנים כהה (ב עוצמת הלייזר מרבי זמין) והמדינה הבהוב לאט עם Alexa555 שכותרתו טובולין ב 143 מ"מ BetaMercaptoethanol, 50 מ"מ MEA ומאגר נבלות חמצן (B) , כאשר fluorophores למצמץ באיטיות ואינם מוארים באמצעות Alexa568 מתויג טובולין במאגר הסערה המכיל 143 מ"מ BetaMercaptoethanol, 50 מ מ MEA ו חמצן נבלות (ג). בכל המקרים האלה, השפלת התמונות dSTORM רזולוציה. סולם בר, 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : DSTORM כפול-צבע מייצג דימוי vimentin ורשתות microtubule של תא U373 קבועה עם מתנול קר במשך 5 דק (א) רשתות microtubules Vimentin ו- (B) עם Alexa647 ו- Alexa555 בהתאמה עם תוויות מתקרב המסומן. הערה על הימצאות מולקולות יחיד בקדמת התאים מקומי בציטופלסמה הפחתת הגלובלית הרזולוציה של הרשתות נימה. סולם בר, 2 מיקרומטר, 500 nm, מרחק מתצוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : השוואה של dSTORM משוחזר תמונות
תמונה dSTORM שוחזר על ידי יצרן התוכנה (א) ו סופת רעמים (תוסף פיג'י) (B). (ג) שכבת-על (א) ב (מגנטה) ו- (ב) בצבע ירוק. סולם בר, 2 מיקרומטר, 500 nm, מרחק מתצוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
אנו מציגים כאן פרוטוקול אשר ממזערת חפצים של תמונות dSTORM של microtubules, IFs גלייה. חפצים יכולים להיווצר בכל צעד של הכנת הדוגמא, הדמיה: יציבות, חסימת, immunolabeling, להיסחף במהלך הרכישה, בלתי אופטימאליים מהבהב תנאים23. אנחנו ברשימה להלן השלבים הקריטיים ביותר.
ניקוי על coverslips היא צעד חשוב להגביל את הכריכה לא ספציפית של fluorophores על פני השטח, ולכן כדי להגביל את רעשי הרקע בתמונה dSTORM.
אנו מציעים לתקן את הדגימה בצעד של מיצוי ופתרונות קיבוע באמצעות שילוב של גלוטראלדהיד, טריטון, ולאחר מכן קיבעון עם כדורגלן (paraformaldehyde) (שלב n ° 3). פרוטוקול קיבוע הותאם Chazeau ואח12: אנחנו ירד זמן דגירה שלב החילוץ/קיבוע 60 s (שלב 3.4), להסיר את הגלוקוזה מתוך המאגר שלד התא, המערכת תדלג על השלב הנוסף של permeabilization. היתרון של שיטה זו הוא כי subunits cytoskeletal נעה בחופשיות מנוקזות משם, ומאפשר הדמיה ברזולוציה סופר עם פחות רקע12. באופן כללי השלב קיבעון הוא קריטי כי קיבוע רע (באמצעות מחברים הישן, פתרונות קר, דגירה ארוך/קצר מדי צעדים) להוביל הרס חלקי של הרשתות נימה (microtubules שבור, microtubules אשר לא להגיע לחזית תא ו/או באופן צפיפות נמוכה). שים לב שזה גם אפשרי להשתמש במתנול קיבעון, במיוחד אם רק הרשת vimentin הוא עם תמונה כפי שמתואר לדוק ואח15. עם זאת, רעשי הרקע יכול להיות שנצפו בתוך התא (איור 5). למרות dSTORM תמונות שהושג עם מתנול קבוע תאים הם באיכות עניים, הם עדיין לספק מידע על מה שניהם אם, רשתות microtubule צריך להיראות כמו למשל לטווח של פילמנט צפיפות. קיבוע עם רק גלוטראלדהיד נתן התוצאות ענייה מאוד IFs, למרות זאת הוא פרוטוקול הטוב ביותר עבור קיבוע microtubule23.
בחלק immunostaining, חשוב להשתמש נוגדנים אנטי עכבר למזער את cross-reaction עם נוגדנים שפותח בשנת החולדה. לא יזיק לנו קטעים ללונג (אנטי עכבר) מסיבה זו, כי הם cross-react הלא ספציפית עם טובולין אנטי חולדה בנוסף העכבר האנטי-vimentin
עקב כוח מוגבל לייזר זמין, יש צורך להשתמש 561 והן 488 ננומטר לייזר קווים לשאוב את צבעי Alexa555 המדינה כהה. הספק לייזר 488 גבוה (~ 50%) זה נחוץ גם במהלך רכישת להתבונן טוב מהבהב, מחזור חיים נמוכה (השבר של פעם fluorophore מבלה במדינה על), אם כי היא מגבירה את רעשי הרקע כמו גם. מצב תאורה TIRF מגביל את עירור של fluorophores בשכבה דקה (~ 200 ננומטר מעל coverslip זכוכית). זה מגדיל את יחס אות לרעש על ידי הפחתת האור רקע, אך גם מקטין את כוח עירור. מצב חילו מאפשר חלוקתה צירית והוא יכול להיות יעיל כדי למטב את יחס אות לרעש. לכן ביניים טוב בין אפינפרין TIRF. באמצעות מצב חילו הוא חיוני כדי לרגש ביעילות את fluorophores Alexa555, אשר דורשים עוצמת הלייזר גבוהה למצמץ כראוי.
