Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57087
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

Summary

Det övergripande målet med denna metod är att ge de optimala experimentella förhållandena från provberedning till bild förvärv och återuppbyggnad för att utföra 2D tvåfärgad dSTORM bilder av mikrotubuli och mellanliggande glödtrådar i fasta celler

Abstract

Cytoskelettet, sammansatt av aktin microfilaments, mikrotubuli och mellanliggande glödtrådar (om), spelar en viktig roll i kontrollen av cell form, polaritet och motilitet. Organisationen av aktin- och mikrotubuli har studerats men som av IFs inte ännu fullt kännetecknas. IFs har en genomsnittlig diameter av 10 nm och bildar ett nätverk som sträcker sig över hela cellens cytoplasma. De är fysiskt associerade med aktin och mikrotubuli genom molekylära motorer och cytoskeletal linkers. Denna snäva association är kärnan i de reglerande mekanismer som säkerställer samordnad reglering av de tre cytoskeletal nätverk som krävs för de flesta cellfunktioner. Det är därför avgörande att visualisera IFs ensam och även tillsammans med alla andra cytoskeletal nätverk. Dock om nätverk är extremt tät i de flesta celltyper, särskilt i gliaceller, som gör sin resolution mycket svårt att uppnå med standard fluorescensmikroskopi (lateral resolution av ~ 250 nm). Direkta stokastiska optisk återuppbyggnad mikroskopi (dSTORM) är en teknik som ger en vinst i lateral resolution en storleksordning. Här visar vi att laterala dSTORM resolution är tillräckliga för att lösa tät organisationen om nätverk och, i synnerhet om buntar kring mikrotubuli. Sådana snäva association är sannolikt att delta i samordnad reglering av dessa två nät och maj, förklara hur vimentin IFs mall och stabiliserar mikrotubuli organisation som skulle kunna påverka mikrotubulära beroende vesikulär människohandel. Generellt visar vi hur observationen av två cytoskeletal komponenter med tvåfärgad dSTORM teknik ger nya insikter om deras växelverkan.

Introduction

Cytoplasmiska mellanliggande glödtrådar (IFs) är 10 nm-diameter homo- eller heteropolymers av en cell typ specifika delmängd av om proteiner. IFs delta i ett stort utbud av cellulära funktioner såsom cell motilitet, spridning och stress svaren. Deras viktiga roll understryks av det faktum att mer än 90 mänskliga sjukdomar orsakas direkt av mutationer i om proteiner; exempelvis förändringar om sammansättning medföljer tumörens tillväxt och spridning1,2,3. Det finns växande bevis för att de tre cytoskelettsystemen fungerar i samarbete till kontroll cellulära funktioner såsom cell polarisering, division och migration2,3. Eftersom det finns en tät koppling mellan rumsliga arkitektur och funktioner, är det viktigt att få insikter i den strukturella organisationen om den med andra filament och bättre förstå den cytoskeletal överhörning. den här artikeln innehåller ett protokoll för att utföra den super-upplösning teknik tvåfärgad dSTORM (direkt stokastiska optiska återuppbyggnad Microscopy)4 och hur den används att undersöka samspelet mellan om och mikrotubuli i fast, odlade celler i 2 dimensioner (2D).

Flera super-resolution tekniker har utvecklats under senaste decenniet, och där upptäckter var på beskärningen av Nobelpriset i kemi i 20145. Bland alla dessa tekniker ligger de enda molekyl lokalisering-baserade metoderna som PALM6 (Photo-Activated lokalisering Microscopy) som använder photoswitchable fluorescerande proteiner, STORM7 med par fluorophores eller dSTORM4 med konventionell fluorophores. Alla dessa metoder bygger på samma princip som består av a växeln av mest av de fluorescerande reportrarna till en ”off” stat ”(icke-fluorescerande), (ii) den stokastiska aktiveringen av en delmängd av dem in i en fluorescerande staten för att lokalisera sin rumsliga position med nanometer precision, och (iii) upprepning av proceduren för att aktivera så många grupper av fluorophores som möjligt. En slutliga bilden rekonstrueras med hjälp av alla lokaliseringar av aktiverade molekylerna, som tillhandahåller en lateral upplösning ner till ~ 20-40 nm. Flera kommersialiserade optiska system tillåter PALM/STORM är nu tillgängliga för biologer för rutinmässig experiment. Här, användes ett sådant system för att studera strukturella associering av mikrotubuli och IFs. Bland alla singel-molekyl lokalisering-baserade metoder, tvåfärgad dSTORM tekniken valdes, eftersom det är väl lämpad att observera mycket tunn lamellär regioner (< 1 µm) av vidhäftande celler och kan ge betydande förbättring av bildupplösning med minimal investering av tid och pengar. DSTORM är faktiskt en mycket bekväm och mångsidig teknik som är kompatibel med de vanliga organiska färgämnen som rutinmässigt används för cellulär färgning och immunofluorescens.

Medan en färg dSTORM bilder är relativt enkel att få med fluorophore Alexa6478, kräver tvåfärgad dSTORM för att optimera de experimentella förhållandena så att två färgämnen kan blinka ordentligt i valda bufferten, särskilt när det finns begränsad lasereffekt. Utmärkt papper finns redan på metoderna för att ställa in flerfärgade imaging med dSTORM9,10,11,12,13, och dessa papper förklara i detalj de möjliga källorna till artefakter och försämrad upplösning samt hur man övervinna dem. I denna artikel, de optimala experimentella förhållandena när det gäller celler fixering, immunfärgning, provberedning som imaging förvärv och bildrekonstruktion beskrivs för att förvärva bilder av tät cytoplasmiska om nätverk och mikrotubuli i gliaceller med tvåfärgad dSTORM. Kort, utvinning/fixering metoden beskrivs i Chazeau et al12 anpassades till gliaceller och används med ett efter fixering steg, optimerad antikroppar koncentration, en STORM buffert med 10 mM MEA beskrivs i Dempsey9 et al. som var befunnits vara optimal för experimentell uppsättning upp och Provtyp.