עוד צעד קריטי הוא רכישת נתונים גולמיים (שלב 6). יש צורך להתאים את הפרמטרים רכישה (חשיפה, רווח, TIRF ופוקוס אפילו כאשר אין התקן בלוק המוקד זמין) בזמן הסרט נרכש. לשמור על צפיפות מיטבית של fluorophores בהיר זה חשוב (איור 1 א'): זה חייב להיות מספיק נמוך כדי להפריד במרחב כל צבע, אבל גבוה מספיק כדי להמחיש את כל המבנה לאחר מסגרות 40 000. אם מספר מולקולות מופעל הוא נמוך מדי, כדאי לרכוש עוד ערימות. השגנו תמונות טובות עם ~ localizations 5000 לכל µm² עבור IFs, הגרסא המקומית 2 500 לכל cm ² עבור microtubules.
שינויים ופתרון בעיות של השיטה
זה חשוב לעבוד עם דגימות טריות ממוטבת הדמיה מאגרים. pH צריך להיות בדיוק מותאם, במיוחד על כר הדשא.
Vimentin ו- microtubules צריך להיראות בצורה אחידה עם תוויות כאשר תמונה עם מיקרוסקופ רגיל רחב-שדה טכניקה (WF). אם חוטים נקטעים/מקווקו עם מיקרוסקופ קלאסית, זה הגברה כאשר משתמש סופר רזולוציה. במקרה כזה, עדיף להכין דגימות חדשות. קיבוע ממוטבים לקריאה ללא תנאים (PFA הישן וכו ') עלול לגרום microtubules מחפש מפוצלים. רקע על משטח זכוכית עשוי לנבוע חסימת לא יעיל. במקרה כזה, BSA (שור אלבומין) יכול להיות מוחלף על ידי FBS (סרום שור עוברית), בשימוש בכל השלבים הדגירה.
אם תיוג צפיפות גבוהה מדי (איור 1B) ודחף לא יכול להיות מספיק כהה חופש-המדינה, אפילו עם החזקה הגבוהה ביותר לייזר, כמות משני נוגדנים צריך להיות מופחת (טוב יותר מאשר להקטין את כמות נוגדנים הראשי). עם זאת, הדבר מחייב הכנת דוגמאות חדשות. באופן כללי, יש צורך להעריך את הנתונים באופן אמפירי את כמות נוגדנים משניים לשימוש.
אם fluorophores לא ממצמץ בדרך כלל (הם צריכים להיות במצב בהיר בבין אחד בלבד), בדוק רמת החומציות של המאגר ההדמיה נכונה (pH 8.3). להכין פתרונות חדשים אם הבעיה נמשכת (במיוחד מאה). בדוק תמיד קולימטור TIRF זה (TIRF u_HP). עם עוצמת הלייזר מוגבל, קבלת מהבהב תקין ייתכן מאתגר (על ואת הנחה כמו גם צבע בהירות תלויים עוצמת הלייזר, כפי שמתואר ואן דה לינדה ואח11). השני צבענים כמו Alexa488 או Atto488 ניתן לסייר אם יותר כוח לייזר עירור זמין14.
אם fluorophores תפסיק להבהב לפני הסוף של המסגרות 40 000, לשנות המאגר הדמיה אשר עשוי להיות מחומצן. ודא כי שם אין בועות אוויר בין החומר הממתן את המכסה לאחר השינוי מאגר. דוגמאות אטום יכול לדימות במשך כמה שעות חומר.
אם הסערה סרטים נרכשים על מיקרוסקופ רגיל TIRF מצויד של EMCCD, זה ניתן להשתמש רעמים24 לשחזר את התמונות. אפשרויות דומות זמינים עבור תיקון להיסחף, התמונה סינון עיבוד תמונה. רעמים הוא תוסף להשתמש בתוכנת ה-פיג ' י/imageJ. תוצאות דומות התקבלו עם יצרן התוכנה, רעמים (איור 6).
עריסה (cyclooctatetraene) ניתן להוסיף למאגר הדמיה כדי לשפר את מידת הדיוק של לוקליזציה של מולקולות יחיד. זה מגדיל את מספר הפוטונים הנפלטים בכל מחזור של Alexa64725. לדיוק לוקליזציה יותר אכן נצפתה (ל-6 nm) בעת הוספת 2 מ מ מתקפלת למאגר סערה המתואר בשלב 5 עם 100 מ מ MEA כפי שמתואר הפניה או25. עם זאת, בתנאים אלה, מספר מולקולות בהיר במהלך רכישת מקטין הרבה יותר מהר מאשר בלי מתקפלת, הגבלת המספר הכולל של הגרסא המקומית של מולקולה בסוף שנת הרכישה, שעלול כדי תת דגימה של הרשת אם. מאגרי דימות אחרים דווחו לפעול היטב עם צבעי אלקסה, לדוגמה באמצעות לקטאז, oxyrase כמו חמצן ניקוי מערכת26. פרוטוקול זה, אנחנו מדווחים ההרכב מאגר אשר נתן את התוצאות הטובות ביותר בטווח של רזולוציה עבור שלנו סוג של דגימות והדמיה להגדיר, אבל כל סוג הדגימה דורש אופטימיזציה מאגר, בנוסף תיוג ואופטימיזציה תנאים קיבעון.