Gliaceller express huvudsakligen tre typer av om proteiner: vimentin, nestin och Fredsgenomförande (glial fibrillary sura protein). Dessa tre proteiner visades att samtidig polymerisera i astrocyterna14. Vi visade tidigare använda super-resolution strukturerade belysningen mikroskopi (SR SIM) att dessa tre om proteiner kan hittas i samma enda om glödtråden och att de visar liknande fördelning och dynamik i gliaceller 15. På grund av likheterna mellan de tre om proteinerna användes vimentin färgning som en reporter för hela om nätverket. Med hjälp av dSTORM, lyckades vi lösa hur om formuläret buntar längs mikrotubuli, vilket inte var möjligt med diffraktion begränsad mikroskopi teknik15. Dessa observationer kan hjälpa till att förstå hur vimentin IFs kan mallen mikrotubuli och reglera deras tillväxt bollbana, främja upprätthållandet av en polaritet axel under cell migration16. Super-upplösning bilder nyckelinformation om ömsesidig samverkan mellan de två cytoskeletal delsystem samt förde inblick i sambandet mellan rumsliga association och lokala funktion som kunde vara celltyp specifika17. I allmänhet, kan tvåfärgad dSTORM användas för att studera överhörning mellan cytoskeletal element eller andra typer av organeller, förutsatt att bra immunfärgning villkor uppnås vad gäller täthet och specificitet. Denna teknik kommer att vara användbart för att bättre karaktärisera de cytoskelettet förändringar som observerats under astrogliosis och glioblastom, den vanligaste och mest maligna tumören i centrala nervsystemet, där uttrycket av om proteiner är ändras 18 ,19,20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips förberedelse (dag 1, 30 min)

  1. Placera 18-mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glas coverslips på en plast rack.
  2. Lägg racket i en 100 mL-bägare fylld med aceton och blöt i 5 min.
  3. Överföra racket till en 100 mL-bägare fylld med absolut etanol och blöt i 5 min.
  4. Överföra racket till en ny 100 mL-bägare fylld med absolut etanol och placera bägaren i ett ultraljud renare enhet (se tabell material) vid rumstemperatur. Tryck på ”on” och vänta i 10 min.
  5. Racket under en LAF och låt coverslips självtorka eller torka coverslips med filtrerad luftflöde.
  6. Sätta i racket med coverslips i en plasma renare enhet. Slå på vakuumpumpen, stänga dörren, vänta på 3 min att göra dammsugaren och slå på plasma för 1 min. Använd coverslips strax efter rengöring. Förvara dem inte.

2. cellen plätering (dag 1, 20 min)

  1. Växer den glial cell linjen U373 i minst viktigt Medium (MEM) med 10% fetalt bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin och 1% icke-essentiell aminosyra i 10 cm diameter plast petriskål.
  2. Placera rena glas coverslips i 12 brunnar under laminärt flöde huven och tillsätt 1 mL av förvärmd cell medium per brunn.
  3. Tar en maträtt som innehåller celler från cell inkubatorn (37 ° C, 5% CO2).
  4. Ta bort mediet och tillsätt 10 mL PBS.
  5. Ta bort PBS och tillsätt 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA.
  6. Placera skålen tillbaka i inkubatorn för 2-3 min.
  7. Tillsätt 10 mL varm medium förvärmd vid 37 ° C i skålen och resuspendera cellerna.
  8. Utsäde ca 100 000 celler per brunn (~ 150 µL av celler) i 12-väl tallrikar som innehåller coverslips.
  9. Vänta i minst 6 timmar (eller över natten) att tillåta cell spridning.

3. cell fixering (dag 2, 2h)

  1. Förbereda cytoskelettet bufferten med 80 mM rör, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, och justera pH till 6,9.
  2. Tvätta cellerna en gång med PBS.
  3. Ta bort PBS och varsamt tillsätt 1 mL per brunn utvinning/fixering lösning (0,25% glutaraldehyd, 0,3% Triton x-100 i cytoskelettet bufferten) förvärms vid 37 ° C.
  4. Inkubera i 60 s vid rumstemperatur.
  5. Ta bort lösningen och varsamt tillsätt 1 mL per brunn av förvärmd och nylagad 4% PFA (PARAFORMALDEHYD) lösning utspädd i cytoskelettet bufferten.
    Varning: Använd handskar och arbeta under kemiska huven.
  6. Placera plattan 12-väl tillbaka i inkubatorn vid 37° C i 10 min.
  7. Ta bort PFA och tillsätt 3 mL PBS per brunn.
    Obs: Arbeta under kemiska huven med handskar och sätta den återvunna PFA i en specifik lagerplats.
  8. Tvätta två gånger med PBS.
  9. Ta bort PBS och Lägg nylagade 10 mM NaBH4 lösning utspädd i PBS för att släcka den autofluorescens kommer från glutaraldehyd.
  10. Inkubera i 7 min i rumstemperatur.
  11. Sätta återvunnet NaBH4 i en specifik lagerplats.
  12. Tvätta tre gånger 5 min med PBS.
  13. Ta bort PBS och tillsätt den blockerande lösningen (5% BSA lösning i PBS).
  14. Inkubera i 1 h i rumstemperatur (eller över natten vid 4 ° C).
    Obs: Cytoskelettet bufferten kan förvaras i rumstemperatur i några månader. Glutaraldehyd, PFA och NaBH4 ska hanteras med särskild omsorg (hood, handskar och specifika återvinningskärl). Lösningar bör läggas till och tas bort försiktigt för att bevara integriteten i cellerna. Det är viktigt att inte låta cellerna torka.

4. immunfärgning (dag 2, 5h)

  1. Bered den primära antikroppar med anti-vimentin och anti tubulin med en 1: 500 utspädning i blockerande lösningen.
  2. Sätta 100 µL droppar utspädd primära antikroppar på ett paraffin film lager och placera coverslips ovanpå dem med celler nedåt.
  3. Inkubera cellerna med primära antikroppar för 2 h. sätta coverslips tillbaka i en 12-väl tallrik fylld med PBS. Skölj trefalt för 5 min varje gång i PBS vid rumstemperatur i orbitalskak.
  4. Under tiden förbereda sekundära antikroppar lösningen med hjälp av antimus Alexa647 och anti råtta Alexa555 vid en spädning på en 1:1, 000 i blockerande lösningen. Inkubera cellerna med sekundära antikroppar för 1 h i rumstemperatur. Fortsätt som 4.2. att skydda cellerna från ljus.
  5. Sätta täckglaset tillbaka i en 12-väl tallrik fylld med PBS. Skölj trefalt för 5 min varje gång i PBS vid rumstemperatur i orbitalskak. Ta bort PBS och tillsätt 0,5 mL PBS blandat med 1 µL 0,1 µm tetraspeck pärlor.
  6. Sätta brunnarna i orbitalskak för 30 min. Skölj med PBS. Ta bort PBS och inkubera cellerna för 5 min med en 4% PFA lösning i PBS. Skölj trefalt i PBS.
    Obs: Fast celler kan lagras för ett par veckor i PBS vid 4° C. Immunfärgning kan göras i sista minuten.

5. Provberedning (dag 3, 5 min)

  1. Lägg alikvoter av MEA (cysteamin, 1 M, pH 8,3), glukosoxidas (100 x, 50 mg/mL), katalas (500 x, 20 mg/mL) i en is-korg.
  2. Förbereda 50 mL Tris-NaCl buffert (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) kompletteras med 10% glukos (100 mg/mL).
  3. Förbereda 1,2 mL imaging buffert strax före bildbehandling med 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glukosoxidas, 40 µg/mL katalas (80-200 U/mL) i Tris-NaCl bufferten med 10% glukos.
  4. Montera den täckglas som innehåller märkta celler på magnetiska provhållaren (t.ex. chamlide avdelningen) och lägga till imaging bufferten för att helt fylla kammaren. Sätt på locket och se till att det finns ingen luftbubbla mellan imaging bufferten och locket.
  5. Rengör botten av provet med absolut etanol och kontrollera att det inte är läckage. Använd fett för att täta provhållaren ordentligt om det behövs.
    Obs: Förbereda 1 M lager av MEA lösning (pH 8,3 justerat använder HCl), beståndet av glukosoxidas vid 50 mg/mL och lager av katalas på 20 mg/mL i vatten, göra alikvoter och lagra dem på-20 ° C i upp till en månad för Monoetanolamin och ett år för glukosoxidas och katalas. Inte frysas alikvoter. Förbereda Tris-NaCl bufferten i förväg och förvara den i rumstemperatur i flera månader. Lägga till glukos under experimentet (steg 5.3).

6. bild förvärvandet (dag 3, ~ 1h per cell)