מגבלות של השיטה, שיפורים אפשריים
השיטה המוצגת כאן היא מוגבלת תאים קבוע תמונות דו-ממד. באמצעות תקן הדמיה סט למעלה עם מיקרוסקופ TIRF, EMCCD, הגורם המגביל ביותר היה הכוחות לייזר (100 mW הלייזר nm 561. לא הספיק להפוך את צבעי Alexa555 למצמץ). קו 532 ננומטר לייזר עשוי להיות יעיל יותר כדי לרגש צבעים אלה. שיפור אפשרי של השיטה יהיה לבצע dSTORM תלת-ממד באמצעות אסטיגמציה אופטי27. זה ידרוש שינויים מינימליים של הפרוטוקול, חוץ תיוג צפיפות נמוכה יותר, מספר מסגרת מוגברת. צבע כפול תלת-ממדי התמונה סופה לספק תצוגה טובה יותר של IFs סביב microtubules, במיוחד בחבילות. שימו לב כי אקטין חוטים יכול גם להיות שנצפו תוך שימוש באותה השיטה לקיבעון וכמות אופטימיזציה של phalloidin פלורסנט8. 3 צבעים סערה יכול לשמש כדי לבחון ארגון שלוש תת-מערכות cytoskeletal.
באמצעות נוגדנים והמשניים מגדיל את הגודל של אובייקט עניין מאז הנוגדן המשני הוא מקומי עד 20 ננומטר מן המטרה. בדרך כלל, microtubule בקוטר 25-nm יהיה ברוחב של ~ 50 ננומטר לאחר תיוג. אפשרות אחת כדי לשפר את המרחק בין המטרה לבין לצבוע היא ישירות תווית הנוגדנים ראשי עם צבעים המתאים. אידיאלי nanobodies עם צבעים אורגניים תוויות צריך להיות בשימוש28.
אנו מספקים כאן רק שיטה פשוטה כדי להעריך את מידת הדיוק של לוקליזציה הממוצעת של מולקולה בודדת בעקבות Endesfelder ואח22. הפתרון הכללי של התמונות לוקח בחשבון שני דיוק לוקליזציה, תיוג צפיפות, ניתן גם למדוד באמצעות גישה פורייה טבעת מתאם29.
לגבי ההרשמה ערוץ, קשה לערוך בשכבות בצורה מושלמת כל החרוזים נוכח שדה הראייה. תיקון מורכב יותר ניתן למצוא Chazeau ואח 12.
מגבלות הנובעות מהבהב של fluorophores ואת הלבנה של הגששים ניתן להתגבר באמצעות DNA-צביעה (צבירת נקודות DNA עבור הדמיה בטופוגרפיה ננו)30. בשיטה זו, המצמוץ הכרחי עבור מולקולה בודדת לוקליזציה נוצר על ידי איגוד ארעית של קצר-צבע-שכותרתו ' oligonucleotides אל המטרות המשלימים שלהם.
מסקנה
מאמר זה מציג פרוטוקול חזקים כדי לבצע הדמיה כפולה-צבע dSTORM ב 2 מידות של חוטים cytoskeletal בתאים קבוע. התנאים ניסיוניים נמצאו אופטימלית מבחינת מאגר קיבעון, immunolabeling, הדמיה עבור סוג המדגם שלנו מתוארים בפרטים. לאחר מכן, התהליך של רכישת נתונים גולמיים ואת הסוג של תמונות מהבהב שיירשמו (מולקולה צפיפות, אות לרעש יחס, fluorophore חובה מחזור וכד') מוצג וכן כיצד לשחזר תמונות dSTORM, לתקן את הנתונים להיסחף וסינון. שלבים אלה כלליות עבור הדמיה כפולה-צבע dSTORM וטעמו לא סוג ספציפי. לבסוף, הוא הראה איך טכניקה זו מסייעת לפתרון הארגון צפופה של שתי הרשתות cytoskeletal בשילוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים מיכאל Lelek, Orestis Faklaris, ניקולס Bourg לדיון פורה, אנדריי Aristov, אלנה Rensen לעזרה עם טכניקה סופר רזולוציה, דני Seetharaman עבור קריאה זהירה של כתב היד. אנו להכיר בהכרת תודה UtechS BioImaging פוטוני (Imagopole) Citech של מכון פסטר (פריז, צרפת), כמו גם את רשת תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-10-INSB-04; השקעות לעתיד), ולא את Région ile-de-(תוכנית Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) לשימוש של המיקרוסקופ Elyra. עבודה זו נתמכה על ידי הסרטן le ליגה חדר מרווח וחדיש, הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al.
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