  1. Slå på mikroskopet. Aktivera programvaran förvärvet och tryck på starta systemet.
  2. Välj förvärv Tab. expandera verktyget Imaging Setup i gruppen Setup Manager verktyg. Välj laser WF (brett fält) läge av förvärvet. Välj syftet 100 X NA 1.46 . Välj det Frida u-HP -läget som använder en kollimator för att minska synfältet belyses och koncentrera den laser energin till ett mindre område. Använd den optovar lins 1,6 x som ger en pixelstorlek på 100nm.
  3. Välj verktyget tidsserier och ställa in tidsfördröjning med 50 000 ramar och 0,0 ms mellan ramar. Expandera verktyget kanaler i gruppen förvärv parametern verktyg och välj ”Visa alla”.
  4. Ange Alexa647 banan: Kontrollera 642 och 405 laser linjer för magnetisering och acceptera för att slå dem på. Välj filtret ”655 LP” utsläpp i Imaging Setup. Byt namn på ”647”.
  5. Klicka på '+' i verktyget kanaler att lägga till en annan lätta pass och välj läge ”växla spår varje: ram” i verktyget Imaging Setup . Kontrollera 561, 488 och 405 laserlinjerna och acceptera för att slå dem på. Välj den ”BP 570-650 + LP750” utsläpp filter och använda optovar lins 1,6 x. Kontrollera att det Frida-uHP-läget har valts. Byt namn på spåret ”555”.
  6. Välj verktyget förvärv läge och ange ramstorleken till 200 x 200 pixlar. Välj verktyget fokus enheter och strategi och sätta definitiv fokus till 1 000 ramar (om det finns ett fokus-lock system).
  7. Sätta olja på målet och lägga provet på. Välj fliken lokalisera och öppna slutaren på lampan fluorescens. Hitta fokus och leta efter cellen till bild med okularet. Placera den i mitten av synfältet med hjälp av joysticken.
  8. Välj fliken förvärv att gå tillbaka till förvärv läge. Välj ”647” spår, ange 642-laser makt till 0,2%, ange 405-laser makt till 0, ange exponeringstiden till 50 ms och förstärkningen av 50. Välja kontinuerlig förvärv läge att iaktta cellen på skärmen. Justera fokus. Kontrollera att det finns minst en tetraspeck pärla i synfältet, öka kontrasten för att se dem vid behov. Använd en automatisk skalning för displayen. Ta en wide-fältet epifluorescence bild av vimentin nätverket genom att klicka på snap och spara den. För att kontrollera belysningen som Frida, klicka på Frida, justera vinkeln på belysningen och/eller kollimator vid behov har ett homogent fält av belysning och spara den.
    Obs: Det är viktigt att Frida och epifluorescerande bilderna är av hög kvalitet innan förvärvet rådata. Kontinuerliga, icke-enhetligt märkta filament kommer att ge upphov till dålig kvalitet dSTORM bilder.
  9. Avmarkera ”647” spåret och välj och kolla ”555” spåret. Ta en epifluorescence bild av det mikrotubulära nätverket och spara den. Ta en Frida bild och spara den alltför.
  10. Avmarkera ”555” spåret, Välj och kontrollera ”647” spåret, tryck kontinuerlig. Placera vinsten till 0 och exponeringstid till 10 ms. ställa 642-nm laser makt till 100% för att pumpa de flesta av de Alexa647 färgämnena till mörka staten (~ 2 kW/cm2). När fluorophores börjar blinka, sätta exponeringen för 15 ms och få till 300. Välj Frida läget av belysning. Använd utbud indikator läget utan automatisk skalning för att verifiera att enda molekyl signaler inte mätta kameran (indikeras av den röda färgen). I så fall minska känsligheten tills mättnaden försvinner. Tetraspeck pärlor förblir mättade i början av förvärvet. Tryck på stoppa för att stoppa kontinuerlig observation av cellen.
  11. Expandera verktyget Online bearbetning och kontrollera Online bearbetning PALM för att visualisera STORM bilden under förvärv. Använd följande parametrar: 9 för Peak maskstorlek (9 pixlar diameter), och 6 för Peak intensiteten till buller. Avhandlingar parametrar kommer att definiera de molekyler som beaktas i behandlingen (ljusa nog och inte överlappande). I verktyget PAL-statistik , Välj plottyp: histogramoch Histogram Källa: Precision. Tryck på Starta förvärv.
  12. Under förvärv, fokusera om det behövs (om det finns ingen fokuslås enhet). Justera parametrar (exponering, laser befogenheter) och så småningom slå på 405-nm laserlinjen (börjar på 0,001%) att hålla en medelhög densitet på fluorophores med ett minsta avstånd på 1 µm mellan enstaka molekyler (> 9 pixlar på 100 nm, Peak maskstorlek) ( Figur 1A-B). Om molekyl densitet är lite för högt, Använd HILO (starkt lutande och laminerade optiska plåt) läget av belysning istället för Frida. Detta kommer att öka lasereffekten med 20%. Se till att toppen av lokalisering precision på histogrammet den rekonstruerade bilden nedan är centrerad runt eller under 10 nm.
    Obs: Brukar antalet molekyler minskar med tiden, och 405-nm laser kraften ökas långsamt med detta. Målet är att minska den lokalisering precisionen (histogram visas under super-upplösning bilden) så mycket som möjligt med en topp under 10 nm (figur 1 c). Öka kontrasten av PALM bilden om det behövs, om alltför många ljusa pärlor finns i fältet.
  13. Tryck på stoppa för att stoppa filmen när mer än 106 lokaliseringar har nåtts (vanligtvis efter 40 000 ramar). Sätta lasrar tillbaka till 0,2% (642 nm) och 0 (405 nm). Spara raw-data av förvärvet STORM med formatet .czi. Avmarkera spåret ”647” i verktyget kanaler och välj och kolla spår ”555”.
  14. Ställa in exponering till 25 ms och få till 0. Tryck på knappen kontinuerlig och ställa både 488 och 561 lasrar på 100% till pump Alexa555 färgämnen till mörka staten (~ 2 kW/cm2 vardera). När fluorophores börjar blinka, sätta vinsten till 250, använda HILO BELYSNINGSLÄGE och kontrollera att enstaka molekyler inte mätta kameran med utbud indikator läge. Om så är fallet, minska känsligheten. Tryck på Stop. Minska 488-laser kraften till 50%.
  15. Tryck på Starta förvärv. Under förvärv, gradvis öka känsligheten för att alltid vara på gränsen till mättnad. Öka stegvis 405-nm laser makt att hålla en medelhög densitet av enda molekyl i synfältet (se steg 6.18). Minska den 488 lasereffekten till 20-30% när 405 lasern är högre än 15%. Sedan minska gradvis 488 samtidigt öka 405 laserlinjen för att hålla den blinkande av molekylerna så fort som möjligt. 488 laserlinjen tillsammans med 561 excitation lasern på maximal intensitet ökar både på och utanför priser av fluorophores, medan 405 laserlinjen ökar bara på priset.
  16. Stoppa förvärvet när mer än 500 000 lokaliseringar har nåtts (efter cirka 20 000 bilder) eller mer när inga fler molekyler blinkar. Spara raw-data av förvärvet STORM med formatet .czi.
    Obs: Börja alltid med den högre våglängden att undvika blekning (eller aktivering) av de andra färgerna. Eftersom chamlide kammaren inte är förseglad, det är möjligt att ändra imaging bufferten regelbundet, t.ex. att testa olika buffert villkor. Med hjälp av 488 laserlinjen för att tömma de Alexa 555 färgämnena är nödvändigt endast när 561 laser strömmen är begränsad (med 100 mW lasrar).

7. image reconstruction (5 min)

  1. I verktyget PAL-Drift kan använda modellbaserade korrigering med automatiska segment med en maximal storlek av 8. Klicka på tillämpa flera gånger i rad tills drivan har korrigerats. Denna modell-baserad korrigering tillämpas en algoritm baserad på cross-korrelation analys som korrigerar drivan.
  2. Verktyg, med hjälp av PAL-Filter och förbättra utseendet på STORM bilden genom att välja endast de molekyler som var bästa lokaliserade. Till exempel begränsa lokalisering precision till 30 nm och polyesterstapelfibrer till 120-180 nm.
  3. Använd en upplösning på 5 eller 10 nm i verktyget PAL-render , liksom en Gaussisk visningsläge, med en expansion faktor 1 polyesterstapelfibrer. Välj Render auto dynamiskt omfång HR med ett 95%-värde och Render auto dynamiskt omfång SWF med en 90%-värdet. Välj Render bästa kvalitet.
  4. Välj PALM konvertera, i menyn PALM på fliken bearbetning (efterbearbetning läge). Tryck på Välj och sedan applicera. Spara den skapade bilden med ett format. LSM (och inte .czi, mycket viktigt).
    Obs: Bild rekonstruktionen kan utföras omedelbart efter förvärvet eller senare använder bildbehandling läge av programvaran förvärvet. I raden av efterbearbetning läge, är det möjligt att analysera igen stackarna med olika värden på parametrar (peak maskstorlek, maximal intensitet för buller). Alltid välja att ”kasta överlappande molekyler” och inte ”genomsnittet före lokalisering”.

8. uppskattning av lokalisering precisionen i en STORM image (10 min)

  1. Öppna din STORM rådata och använda bildbehandling tab. Välj metoden PALM och sedan PALM igen. Tryck på Välj.
  2. Tryck på Verkställ börja rekonstruktionen med en peak-maskstorlek 9 och en maximal intensitet för buller av 6 (eller de parametrar som du väljer för bilden).
  3. Välj verktyget rektangel grafik och rita en rektangel på raw-bilden runt en enda molekyl som är närvarande på glasytan. Det finns oftast några enstaka molekyler där.
  4. Tryck på Verkställ igen och bara molekylerna inuti rektangeln regionen kommer att analyseras.
  5. I verktyget PAL-statistik , Välj plottyp: histogram och Histogram Källa: X position eller Y-position, att visualisera position histogram.
  6. Spara tabellen med listan över lokaliseringar till vänster nedanför bilderna.
  7. Med hjälp av en programvara för analys av data, skapa histogram av X och Y positioner (figur 1 d).
  8. Passa distributionerna av en Gaussisk och spara σX och σY -värden. Den lokalisering precision σSMLM uppskattas av (σX *σY) ^ 0,5.
  9. Upprepa steg 8,3-8,8 på så många molekyler som möjligt och i genomsnitt σSMLM

9. kanal registrering (5 min)

  1. Öppna den STORM bilden av varje färg med hjälp av Fiji (bild J) programvara.
  2. Välj verktyget trollspö att mäta positionerna för varje tetraspeck pärlor.
  3. Beräkna X och Y SKIFT för varje pärla och genomsnittlig dem.
  4. Använd kommandot ”översätta” för att översätta den andra bilden med den beräknade X och Y förskjutningar.
  5. Slå ihop de två bilderna med kommandot Lägg samman kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett Mikroskop utrustade med 50 mW 405 nm och 100 mW 488, 561 och 642 nm solid-state-lasrar, en elektrisk 512 x 512 kamera, en alfa planerar Apo 100 X / 1,46 mål och Band passera 570-650 / långa Pass 655 utsläpp filter användes för representativa resultat presenteras nedan.

Figur 1A ger ett exempel på molekylen densitet och signal-brus-förhållande som ska användas under raw-bild förvärv. Bilder av bra kvalitet erhålls med ett minimum av ~ 1 µm mellan närliggande molekyler. Bra blinkande villkor, bör fluorophores finnas i endast en bildruta. Bra blinkar kräver för att justera villkoren imaging buffert (pH, reduktiv agent, syre rensning system) och laser befogenheter, som påverkar det på - och av-priset av fluorophores, och därför skyldighet cykel (andelen av tiden en fluorophore tillbringar i läget)9,11. Figur 1B, ger däremot ett exempel på raw-bild där molekylen tätheten är för hög och enda molekyl inte kan lösas.

Figur 1 c visar ett typiskt histogram över lokalisering preciseringar för alla molekyler identifieras och analyseras av tillverkaren programvaran från en skorsten av 20 000 ramar. Histogrammet motsvarar dSTORM bilden av det mikrotubulära nätverket visas i figur 3B. Värdena för lokalisering preciseringar som tillhandahålls av tillverkaren programvaran är bra överens med värden beräknade följande steg 8, med hjälp av en enda molekyl lokaliserade på olika tid punkter22 (figur 1 d) peka precision.

Figur 2A visar ett typiskt exempel av dSTORM bild av vimentin filament immunolabeled med Alexa647. Ökningen i resolutionen kan tydligt observeras på jämförelse med bilden förvärvade med standard wide-fält Mikroskop (figur 2B-C). Fluorescens intensitet profilerna representerade i figur 2D visar att super-resolution mikroskopi imaging tillåter att lösa vimentin buntar. DSTORM upplösningen är tillräcklig för att räkna antalet trådar i buntarna.

Figur 3 visar ett typiskt exempel på tvåfärgad dSTORM bilden av den vimentin och tubulin nätverk immunolabeled med Alexa647 och Alexa555 respektive. Överlagring av två nätverk visar att vimentin buntarna är ofta lokaliserade längs mikrotubuli, tillhandahålla strukturella nyckelinformation på kopplingen mellan de två cytoskelett delsystem.

Figur 4 illustrerar olika exempel av dSTORM bilder av mikrotubuli som erhållits i icke-optimala förhållanden. Först med Alexa488 och en buffert med 143 mM beta-merkaptoetanol (en annan reduktiv agent används i stället för MEA9,10,11) och ett syre rensning system (består av 0,5 mg/mL glukosoxidas och 40 µg/mL katalas), fluorophores var blinkar men inte var tillräckligt ljust för att vara just lokaliserade (för låg photon nummer) (figur 4A). Andra använder Alexa555 med 143 mM beta-merkaptoetanol, 50 mM MEA och ett syre rensning system, fluorophores inte kunde pumpas till deras mörka tillstånd och därför inte vara väl rumsligt separerade (alltför hög intermittens, dvs bråkdel av tid i tillståndet ”på” är för lång) (figur 4B). Slutligen, med Alexa568, med 143 mM beta-merkaptoetanol, 50 mM MEA och ett syre rensning system, fluorophores inte var ljusa och var blinkar långsamt med mycket lång ”på” och ”off” stater (låg photon nummer och för hög intermittens) (figur 4 c). I alla dessa icke-optimala förhållanden, var det mikrotubulära nätverket dåligt utförda i super-upplösning bilder. Sammanfattningsvis, optimala förhållanden kräver fluorophores med hög photon nummer och låg intermittens9,10 i motsvarande imaging bufferten. Observera att optimera märkning densitet och imaging buffert villkor för att få bra blinkande villkor är ett standardförfarande för tvåfärgad dSTORM och är inte specifik för IF-mikrotubulära imaging.

Enligt den Nyquist-Shannon teorem, är det nödvändigt att ha fluorophores minst var 10 nm till har en upplösning på 20 nm. Utvidgas till 2D strukturer, beräknad Dempsey et al att en märkning av ~ 104 fluorophores per µm2 är nödvändigt. Om nätverket är tätare och dess filament är tunnare (10 nm vs 25 nm diameter utan de primära och sekundära antikropparna) jämför med det mikrotubulära nätverket, konstaterade vi att två gånger mer lokaliseringar är nödvändigt att beskriva om nätverket. Vi fick bra bilder med 5 000 lokaliseringar/µm2 för IF och 2500 lokaliseringar/µm² för mikrotubuli, erhålls med 40 000 ramar och 20 000 ramar respektive. Bilden med högsta upplösning erhölls med lokalisering precision σSMLM ~ 8-12 nm beräknad efter steg 8 i protokollet (peka precision av en enda molekyl lokaliserade på olika tid punkter22). Denna uppskattning av lokalisering precision var bra överens med de värden som tillhandahålls av tillverkaren programvaran visas i ett histogram över lokalisering preciseringar utvinns ur alla identifierade molekyler i rådata (exempel visas i figur 1 c). Sådan lokalisering precision skulle kunna ge en bild med en upplösning på ~ 30 nm (2,35 * precision) om märkning densitet är tillräckligt hög. Vi observerade rutinmässigt vimentin glödlampor med en Full bredd på halva maximala (FWMH) ~ 40 Nm och mikrotubuli med en bredd FWMH ~ 55 nm. Eftersom bildens upplösning beror på både lokalisering precision och lokalisering tätheten, ger vi experimentella förhållanden att de bästa resultaten med hänsyn till båda kriterier.

Figure 1
Figur 1 : Optimal täthet av enstaka molekyler vid förvärvet och lokalisering precision uppskattning.
(A-B) Vänster: Representativa raw-bilder från en bildruta med en optimal täthet av enstaka molekyler i ljusa tillstånd (A) och med en alltför hög täthet (B) under STORM förvärv (steg 6.12.) av fasta U373 celler fläckade anti-vimentin och antimus Alexa647. Rätt: RAW-bilder där de enstaka molekylerna med fluorescens nivå över Peak intensiteten till buller tröskel (inställd på 6) är omgiven av cirklar (vitt eller rött). Cirkeldiameter bestäms av Peak maskstorlek (satt till 9 pixel) och färgen avgör om molekylerna överlappar (röd) eller inte (vit). Observera att hög täthet av enstaka molekyler (i B) leda till en stor mängd överlappande molekyler som inte tas hänsyn till STORM bild återuppbyggnad. A infälld: diagram som visar en typisk fluorescens intensiteten profil av en enda molekyl i rött och dess Gaussisk passar i svart. I det här exemplet lokalisering precisionen är σx = 6,7 nm. Skalstapeln, 1 µm. (C) typiska histogram över lokalisering preciseringar för alla molekyler identifieras och analyseras av programvaran från tillverkaren. Det kan visualiseras och uppdateras regelbundet vid förvärvet av raw-data tack vare online bearbetning. Histogrammet motsvarar dSTORM bilden av det mikrotubulära nätverket visas i figur 3B. (D) Vänster: STORM bilden av en enda molekyl presenterar på glasytan efter återuppbyggnad. Rätt: Histogram av X och Y positioner erhålls efter Gaussisk montering. Gaussisk passande X och Y fördelningarna ge en uppskattning av lokalisering precision. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representant dSTORM bilden av ett nätverk för vimentin. dSTORM bild (A), motsvarande standard wide-fältet bild (B) och overlay (C) visar en U373 glial cell fixeras som beskrivs i protokollet och färgas för vimentin med Alexa647 framkant. Botten: zoom på det markerade området. (D) Transverse intensitet profiler längs den gula linjen på zoomade bilderna i A och B. skala bar, 2 µm och 500 nm i zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Representativa tvåfärgad dSTORM bild av vimentin och mikrotubuli nätverk. (A) Vimentin nätverk färgas med Alexa647 (samma som i figur 2A). (B) mikrotubulära nätverket märkt med Alexa555. (C) överlägg av vimentin (röd) och mikrotubuli (cyan) nätverk med ett zoom område till höger. DSTORM bilden av vimentin erhölls med ~1.5 miljoner av lokaliseringar av 40 000 ramar. DSTORM bilden av mikrotubuli erhölls med ~ 850 000 lokaliseringar av 20 000 ramar. Skala bar, 2 µm och 500 nm i zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Exempel på icke-optimala imaging villkor med mikrotubuli. När fluorophores blinkar men inte är tillräckligt ljust för med en Alexa488 märkning av tubulin i U373 gliaceller och 143 mM BetaMercaptoethanol och syre gatsopare i imaging bufferten (A), när fluorophores är ljusa nog men kan inte vara korrekt utarmat i mörka tillstånd (vid den maximala lasereffekten tillgängliga) och blinkar långsamt med Alexa555 Märkt tubulin i 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA och syre gatsopare buffert (B) och när fluorophores blinka långsamt och inte är ljusa med Alexa568 Märkt tubulin i en storm-buffert som innehåller 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA och syre gatsopare (C). I alla dessa fall har dSTORM bilderna försämrad upplösning. Skala bar, 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Representativa tvåfärgad dSTORM bild av vimentin och mikrotubuli nätverk av en U373 cell fast med kall metanol för 5 min. (A) Vimentin och (B) mikrotubuli nätverk märkt med Alexa647 och Alexa555 respektive med markerade zoomar. Notera förekomsten av enstaka molekyler på framsidan av cellerna lokaliserade i cytoplasman minska globala upplösningen av glödtrådens nätverken. Skala bar, 2 µm och 500 nm i zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Jämförelse av dSTORM rekonstruerade bilder
Rekonstruerade dSTORM bild av den programvara från tillverkaren (A) och åska (FiJi plugin) (B). (C) överlagring av (A) i magenta och (B) i grönt. Skala bar, 2 µm och 500 nm i zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Vi presenterar här ett protokoll som minimerar artefakter i dSTORM bilder av mikrotubuli och IFs i gliaceller. Artefakter kan skapas vid varje steg av provberedning och imaging: fixering, blockering, immunolabeling, glida under förvärv, icke-optimala blinkande villkor23. Vi listar nedan de viktigaste stegen.

Rengöring av coverslips är ett viktigt steg för att begränsa den icke-specifik bindningen av fluorophores på ytan och därför att begränsa bakgrundsbruset i dSTORM bilden.

Vi föreslår att fastställande provet med ett steg utvinning och fixering lösningar med en blandning av glutaraldehyd och triton, och sedan fixering med PFA (PARAFORMALDEHYD) (n ° 3 steg). Fixering protokollet var anpassad från Chazeau et al12: Vi minskade utvinning/fixering steg inkubationstiden till 60 s (steg 3,4), ta bort glukos från cytoskelettet bufferten, och hoppade över den extra-steget av permeabilisering. Fördelen med denna metod är att de fritt rörliga cytoskeletal subenheter är dräneras bort, vilket gör att super-upplösning imaging med mindre bakgrund12. Mer allmänt steget fixering är kritisk eftersom dålig fixering (med gamla PFA, kalla lösningar, alltför långa/korta inkubationsstegen) leda till partiell förstörelse av glödtrådens nätverken (trasiga mikrotubuli, mikrotubuli som inte når cellen fronten eller i en låg densitet). Observera att det också är möjligt att använda metanol fixering, speciellt om bara vimentin nätverket är avbildade som beskrivs i Leduc et al15. Bakgrundsljud kan dock observeras i cellen (figur 5). Även om dSTORM bilder erhålls med metanol fast celler är av sämre kvalitet, de fortfarande ger information om vilken både om och mikrotubuli nätverk ska se ut t.ex. på sikt av glödtrådens täthet. Fixering med endast glutaraldehyd gav mycket dåliga resultat för IFs, även om det är det bästa protokollet för mikrotubuli fixering23.

I den immunfärgning delen är det viktigt att använda anti-mus-antikroppar som minimerar korsreaktion med antikroppar utvecklas i råtta. Vi kunde inte använda Fab fragment (anti mus) av denna anledning, eftersom de korsreagerar icke-specifikt med det råtta anti tubulinet utöver den musen anti-vimentin.

På grund av den begränsade lasereffekten tillgängliga är det nödvändigt att använda både 488 och 561 nm laserlinjer för att pumpa de Alexa555 färgämnena till mörka staten. Hög 488 lasereffekt (~ 50%) är också nödvändigt under förvärvet att observera bra blinkar och låg intermittens (fraktionen av tiden en fluorophore tillbringar i läget), även om det ökar bakgrund buller också. Den Frida BELYSNINGSLÄGE begränsar excitation av fluorophores i ett tunt lager (~ 200 nm ovanför täckglaset). Det ökar signal-brus-förhållandet genom att minska bakgrundsljus, men också minskar excitation makt. HILO läget tillåter axiella snittning och kan vara effektivt att optimera förhållandet signal-brus. Det är därför ett bra mellanting mellan epi och Frida. Använda HILO läge är viktigt att excitera effektivt den Alexa555 fluorophores, som kräver hög lasereffekt blinka ordentligt.

Ett annat viktigt steg är förvärvet av rådata (steg 6). Det är nödvändigt att justera parametrarna för förvärvet (exponering, viktökning, Frida och även fokus när ingen fokus blockenhet finns) medan filmen förvärvas. Hålla en optimal täthet av ljusa fluorophores är viktigt (figur 1A): det skall vara tillräckligt låg för att rumsligt skilja varje dye, men tillräckligt hög för att visualisera hela strukturen efter 40 000 ramar. Om antalet aktiverade molekyler är för låg, bör längre högar förvärvas. Vi fick bra bilder med ~ 5000 localizations per µm² för IFs och 2 500 lokaliseringar per cm² för mikrotubuli.

Modifieringar och felsökning av metoden

Det är viktigt att arbeta med färska prover och optimerad imaging buffertar. pH bör justeras exakt, särskilt för MEA.

Vimentin och mikrotubuli ska se enhetligt märkta när avbildas med standard wide-fältet mikroskopi teknik (WF). Om filament ser kantats/streckad med klassisk mikroskopi, kommer att detta förstärkas när du använder super upplösning. I det här fallet är det bättre att förbereda nya prover. Icke-optimerade fixering villkor (gamla PFA etc.) kan resultera i mikrotubuli inne och fragmenterad. Hög bakgrund på glasytan kan uppstå från en ineffektiv blockering. I så fall kan BSA (bovint serum albumin) ersättas med FBS (fetalt bovint serum), och användas i varje inkubationsstegen.

Om märkning densitet är för hög (figur 1B) och kan inte skjutas tillräckligt i mörk off-läge, även med den högsta lasereffekten, mängden sekundära antikroppar bör sänkas (bättre än minskar mängden primära antikroppar). Detta kräver dock beredning av nya prover. Det är i allmänhet nödvändigt att empiriskt utvärdera mängden sekundära antikroppar att använda.

Om fluorophores inte blinkar normalt (de bör vara i tillståndet ljusa under endast en ram), kontrollera att pH-värdet i imaging bufferten är rätt (pH 8,3). Förbereda nya lösningar om problemet kvarstår (särskilt MEA). Kontrollera alltid att den Frida kollimator är på (Frida u_HP). Med begränsad lasereffekt, att erhålla korrekt blinkar kan vara utmanande (den på och av priser samt färgämne ljusstyrka beror på lasereffekt, som beskrivs i van de Linde et al11). Andra färgämnen som Alexa488 eller Atto488 kan utforskas om mer makt av magnetiseringen laser är tillgängliga14.

Om fluorophores slutar blinka innan slutet av de 40 000 ramarna, ändra imaging bufferten som kan har oxiderat. Kontrollera att det inte finns några luftbubblor mellan bufferten och locket efter buffert. Förseglat prov kunde avbildas för ett par timmar i en rå.

Om STORM filmer förvärvas på regelbundna Frida Mikroskop utrustade med en elektrisk, är det möjligt att använda åskväder24 för att rekonstruera bilderna. Det finns liknande alternativ för drift korrigering, bildfiltrering och bildåtergivning. Åska är en plugin som används med programvaran Fiji/imageJ. Liknande resultat erhölls med programvara från tillverkaren och åska (figur 6).

BARNSÄNG (cyclooctatetraene) kan läggas till imaging bufferten att förbättra lokalisering precisionen av enstaka molekyler. Det ökar antalet fotoner som avges per cykel för Alexa64725. En bättre lokalisering precision observerades faktiskt (ner till 6 nm) när lägga till 2 mM barnsäng till STORM bufferten beskrivs i steg 5 eller med 100 mM MEA som beskrivs i referens25. Dock i dessa villkor, antalet ljusa molekyler under förvärvet minskar mycket snabbare än utan COT, begränsa det totala antalet molekyl lokaliseringar i slutet av förvärvet och potentiellt leder till bristande provtagning om nätverket. Andra imaging buffertar rapporterades att fungera bra med Alexa färgämnen, till exempel med laktas och oxyrase som syre rensning system26. I detta protokoll, rapporterar vi buffert sammansättning som gav bäst resultat på sikt resolution för vår typ av prover och imaging ställa in, men varje Provtyp kräver buffert optimering, förutom märkning och fixering villkor optimering.

Begränsningar av metoden och möjliga förbättringar

Metoden presenteras här är begränsat till fasta celler och 2D-bilder. Använda en standard imaging uppsättning upp med Frida Mikroskop och en elektrisk, den mest begränsande faktorn var laser befogenheter (100 mW för 561 nm laser var inte tillräckligt för att göra de Alexa555 färgämnena blinka). En 532-nm laserlinje kan vara effektivare att väcka dessa färgämnen. En möjlig förbättring av metoden skulle vara att utföra 3D dSTORM använder optisk astigmatism27. Detta skulle kräva minimala ändringar av protokollet, förutom en lägre märkning densitet och en ökad bildrutenummer. 3D dubbel färg STORM bild skulle ge en bättre bild av IFs virad runt mikrotubuli, särskilt i buntar. Observera att aktin filament också kunde observeras med hjälp av samma metod som fixering och en optimerad mängd fluorescerande phalloidin8. 3 färg STORM kunde användas för att följa organisationen av de tre cytoskeletal delsystem.

Med hjälp av primära och sekundära antikroppar ökar storleken på objekt av intresse eftersom den sekundära antikroppen är lokaliserad upp till 20 nm från målet. Vanligtvis, en 25-nm diameter mikrotubulära har en bredd på ~ 50 nm efter märkning. En möjlighet att förbättra avståndet mellan målet och färgämnet är att direkt märka de primära antikropparna med de lämpliga färgämnena. Nanobodies märkt med organiska färgämnen bör helst vara används28.

Vi erbjuder här bara en enkel metod för att uppskatta den genomsnittliga lokalisering precisionen av en enda molekyl efter Endesfelder et al22. Den totala upplösningen för bilderna som tar hänsyn till både lokalisering precision och märkning densitet, kan också mätas med hjälp av Fourier Ring korrelation metod29.

Den kanal som registrering är det svårt att överlagra perfekt alla pärlorna finns i synfältet. En mer komplex korrigering kan hittas i Chazeau et al 12.

Begränsningar som följer av blinkande fluorophores och blekning av sonderna kan övervinnas med hjälp av DNA-PAINT (DNA Points ackumulering för Imaging i nanoskala topografi)30. I denna metod, är den blinkande nödvändigt för enda molekyl lokalisering skapad av övergående bindningen av kort-dye-märkt oligonukleotider till sina kompletterande mål.

Slutsats

Denna artikel presenterar en robust protokoll för att utföra tvåfärgad dSTORM imaging i 2 dimensioner av cytoskeletal filament i fasta celler. Av försöksbetingelser som hittades optimal när det gäller fixering, immunolabeling och imaging buffert för våra Provtyp beskrivs i detaljer. Sedan processen för rådata förvärv och typ av blinkande bilder som registreras (molekyl densitet, signal-brus-förhållande, fluorophore duty cycle etc) presenteras samt hur man rekonstruera dSTORM bilder, korrekt drift och filtrera data. Dessa steg är allmänna för tvåfärgad dSTORM imaging och prova inte typ specifika. Slutligen visas det hur denna teknik hjälper till att lösa tät organisationen av två kopplade cytoskeletal nätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Mickael Lelek, Orestis Faklaris och Nicolas Bourg för givande diskussion, Andrey Aristov och Elena Rensen för hjälp med den super resolution-tekniken och Shailaja Seetharaman för noggrann läsning av manuskriptet. Vi erkänna tacksamt UtechS fotoniska BioImaging (Imagopole) Citech av Institut Pasteur (Paris, Frankrike) samt Frankrike-BioImaging infrastrukturnätverket stöds av franska National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investeringar för framtiden), och de Région Ile-de-France (programmera Domaine d'Intérêt majeure-Malinf) för användning av mikroskopet Elyra. Detta arbete stöds av den Ligue Contre le Cancer och den franska National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Tags

Fråga 133 vimentin mellanliggande glödtrådar utvecklingsbiologi mikrotubuli STORM super-resolution mikroskopi cytoskelettet
Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S.… More

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter