Summary
والهدف العام لهذه المنهجية إعطاء أفضل الظروف التجريبية من إعداد نموذج للحصول على الصور، وإعادة الإعمار من أجل أداء 2D ثنائي اللون دستورم الصور ميكروتوبوليس وخيوط متوسطة في الخلايا الثابتة
Abstract
سيتوسكيليتون، تتألف من أكتين ميكروفيلامينتس، ميكروتوبوليس، وخيوط متوسطة (إذا كان)، دوراً رئيسيا في السيطرة على شكل الخلية والأقطاب وحركية. درس تنظيم شبكات أكتين وميكروتوبولي على نطاق واسع ولكن أن الاتحاد لا بعد تماما وتتميز. الاتحاد يكون متوسط قطرها 10 نانومتر وشكل شبكة تمتد في جميع أنحاء السيتوبلازم الخلية. أنها ترتبط فعلياً مع الأكتين وميكروتوبوليس من خلال المحركات الجزيئية و cytoskeletal linkers. هذه الرابطة ضيق يقع في صميم الآليات التنظيمية التي تكفل تنظيم الشبكات cytoskeletal الثلاث المطلوبة لمعظم وظائف الخلية المنسقة. ولذلك من الأهمية بمكان لتصور الاتحاد وحدها وأيضا جنبا إلى جنب مع كل من الشبكات الأخرى سيتوسكيليتال. إذا كانت شبكات غير كثيفة جداً في معظم أنواع الخلايا، لا سيما في الخلايا الدبقية، مما يجعل من الصعب جداً تحقيق مع الفحص المجهري fluorescence القياسية قرارها (الأفقي القرار ~ 250 nm). مباشرة "العشوائية بصري التعمير مجهرية" (دستورم) أسلوب يسمح مكسب في القرار الأفقي من حجم واحد. هنا، نحن تبين أن القرار دستورم الجانبي كافية لحل المنظمة كثافة الشبكات إذا، وعلى وجه الخصوص، إذا كانت حزم المحيطة microtubules. هذه الرابطة ضيق من المحتمل أن تشارك في تنظيم منسق لهذه الشبكات اثنين وأيار/مايو، وشرح كيف فيمنتين الاتحاد القالب واستقرار المنظمة microtubule فضلا عن يمكن أن تؤثر على الاتجار حويصلية التابعة ميكروتوبولي. وبصورة أعم، نعرض كيفية مراقبة عنصرين cytoskeletal مع تقنية دستورم المزدوج-لون يجلب ثاقبة جديدة من التفاعل المتبادل بينهما.
Introduction
هيولى خيوط متوسطة (IFs) هي هومو 10 نانومتر-قطر-أو هيتيروبوليميرس من نوع الخلية مجموعة فرعية معينة من البروتينات إذا. ويشارك الاتحاد في مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية مثل الخلية استجابات حركية وانتشارها والإجهاد. دورهم الرئيسي هو أبرز حقيقة أن أكثر من 90 من الأمراض البشرية هي الناجم مباشرة عن طفرات في البروتينات إذا؛ على سبيل المثال، التغييرات في تكوين إذا ترافق نمو الورم وينتشر1،،من23. تتزايد الأدلة التي تعمل بثلاثة أنظمة سيتوسكيليتون في التعاون لمراقبة الوظائف الخلوية مثل الخلية الاستقطاب، شعبة والهجرة2،3. إذ هناك اقتران ضيق بين الهيكل المكاني، والوظائف، من الأهمية بمكان للحصول على رؤى في الهيكل التنظيمي المتكامل مع خيوط أخرى وفهم أفضل سيتوسكيليتال للتحدث عبر. تنص هذه المادة على بروتوكول لأداء ثنائي اللون دستورم (المباشر العشوائية بصري التعمير مجهرية) تقنية فائقة القرار4 وكيف يتم استخدامه للتحقيق بالتفاعل بين إذا و microtubules في ثابت، ومثقف. الخلايا في 2 الأبعاد (2D).
وقد وضعت العديد من التقنيات فائقة القرار على مدى العقد، وهناك اكتشافات كانت في الأصل على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 20145. تقع بين جميع هذه التقنيات الأساليب المستندة إلى التعريب جزيء واحد مثل النخيل6 (فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية) الذي يستخدم البروتينات الفلورية فوتوسويتشابل، العاصفة7 مع أزواج من فلوروفوريس أو دستورم4 مع فلوروفوريس التقليدية. جميع هذه الأساليب تقوم على نفس المبدأ الذي يتألف من (ط) تبديل معظم الصحفيين الفلورية إلى حالة "إيقاف التشغيل" "(غير-فلوري)، (ثانيا) تفعيل العشوائية لمجموعة فرعية منها في فلوري الدولة من أجل ترجمة هذه الموقف المكاني بدقة نانومتر، و (iii) تكرار هذه العملية من أجل تفعيل العديد من مجموعات فرعية من فلوروفوريس قدر الإمكان. يتم إعادة إنشاء صورة نهائية باستخدام جميع تعريب من جزيئات المنشط، تقديم قرار جانبية وصولاً إلى ~ 20-40 نانومتر. عدة نظم الضوئية تجارياً يسمح بألم/العاصفة متاحة الآن لعلماء الأحياء لإجراء التجارب الروتينية. هنا، كان يستخدم واحد مثل هذا النظام لدراسة هيكلية رابطة microtubules والاتحاد. بين كل جزيء مفرد المستندة إلى تعريب الأساليب، اختير هذا الأسلوب المزدوج-لون دستورم، لأنها مناسبة تماما لمراقبة المناطق رقائقي رقيقة جداً (< 1 ميكرومتر) من الخلايا ملتصقة ويمكن أن توفر تحسنا كبيرا من دقة الصورة مع الحد الأدنى من استثمار الوقت والمال. وفي الواقع، دستورم هو تقنية مريحة للغاية وتنوعاً متوافق مع الأصباغ العضوية القياسية المستخدمة بشكل روتيني لتلطيخ الخلوية والفلوره.
بينما الصور دستورم لون واحد بسيطة نسبيا للحصول على استخدام فلوروفوري Alexa6478، يتطلب دستورم اللون المزدوج تحسين ظروف تجريبية بحيث يمكن وميض الأصباغ اثنين بشكل صحيح في المخزن المؤقت الذي تم اختياره، ولا سيما عندما يكون هناك محدودة طاقة الليزر. أوراق ممتازة متاحة بالفعل على أساليب لإعداد التصوير متعدد الألوان مع دستورم9،،من1011،،من1213، وهذه الورقات شرح بالتفصيل المصادر الممكنة من القطع الأثرية ودقة وضوح الصورة المتدهورة وكيفية التغلب عليها. في هذه المقالة، والظروف التجريبية الأمثل من حيث تثبيت الخلايا، إيمونوستينينج، وإعداد نموذج، اقتناء التصوير وإعادة بناء صورة موصوفة بغية الحصول على الصور من شبكات إذا هيولى كثيفة وميكروتوبوليس في الخلايا الدبقية مع دستورم اللون المزدوج. بإيجاز، الطريقة استخراج/التثبيت الموضحة في كازو et al12 تم تكييفها للخلايا الدبقية واستخدامها مع خطوة بعد انتهاء تثبيت، تركيز الأجسام المضادة الأمثل، مخزن مؤقت عاصفة مع 10 ملم وصف اتفاق بيئي متعدد الأطراف في ديمبسي9 et al. الذي كان وجد أن الأمثل لإعداد تجريبية ونوع العينة.
الخلايا الدبقية express أساسا ثلاثة أنواع من البروتينات إذا: فيمنتين، نيستين وتوصيني (الدبقية الحمضية البروتين فيبريلاري). وعرضت هذه البروتينات الثلاثة بلمرة يشترك في أستروسيتيس14. أظهرنا سابقا باستخدام فائقة القرار تنظيماً إضاءة مجهرية (SIM ريال) أن ويمكن الاطلاع على هذه البروتينات إذا كان ثلاثة في الشعيرة إذا واحد نفسه وأنها عرض التوزيع وديناميات مماثلة في الخلايا الدبقية 15. نظراً للتشابه بين البروتينات إذا ثلاثة، تلطيخ فيمنتين كمراسل لشبكة الاتصال إذا كان كله. باستخدام دستورم، تمكنا من حل كيف إذا شكل حزم على طول ميكروتوبوليس، التي لم يكن من الممكن مع حيود محدودة المجهري تقنيات15. قد تساعد هذه الملاحظات فهم كيف يمكن للاتحاد فيمنتين microtubules القالب وتنظم على مسار النمو، تعزيز الحفاظ على محور قطبية أثناء الهجرة الخلية16. صور فائقة الدقة قدمت معلومات أساسية عن التفاعل المتبادل بين نظامين فرعيين cytoskeletal، والتبصر في الربط بين الرابطة المكانية والوظيفة المحلية التي يمكن أن تكون من نوع خلية محددة17. وبصفة عامة، يمكن استخدام دستورم اللون المزدوج للدراسة الحديث المتبادل بين العناصر سيتوسكيليتال أو أنواع أخرى من العضيات، شريطة أن يتم التوصل إلى شروط إيمونوستينينج جيدة من حيث الكثافة وخصوصية. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأفضل وصف التغييرات cytoskeleton لاحظ أثناء أستروجليوسيس وفي جليوبلاستوما، والورم الأكثر شيوعاً والأكثر الخبيثة للنظام العصبي المركزي، حيث يتم التعبير عن البروتينات إذا غيرت 18 ،19،،من2021.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-كوفيرسليبس إعداد (اليوم 1، 30 دقيقة)
- ضع كوفيرسليبس الزجاج nº1.5H 18 ملم (ميكرومتر 170 +/-5µm) على رف بلاستيك.
- وضع على الرف في كوب 100 مل مليئة بالأسيتون ونقع لمدة 5 دقائق.
- نقل الحامل إلى 100 مل كوب مليئة الإيثانول المطلقة ونقع لمدة 5 دقائق.
- نقل الحامل إلى كوب 100 مل جديدة مليئة الإيثانول المطلقة ووضع في الكأس في جهاز الموجات فوق الصوتية أنظف (انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة. اضغط على "على" والانتظار لمدة 10 دقائق.
- وضع على الرف تحت غطاء الاندفاق الصفحي وترك كوفيرسليبس جاف أو جاف كوفيرسليبس مع تدفق الهواء التي تمت تصفيتها.
- وضع على الرف مع كوفيرسليبس في جهاز بلازما أنظف. التبديل على مضخة فراغ، أغلق الباب، انتظر 3 دقائق لجعل الفراغ والتبديل على البلازما لدقيقة 1 استخدام كوفيرسليبس وقت قصير بعد التنظيف. لا تقم بتخزين لهم.
2-خلية الطلاء (اليوم 1، 20 دقيقة)
- تنمو الخلية الدبقية خط U373 في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) مع 10% "مصل بقرى الجنين"، 1% البنسلين والستربتوميسين، و 1% من الأحماض الأمينية غير الضرورية في صحن بيتري البلاستيك قطرها من 10 سم.
- ضع كوفيرسليبس زجاج نظيفة في لوحات 12-البئر تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي وإضافة 1 مل متوسطة مسخن الخلية الواحدة وكذلك.
- تأخذ طبق يحتوي على خلايا من الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
- إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل 0.05% يدتا التربسين.
- ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق.
- أضف 10 مل متوسط الحار يسخن عند 37 درجة مئوية في الطبق وريسوسبيند الخلايا.
- الخلايا عن كل 100000 البذور كل بئر (~ 150 ميليلتر من الخلايا) في لوحات 12-جيدا التي تحتوي كوفيرسليبس.
- انتظر على الأقل 6 ح (أو بين عشية وضحاها) للسماح بانتشار الخلايا.
3-خلية التثبيت (اليوم 2، ح 2)
- إعداد المخزن المؤقت سيتوسكيليتون مع أنابيب 80 مم، 7 مم مجكل2، 1 مم اجتا، 150 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 6.9.
- تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل كل بئر لاستخراج/تثبيت الحل بلطف (0.25 ٪ glutaraldehyde، 0.3% X-100 تريتون في المخزن المؤقت cytoskeleton) يسخن عند 37 درجة مئوية.
- احتضان 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل وإضافة 1 مل كل من حل منهاج العمل (بارافورمالدهيد) مسخن والطازجة 4% المخفف في المخزن المؤقت سيتوسكيليتون جيدا برفق.
تنبيه: استخدام قفازات وتعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. - ضع لوحة 12-جيدا في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة منهاج عمل بيجين وأضف 3 مل من برنامج تلفزيوني في البئر.
ملاحظة: تعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية مع القفازات ووضع منهاج العمل المعاد تدويرها في سلة محددة. - تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حل الطازجة 10 ملم نأبه4 المخفف في برنامج تلفزيوني من أجل إخماد أوتوفلوريسسينسي القادمة من جلوتارالديهيدي.
- احتضان لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- وضع نأبه المعاد تدويرها4 في سلة محددة.
- أغسل ثلاث مرات 5 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة عرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني).
- احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
ملاحظة: ويمكن تخزين المخزن المؤقت سيتوسكيليتون في درجة حرارة الغرفة لمدة بضعة أشهر. منهاج عمل بيجين ونابه4 glutaraldehyde يجب أن تعالج الرعاية الخاصة (هود، والقفازات، وصناديق إعادة التدوير المحددة). وينبغي إضافة حلول وإزالتها بلطف من أجل الحفاظ على سلامة الخلايا. من المهم عدم السماح للخلايا الجافة.
4-إيمونوستينينج (اليوم 2، ح 5)
- إعداد الحل الأجسام الأولية باستخدام مكافحة فيمنتين tubulin لمكافحة مع إضعاف 1: 500 في عرقلة الحل.
- وضع 100 ميليلتر قطرات من الأجسام المضادة الأساسي المخفف على طبقة فيلم بارافين ومكان كوفيرسليبس فوقهم مع الخلايا التي تواجه إلى الأسفل.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية حاء 2 وضع ملء كوفيرسليبس مرة أخرى في صفيحة 12-جيدا مع برنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
- وفي الوقت نفسه، تعد الأجسام المضادة الثانوية الحل باستخدام الماوس لمكافحة Alexa647 و Alexa555 لمكافحة الفئران في إضعاف 000 1:1، في عرقلة الحل. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تمضي مثل 4.2. حماية الخلايا من الضوء.
- وضع ساترة مرة أخرى في صفيحة 12-بئر مليئة ببرنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مختلطة مع 1 ميليلتر من 0.1 ميكرون تيتراسبيك الخرز.
- وضع الآبار شاكر مداري ل 30 دقيقة شطف مع برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق مع حل منهاج عمل 4% في برنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: ويمكن تخزين الخلايا الثابتة لبضعة أسابيع في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. وينبغي أن يتم إيمونوستينينج في اللحظة الأخيرة.
5-نموذج إعداد (اليوم 3, 5 دقيقة)
- وضع مختبرين اتفاق بيئي متعدد الأطراف (pH سيستيميني، م 1، 8.3)، أوكسيديز الجلوكوز (100 x، 50 ملغم/مل)، كاتالاز (500 x، 20 ملغ/مل) في سلة جليد.
- إعداد 50 مل من كلوريد الصوديوم تريس المخزن المؤقت (50 مم تريس، 10 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 8) تستكمل مع 10% السكر (100 مغ/مل).
- إعداد 1.2 مل من التصوير المخزن المؤقت قبل التصوير مع 10 ملم اتفاق بيئي متعدد الأطراف، أوكسيديز الجلوكوز 0.5 ملغ/مل (75 U/mL)، 40 ميكروغرام/مل كاتالاز (80-200 U/mL) في المخزن المؤقت تريس-كلوريد الصوديوم مع السكر 10%.
- جبل ساترة التي تحتوي على الخلايا المسماة على صاحب العينة المغناطيسية (مثل غرفة تشامليدي) وإضافة المخزن المؤقت التصوير لملء تماما من الدائرة. وضع الغطاء على وتأكد من أنه لا يوجد أي فقاعة هواء بين المخزن المؤقت التصوير والغطاء.
- تنظيف الجزء السفلي من النموذج مع الإيثانول المطلقة والتحقق من أنه لا يوجد تسرب. استخدام الشحوم بختم صاحب العينة بشكل صحيح إذا لزم الأمر.
ملاحظة: إعداد المخزون 1 م حل اتفاق بيئي متعدد الأطراف (pH 8.3 ضبط استخدام HCl) وتقييم أوكسيديز الجلوكوز في 50 ملغ/مل والمخزون من كتالاز في 20 ملغ/مل في المياه، وجعل مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد لاتفاق بيئي متعدد الأطراف، وسنة للغلوكوز أوكسيديز والكاتالاز. عدم إعادة تجميد مختبرين. إعداد المخزن المؤقت تريس-كلوريد الصوديوم مسبقاً وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. قم بإضافة الجلوكوز في يوم التجربة (الخطوة 5، 3).
6-صورة اقتناء (يوم 3، ح ~ 1 كل خلية)
- قم بالتبديل في المجهر. التبديل على اقتناء البرمجيات واضغط على بدء تشغيل النظام.
- حدد توسيع علامة التبويب اقتناء أداة الإعداد التصوير في المجموعة الأداة "إدارة الإعداد". حدد وضع الليزر WF (حقل واسعة) لاقتناء. حدد هدف 100 س نا 1.46 . حدد وضع TIRF يو-إتش بي الذي يستخدم صيد تلسكوب للحد من مجال الرؤية ويجري مضيئة، وتركيز طاقة الليزر في منطقة صغيرة. تستخدم في أوبتوفار عدسة 1.6 x يعطي حجم بكسل 100nm.
- حدد أداة السلاسل الزمنية وإعداد الفاصل الزمني مع إطارات 50 000 و 0.0 مرض التصلب العصبي المتعدد بين الإطارات. توسيع الأداة القنوات في المجموعة أداة المعلمة اقتناء وحدد "إظهار الكل".
- تعيين المسار Alexa647: التحقق في 642 و 405 الليزر خطوط للإثارة وقبول لتشغيلها. حدد عامل التصفية "655 ليرة لبنانية" الانبعاثات في الإعداد التصوير. إعادة تسمية "647".
- انقر على '+' في الأداة القنوات لإضافة آخر تمرير الضوء وتحديد الوضع "المسار رمز التبديل كل: الإطار" في أداة إعداد التصوير . تحقق 561، 488 وخطوط الليزر 405 وقبول لتشغيلها. حدد "بي بي 570-650 + LP750" الانبعاثات التصفية واستخدام العدسة أوبتوفار 1.6 x. تحقق من أن يتم تحديد الوضع يارثلينك TIRF. قم بإعادة تسمية المسار "555".
- حدد أداة وضع الحصول على وتعيين حجم الإطار إلى 200 × 200 بكسل. حدد أداة استراتيجية وأجهزة التركيز وتعيين تركيز محدد للإطارات من 1000 (إذا لم يكن هناك نظام لقفل تركيز).
- وضع الزيت على الهدف ووضع العينة. حدد علامة التبويب تحديد موقع ، وفتح مصراع مصباح الأسفار. العثور على التركيز والبحث عن الخلية إلى صورة باستخدام العدسة. وضعه في مركز مجال الرؤية باستخدام الجويستيك.
- حدد علامة التبويب اقتناء للعودة إلى وضع اقتناء. حدد المسار "647"، تعيين السلطة 642-الليزر بنسبة 0.2 في المائة، تعيين قوة 405-ليزر إلى 0، تعيين وقت التعرض إلى 50 مللي ثانية والكسب من 50. اختر طريقة اكتساب مستمر لمراقبة الخلية على الشاشة. ضبط التركيز. تأكد من وجود واحد على الأقل تيتراسبيك حبة في مجال الرؤية، وزيادة التباين لرؤية لهم إذا لزم الأمر. استخدام وضع مقياس تلقائي للعرض. تأخذ صورة ابيفلوريسسينسي واسع المجال فيمنتين الشبكة بالنقر فوق المفاجئة وحفظه. للتحقق من الإضاءة TIRF، انقر فوق TIRF، وضبط زاوية الإضاءة و/أو صيد تلسكوب إذا اقتضى الأمر أن يكون حقل متجانس للإضاءة وحفظه.
ملاحظة: من المهم أن الصور TIRF وابيفلوريسسينت بجودة عالية قبل البدء في الحصول على البيانات الخام. خيوط متقطع، غير موحد المسمى ستؤدي إلى سوء نوعية دستورم الصور. - قم بإلغاء تحديد المسار "647" وحدد والتحقق من المسار "555". تأخذ صورة ابيفلوريسسينسي من شبكة ميكروتوبولي وحفظه. تأخذ صورة TIRF وحفظه أيضا.
- قم بإلغاء تحديد المسار "555"، حدد والتحقق من المسار "647"، ثم اضغط على استمرار. وضع الربح إلى 0 وتعيين وقت التعرض للسيدة 10 قوة الليزر 642-نانومتر إلى 100% من أجل ضخ أكثر من الأصباغ Alexa647 للدولة الظلام (~ 2 كيلو واط/سم2). بمجرد فلوروفوريس ابدأ وامض، وضع التعرض إلى 15 مللي ثانية، والحصول على 300. حدد وضع TIRF للإضاءة. استخدام وضع مؤشر مجموعة دون مقياس تلقائي للتحقق من أن إشارات جزيء واحد لا تشبع الكاميرا (المشار إليها باللون الأحمر). في هذه الحالة، تقليل الربح حتى يختفي الإشباع. وستظل الخرز تيتراسبيك المشبعة في بداية اقتناء. اضغط إيقاف لإيقاف المراقبة المستمرة للخلية.
- توسيع الأداة على الإنترنت تجهيز والتحقق عبر الإنترنت معالجة النخيل لتصور صورة العاصفة خلال اقتناء. استخدم المعلمات التالية: 9 لأقصى حجم قناع (قطرها 9 بكسل)، و 6 لشدة الذروة للضوضاء. وسوف تحدد المعلمات أطروحات الجزيئات التي تؤخذ في الاعتبار عند المعالجة (مشرق ما فيه الكفاية وعدم التداخل). في أداة PAL-الإحصاءات ، حدد نوع الأرض: الرسم البياني، و "المدرج التكراري المصدر": الدقة. اضغط على البدء في اقتناء.
- خلال اقتناء، إعادة تركيز إذا لزم الأمر (إذا لم يكن هناك أي جهاز قفل التركيز). ضبط المعلمات (التعرض، صلاحيات الليزر) والتبديل في نهاية المطاف على السطر 405 نانومتر الليزر (بدءاً من 0.001 ٪) للحفاظ على كثافة متوسطة من فلوروفوريس مع مسافة أدنى من 1 ميكرومتر بين جزيئات مفردة (100 بكسل > 9 نانومتر، وحجم قناع الذروة) ( الشكل 1A-ب). إذا كانت كثافة الجزيء قليلاً عالية جداً، استخدم وضع حلو (ورقة عالية يميل ومغلفة الضوئية) للإضاءة بدلاً من TIRF. وهذا سيزيد طاقة الليزر بنسبة 20%. تأكد من أن ذروة الدقة التعريب في الرسم البياني أدناه الصورة أعيد بناؤها ويتركز حول أو أقل من 10 نانومتر.
ملاحظة: عادة إنقاص عدد الجزيئات مع مرور الوقت، وزيادة قوة 405 نانومتر الليزر ببطء تبعاً لذلك. والهدف تقليل دقة الترجمة (الرسم البياني المعروض أدناه صورة ذات دقة فائقة) قدر الإمكان مع ذروة أقل من 10 نانومتر (الشكل 1). زيادة تباين الصورة بألم إذا لزم الأمر، إذا كانت حبات مشرقة كثيرة جداً موجودة في الميدان. - اضغط إيقاف لإيقاف الفيلم عندما تم التوصل إلى أكثر من 106 تعريب (عادة بعد الإطارات 40 000). وضع الليزر مرة أخرى إلى 0.2% (642 nm) و 0 (405 nm). حفظ البيانات الخام لاقتناء العاصفة بتنسيق.czi. قم بإلغاء تحديد المسار "647" في الأداة "قنوات"، وحدد والتحقق من المسار "555".
- تعيين وقت التعرض إلى 25 مللي ثانية وكسب إلى 0. اضغط على زر مستمر وتعيين الليزر 488 و 561 سواء عند 100% للأصباغ Alexa555 مضخة للدولة الظلام (~ 2 كيلو واط/سم2 كل). مرة واحدة فلوروفوريس بدء وامض، وضع المكسب 250، استخدم وضع الإضاءة حلو والتحقق من أن الجزيئات واحدة لا تشبع الكاميرا مع وضع مؤشر مجموعة. إذا كان هذا هو الحال، انخفاض الربح. اضغط على التوقف. إنقاص قوة 488-ليزر إلى 50%.
- اضغط على البدء في اقتناء. خلال اقتناء، تزيد تدريجيا الربح لتكون دائماً في حد التشبع. زيادة خطوة بخطوة قوة 405 نانومتر الليزر للحفاظ كثافة متوسطة من جزيء واحد في مجال الرؤية (انظر الخطوة 6.18). إنقاص قوة الليزر 488 إلى 20-30% عندما يكون الليزر 405 أعلى من 15%. ثم تنخفض تدريجيا 488 مع زيادة خط الليزر 405 بغية الحفاظ على تطرف الجزيئات في أسرع وقت ممكن. خط الليزر 488 مقترنة بالليزر الإثارة 561 في الشدة القصوى يزيد على حد سواء وإيقاف معدلات فلوروفوريس، بينما السطر 405 الليزر إلا يزيد معدل على.
- التوقف عن شراء عندما تم التوصل إلى تعريب أكثر من 500 000 (بعد حوالي 20 000 الإطارات) أو أكثر عندما يتم الوميض لا جزيئات أكثر. حفظ البيانات الخام لاقتناء العاصفة بتنسيق.czi.
ملاحظة: تبدأ دائماً مع طول موجي أعلى لتجنب تبيض (أو تنشيط) للألوان الأخرى. إذ لا مختومة في دائرة تشامليدي، فمن الممكن لتغيير المخزن المؤقت التصوير بصورة منتظمة، مثلاً المخزن المؤقت لمختلف ظروف الاختبار. استخدام خط الليزر 488 إلى استنزاف الأصباغ 555 أليكسا ضروري فقط عند طاقة الليزر 561 محدودة (مع 100 ميغاواط ليزر).
7-صورة إعادة الإعمار (5 دقائق)
- في أداة PAL-الانجراف ، استخدم نوع التصحيح المستندة إلى النموذج مع شرائح تلقائي مع حجم الحد أقصى من 8. اضغط تطبيق عدة مرات في صف حتى يتم تصحيح الانحراف. ينطبق هذا التصحيح على أساس نموذج خوارزمية استناداً إلى التحليل عبر الارتباط الذي يقوم بتصحيح الانحراف.
- باستخدام أدوات تصفية PAL ، تحسين مظهر الصورة العاصفة بتحديد الجزيئات التي كانت أفضل المترجمة فقط. على سبيل المثال، الحد من دقة الترجمة إلى 30 نانومتر و PSF إلى 120-180 نانومتر.
- استخدام دقة بكسل من شمال البحر الأبيض المتوسط 5 أو 10 في أداة تجعل PAL ، فضلا عن وضع عرض ضبابي، مع عامل توسع 1 حدد تجعل PSF. السيارات دينامية مجموعة الموارد البشرية بقيمة 95% وتجعل السيارات الديناميكي فرنك سويسري بقيمة 90%. حدد جودة تقديم أفضل.
- حدد تحويل النخيل، النخيل القائمة من علامة التبويب معالجة (الوضع بعد المعالجة). اضغط على اختيار ومن ثم تطبيق. حفظ الصورة التي تم إنشاؤها باستخدام تنسيق. LSM (وليس.czi، هام جداً).
ملاحظة: يمكن تنفيذ إعادة بناء الصورة مباشرة بعد اكتساب أو الأحدث استخدام طريقة معالجة الصور برنامج اقتناء. في السطر قبالة تجهيز الوضع، من الممكن ريناليزي المداخن مع قيم مختلفة للمعلمات (حجم قناع الذروة، ذروة شدتها إلى الضوضاء). دائماً اختيار "تجاهل تداخل جزيئات" وليس "متوسط قبل التعريب".
8-تقدير دقة الترجمة من صورة العاصفة (10 دقيقة)
- فتح البيانات الخام العاصفة واستخدام علامة التبويب تجهيز الصورة حدد الأسلوب النخيل وثم ألم مرة أخرى. اضغط على اختيار.
- اضغط تطبيق لبدء إعادة استخدام قناع ذروة حجم 9 وكثافة ذروة للضوضاء 6 (أو المعلمات التي تختارها للصورة).
- حدد أداة المستطيل الرسومات ورسم مستطيل في الصورة الخام حول جزيء واحد موجود على سطح الزجاج. عادة ما تكون هناك عدد قليل من الجزيئات واحدة هناك.
- وسيتم تحليل صحفي تطبيق مرة أخرى، وإلا الجزيئات الحالية داخل منطقة المستطيل.
- في أداة PAL-الإحصاءات ، حدد نوع الأرض: الرسم البياني، و "المدرج التكراري المصدر": X الموقف أو موقف Y، لتصور رسوم بيانية الموقف.
- حفظ الجدول بقائمة بتعريب على اليسار أسفل الصور.
- استخدام برمجيات لتحليل البيانات، وإنشاء رسوم بيانية X و Y المواقف (الشكل 1).
- تناسب التوزيعات قبل ضبابي وحفظ قيمY X و σ σ. ويقدر σ دقة الترجمةسملم (X *σ σY) ^ 0.5.
- كرر الخطوة 8.3 8.8 على جزيئات أكبر عدد ممكن ومتوسط σسملم
9-قناة التسجيل (5 دقائق)
- فتح صورة العاصفة من كل لون باستخدام البرمجيات فيجي (صورة ي).
- حدد أداة العصا لقياس مواقف كل حبات تيتراسبيك.
- حساب التحولات X و Y لكل حبة ومتوسط لهم.
- استخدم الأمر "ترجمة" ترجمة الصورة الثانية مع المحسوب تحولات X و Y.
- دمج الصورتين باستخدام الأمر دمج القنوات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجهر مزودة بكاميرا 512 × 512، ألفا X Apo خطة 100 50 ميغاواط 405 نانومتر و 100 ميغاواط 488، 561 و 642 نانومتر ليزر الحالة الصلبة، امككد/1.46 الهدف والفرقة تمرير 570-650/طويلة تمرير 655 الانبعاثات مرشحات كان يستخدم للممثل النتائج الواردة أدناه.
يعطي الشكل 1A مثال كثافة الجزيء وإشارة إلى نسبة الضوضاء التي يجب استخدامها أثناء الحصول على الصورة الخام. يتم الحصول على صور ذات نوعية جيدة مع الحد أدنى من ~ 1 ميكرومتر بين الجزيئات المجاورة. في ظروف جيدة وامض، ينبغي أن يكون فلوروفوريس هذا في إطار واحد فقط. امض جيدة يتطلب تعديل شروط المخزن المؤقت للتصوير (درجة الحموضة، وعامل التخفيض، والأكسجين مسح النظام) والليزر القوى، التي تؤثر على--وإيقاف-معدلات في فلوروفوريس، وبالتالي الواجب دورة (الجزء من الوقت ينفق فلوروفوري في الدولة على)9،11. على العكس من ذلك، يعطي الشكل 1B، مثال على الصورة الخام حيث كثافة جزيء عال جداً ولا يمكن أن تحل جزيء واحد.
ويبين الشكل 1 رسم بياني نموذجية للايضاحات التعريب لجميع الجزيئات الكشف عنها وتحليلها من قبل الشركة المصنعة للبرنامج من كومة من الإطارات 20 000. ويناظر هذا الرسم البياني الصورة دستورم شبكة ميكروتوبولي هو موضح في الشكل 3 (ب). تكون القيم للتعريب الإيضاحات المقدمة من الشركة المصنعة للبرنامج باتفاق جيد مع خطوة القيم التالية ما يقدر 8، استخدام الدقة التأشير لجزيء واحد مترجمة في وقت مختلف النقاط22 (الشكل 1).
ويبين الشكل 2A مثالاً نموذجياً لصورة فيمنتين خيوط إيمونولابيليد مع Alexa647 دستورم. يمكن ملاحظة الزيادة في القرار الواضح في المقارنة مع الصورة المكتسبة مع مجهر واسع المجال قياسي (الشكل 2-ج). كثافة fluorescence ممثلة في 2D الرقم تبين أن تصوير مجهرية فائقة القرار يتيح حل حزم فيمنتين. القرار دستورم غير كافية لحساب عدد خيوط موجودة في الحزم.
ويبين الشكل 3 مثالاً نموذجياً للصورة دستورم المزدوج-لون من إيمونولابيليد شبكات فيمنتين وتوبولين مع Alexa647 و Alexa555 على التوالي. يظهر التراكب لشبكتي أن حزم فيمنتين غالباً ما تكون مترجمة على طول microtubules، توفير المعلومات الهيكلية الرئيسية في اقتران بين نظامين فرعيين cytoskeleton.
ويبين الشكل 4 أمثلة مختلفة من الصور دستورم من ميكروتوبوليس التي تم الحصول عليها في ظروف غير مثالية. أولاً، باستخدام Alexa488 ومخزن مؤقت مع مم 143 بيتا-mercaptoethanol (عامل التخفيض آخر يستخدم بدلاً من شركة طيران الشرق الأوسط9،،من1011)، ونظام المسح الأوكسجين (تتألف من 0.5 ملغ/مل الجلوكوز أوكسيديز و 40 ميكروغرام/مل الكاتلاز)، فلوروفوريس كانت تطرف ولكن لم تكن مشرق بما يكفي لتكون دقة موضعية (عدد فوتون منخفضة جداً) (الشكل 4 أ). ثانيا، استخدام Alexa555 مع مم 143 بيتا-ميركابتوثانول ومم 50 شركة طيران الشرق الأوسط واكسجين مسح النظام، فلوروفوريس يمكن أن لا يتم ضخه إلى حالتها الظلام وبالتالي لا يكون كذلك مكانياً مفصولة (دورة الخدمة عالية جداً، أي الجزء من الوقت في الدولة "وعلى" طويل جداً) (الشكل 4 باء). أخيرا، استخدام Alexa568، مع مم 143 بيتا-ميركابتوثانول ومم 50 شركة طيران الشرق الأوسط واكسجين مسح النظام، فلوروفوريس لم تكن مشرقة وكانت الوميض ببطء مع جداً منذ فترة طويلة "عن" و "إيقاف" الدول (دورة الخدمة عالية جداً وعدد فوتون منخفضة) (الشكل 4). في كل هذه الظروف غير مثلى، صدر الشبكة microtubule سيئة في الصور دقة فائقة. وفي الختام، تتطلب الظروف المثلى fluorophores مع عدد الفوتونات عالية ومنخفضة واجب دورة9،10 في المخزن المؤقت للتصوير المقابلة. ملاحظة أن وسم كثافة الأمثل والتصوير شروط المخزن المؤقت للحصول على شروط جيدة وامض هو إجراء قياسي لثنائي اللون دستورم وليست محددة للتصوير إذا microtubule.
وفقا لنظرية نايكست-شانون، من الضروري أن يكون فلوروفوريس على الأقل مرة كل 10 نانومتر الحصول على قرار 20 نانومتر. الموسعة في 2D الهياكل، يقدر ديمبسي وآخرون أن من الضروري وسم ~ 104 فلوروفوريس الواحدة ميكرومتر2 . كما الشبكة إذا كان أكثر كثافة ولها خيوط أرق (10 نيوتن متر مقابل 25 نانومتر القطر دون الأجسام المضادة الأولية والثانوية) مقارنة بشبكة ميكروتوبولي، نحن لاحظ أن مرتين تعريب أكثر ضرورية لوصف الشبكة إذا. حصلنا على صور جيدة مع 5 000 تعريب/ميكرون2 إذا وتعريب 2500/µm² ميكروتوبوليس، التي تم الحصول عليها مع إطارات 40 000 وإطارات 20 000 على التوالي. وتم الحصول على الصورة بأعلى دقة بدقة ترجمة من σسملم ~ 8-12 شمال البحر الأبيض المتوسط المقدر في أعقاب الخطوة 8 من البروتوكول (الدقة التأشير لجزيء واحد مترجمة في وقت مختلف نقاط22). وكان هذا تقدير دقة الترجمة في اتفاق جيد مع القيم التي تم توفيرها من قبل الشركة المصنعة للبرنامج هو موضح في الرسم بياني للتعريب الإيضاحات المستخرجة من جميع الجزيئات تم الكشف عنها في البيانات الخام (على سبيل المثال المبين في الشكل 1). يمكن أن توفر مثل هذه الدقة التعريب صورة بدقة ~ 30 نانومتر (2.35 * الدقة) إذا كانت كثافة وضع العلامات عالية بما يكفي. لاحظنا بشكل روتيني فيمنتين خيوط ذات "عرض كامل" في نصف الحد الأقصى (فومه) ~ 40 نيوتن متر وميكروتوبوليس مع عرض فومه ~ 55 نانومتر. نظراً لدقة وضوح الصورة يعتمد على دقة الترجمة وكثافة التعريب، نوفر الظروف التجريبية التي تسمح الحصول على أفضل النتائج مع مراعاة المعيارين.
الشكل 1 : الكثافة المثلى للجزيئات واحدة أثناء تقدير الدقة اكتساب وتوطين.
(أ-ب) اليسار: الممثل صور raw من إطار واحد مع كثافة مثلى لجزيئات مفردة في مشرق الدولة (أ) ومع كثافة عالية جداً (ب) أثناء عاصفة اقتناء (الخطوة 6.12.) ثابت U373 الخلايا ملطخة فيمنتين المضادة والمناهضة الماوس Alexa647. الحق: صور raw حيث الجزيئات واحدة مع مستوى الأسفار أعلى كثافة الذروة إلى عتبة الضوضاء (تعيين 6) محاطة بدوائر (الأبيض أو الأحمر). يتم تعيين قطر دائرة بحجم قناع الذروة (مجموعة إلى 9 بكسل) واللون يحدد ما إذا كانت الجزيئات التداخل (أحمر) أو لا (أبيض). ملاحظة أن كثافة عالية من جزيئات مفردة (في (ب)) تؤدي إلى ارتفاع مقدار تداخل الجزيئات التي لا تؤخذ في الاعتبار لإعادة بناء صورة العاصفة. A داخلي: تناسب الرسم البياني عرض ملف تعريف كثافة fluorescence نموذجية من جزيء واحد باللون الأحمر وبه الضبابي باللون الأسود. في هذا المثال، يتم دقة الترجمة σس = 6.7 شمال البحر الأبيض المتوسط. تم الكشف عن مقياس بار، 1 ميكرومتر. (ج) بياني نموذجية للايضاحات التعريب لجميع الجزيئات وتحليلها من قبل الشركة المصنعة للبرنامج. فإنه يمكن تصور ويتم تحديثها بانتظام من خلال الحصول على البيانات الخام بفضل المعالجة عبر إنترنت. ويناظر هذا الرسم البياني الصورة دستورم شبكة ميكروتوبولي هو موضح في الشكل 3 (ب). (د) اليسار: ويعرض صورة عاصفة من جزيء واحد على سطح الزجاج بعد إعادة الإعمار. الحق: رسوم بيانية للمواقف X و Y التي تم الحصول عليها بعد تركيب الضبابي. غاوسي توزيعات X و Y من المناسب إعطاء تقدير لدقة الترجمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الصورة دستورم ممثل شبكة فيمنتين- الصورة (ب) صورة دستورم (A)، يقابلها معيار واسع المجال وتراكب (ج) عرض الحافة الأمامية للخلية الدبقية U373 ثابتة كما هو موضح في البروتوكول والملون فيمنتين مع Alexa647. أسفل: تكبير/تصغير للمنطقة المبرزة. (د) كثافة عرضية على طول الخط الأصفر على الصور التكبير في ألف والجدول باء بار، 2 ميكرومتر و 500 نانومتر في التكبير/التصغير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : لون مزدوج الممثل دستورم الصورة شبكات فيمنتين وميكروتوبولي. (أ) شبكة فيمنتين ملطخة Alexa647 (نفس كما في الشكل 2 أ). (ب) شبكة Microtubule المسمى مع Alexa555. (ج) تراكب فيمنتين (أحمر) وشبكات ميكروتوبولي (سماوي) مع منطقة تكبير على اليمين. تم الحصول على صورة دستورم فيمنتين مع ~1.5 مليون من تعريب خارج إطارات 40 000. تم الحصول على صورة دستورم ميكروتوبوليس مع تعريب ~ 850 000 من إطارات 20 000. مقياس بار، 2 ميكرومتر و 500 نانومتر في التكبير/التصغير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أمثلة لظروف التصوير غير الأمثل microtubules. عندما فلوروفوريس وميض لكن ليست مشرقة ما يكفي مع العلامات Alexa488 tubulin في الخلايا الدبقية U373 و 143 مم بيتاميركابتوثانول والأكسجين الكاسح في المخزن المؤقت للتصوير (A)، عندما فلوروفوريس مشرق بما يكفي ولكن لا يمكن أن يكون بشكل صحيح المنضب في الظلام الدولة (في قوة الليزر القصوى المتاحة) وطرفة ببطء مع Alexa555 المسمى توبولين في 143 مم بيتاميركابتوثانول، مم 50 شركة طيران الشرق الأوسط والأكسجين الكاسح المخزن المؤقت (ب) وعندما fluorophores الوميض ببطء وليست مشرقة باستخدام Alexa568 المسمى توبولين في عاصفة المخزن مؤقت الذي يحتوي على 143 مم بيتاميركابتوثانول، 50 مم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والكسح الأكسجين (ج)- وفي جميع هذه الحالات، قد تدهورت الصور دستورم القرار. مقياس بار، 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : صورة الممثل المزدوج-لون دستورم شبكات فيمنتين و microtubule لخلية U373 الثابتة مع الميثانول الباردة للحد الأدنى 5 (أ) شبكات microtubules فيمنتين و (ب) المسمى مع Alexa647 و Alexa555 على التوالي مع الأزيز المميز. ملاحظة وجود جزيئات مفردة في الجزء الأمامي الخلايا المترجمة في السيتوبلازم انخفاض القرار العالمي لشبكات خيوط. مقياس بار، 2 ميكرومتر و 500 نانومتر في التكبير/التصغير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : مقارنة بين دستورم بناؤها الصور
الصورة دستورم أعيد بناؤها عن طريق برنامج الشركة المصنعة (A) وعواصف رعدية (فيجي المساعد) (ب). (ج) تراكب من (أ) في أرجواني و (ب) باللون الأخضر. مقياس بار، 2 ميكرومتر و 500 نانومتر في التكبير/التصغير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في البروتوكول
نحن الحاضرين هنا بروتوكول الذي يقلل من القطع الأثرية في صور دستورم ميكروتوبوليس والاتحاد في الخلايا الدبقية. يمكن إنشاء القطع الأثرية في كل خطوة من إعداد العينة والتصوير: التثبيت، حجب، إيمونولابيلينج، الانجراف خلال اقتناء، غير أمثل الظروف وامض23. نحن قائمة أدناه الخطوات الأكثر أهمية.
التنظيف في كوفيرسليبس خطوة هامة للحد من الربط غير محددة من فلوروفوريس على السطح، وبالتالي الحد من الضوضاء الخلفية في الصورة دستورم.
ونحن نقترح تحديد العينة مع خطوة لاستخراج وتثبيت الحلول باستخدام مزيج من جلوتارالديهيدي وتريتون، ومن ثم تثبيت مع منهاج عمل بيجين (بارافورمالدهيد) (الخطوة رقم 3). تثبيت بروتوكول تم تكييفها من تشازياو et al12: نحن انخفض الوقت حضانة خطوة الاستخراج/التثبيت إلى 60 s (الخطوة 3، 4)، إزالة الجلوكوز من المخزن المؤقت سيتوسكيليتون، وتخطي الخطوة الإضافية من بيرميبيليزيشن. وميزة هذا الأسلوب أن مفارز cytoskeletal تتحرك بحرية تستنزف، السماح بتصوير القرار فائقة مع أقل الخلفية12. أعم خطوة التثبيت حاسم نظراً لتثبيت سيئة (باستخدام منهاج العمل القديمة وحلول البرد، والخطوات حضانة طويلة/قصيرة جداً) تؤدي إلى تدمير جزئي لشبكات خيوط (microtubules مكسورة، ميكروتوبوليس التي لا تصل إلى الجبهة الخلية و/أو في منخفض الكثافة). لاحظ أن من الممكن أيضا استخدام الميثانول التثبيت، خاصة إذا كان فقط يتم تصويرها الشبكة فيمنتين كما هو موضح في لوديك et al15. ومع ذلك، يمكن ملاحظة ضجيج الخلفية داخل الخلية (الشكل 5). على الرغم من أن الحصول على صور دستورم مع الميثانول ثابتة الخلايا أقل جودة، وأنها لا تزال تقدم معلومات عن كل ما إذا وشبكات ميكروتوبولي يجب أن تبدو مثل المدى من كثافة خيوط. التثبيت مع glutaraldehyde فقط أعطت نتائج سيئة للغاية للاتحاد، على الرغم من أن هذا هو البروتوكول الذي أفضل ل التثبيت ميكروتوبولي23.
في الجزء "إيمونوستينينج"، من المهم استخدام الماوس المضادة الأجسام المضادة التي تقلل كروسريكشن مع الأجسام المضادة في الفئران. نحن تعذر استخدام القوات المسلحة البوروندية شظايا (المضادة الماوس) لهذا السبب، لأنهم كروسريكت غير على وجه التحديد مع tubulin لمكافحة الفئران بالإضافة إلى الماوس المضادة-فيمنتين.
نظراً لقوة الليزر المحدودة المتاحة، من الضروري استخدام كل 488 و 561 نانومتر الليزر خطوط ضخ الأصباغ Alexa555 للدولة الظلام. من الضروري أيضا 488 ليزر عالية الطاقة (~ 50 ٪) خلال الاستحواذ على التقيد بتطرف جيدة ودورة العمل منخفضة (ينفق جزء يسير الوقت فلوروفوري في الدولة على)، على الرغم من أنه يزيد من الضوضاء الخلفية، فضلا عن. وضع الإضاءة TIRF يحد من إثارة فلوروفوريس في طبقة رقيقة (~ 200 نانومتر أعلاه ساترة زجاجية). يزيد نسبة الإشارة إلى الضوضاء بتقليل الإضاءة الخلفية، لكنه يقلل أيضا من قوة الإثارة. يسمح تمزيقها محورية الوضع حلو ويمكن أن تكون فعالة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. ومن ثم وسيط جيد بين برنامج التحصين الموسع و TIRF. استخدام وضع حلو ضروري لكفاءة تثير فلوروفوريس Alexa555، الذي يتطلب طاقة الليزر العالية وميض بشكل صحيح.
خطوة حاسمة أخرى هي الحصول على البيانات الخام (الخطوة 6). من الضروري ضبط لبارامترات (مكسب والتعرض والتركيز حتى عندما يتوفر لا جهاز كتلة التركيز، TIRF) بينما يتم الحصول على الفيلم. الاحتفاظ كثافة مثلى من fluorophores مشرق هو المهم (الشكل 1A): يجب أن يكون منخفضا بما يكفي لفصل كل صبغة، لكن عالية بما يكفي وضع تصور كامل هيكل بعد الإطارات 40 000 مكانياً. إذا كان عدد جزيئات المنشط منخفضا جداً، ينبغي الحصول على مداخن أطول. حصلنا على صور جيدة مع ~ تعريب 5000 كل µm² للاتحاد، وتعريب من 2500 كل cm ² ل microtubules.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للأسلوب
هام للعمل مع عينات جديدة ومحسنة التصوير المخازن المؤقتة. ينبغي التحديد تعديل درجة الحموضة، لا سيما بالنسبة شركة طيران الشرق الأوسط.
يجب أن تبدو فيمنتين و microtubules المسمى موحد عند تصويرها بأسلوب قياسي واسع المجال مجهرية (WF). إذا خيوط نظرة تتخللها/متقطع مع الفحص المجهري التقليدي، هذا سوف تتضاعف عند استخدام دقة فائقة. وفي هذه الحالة، فمن الأفضل تحضير عينات جديدة. قد تؤدي الظروف المحسنة لعدم التثبيت (منهاج العمل القديمة وغيرها) microtubules تبحث مجزأة. خلفية عالية على سطح الزجاج قد تنشأ من حظر عدم الكفاءة. في هذه الحالة، جيش صرب البوسنة (ألبومين المصل البقري) يمكن الاستعاضة عن FBS (الجنين المصل البقري)، والمستخدمة في كل الخطوات حضانة.
إذا كانت كثافة وضع العلامات عالية جداً (الشكل 1B) ولا يمكن أن يكون بما فيه الكفاية دفعت في الظلام قبالة-الدولة، حتى مع أعلى سلطة الليزر، مقدار الثانوية ينبغي تخفيض الأجسام المضادة (أفضل من تقليل كمية الأجسام المضادة الأولية). ومع ذلك، وهذا يتطلب إعداد عينات جديدة. وبصفة عامة، من الضروري تقييم تجريبية كمية الأجسام المضادة الثانوية لاستخدام.
إذا لم وميض fluorophores عادة (يجب أن تكون في الدولة مشرق خلال إطار واحد فقط)، تحقق من أن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت التصوير الصحيح (pH 8.3). إعداد حلول جديدة إذا استمرت المشكلة (لا سيما اتفاق بيئي متعدد الأطراف). دائماً التحقق من أن يتم صيد تلسكوب TIRF في (TIRF u_HP). مع طاقة الليزر المحدودة، الحصول على السليم وامض قد تكون صعبة (وإيقاف معدلات كذلك صبغ السطوع تعتمد على طاقة الليزر، كما هو موضح في فإن دي ينده et al.11). الأصباغ الأخرى مثل Alexa488 أو Atto488 يمكن أن تستكشف إذا كان المزيد من السلطة لليزر الإثارة هو متاح14.
إذا فلوروفوريس إيقاف الوميض قبل نهاية الإطارات 40 000، تغيير المخزن المؤقت التصوير التي قد تم تتأكسد. تحقق من وجود لا فقاعات الهواء بين المخزن المؤقت والغطاء بعد تغيير المخزن المؤقت. ويمكن تصوير العينات مختومة لبضع ساعات في الخام.
إذا تكتسب الأفلام العاصفة في مجهر TIRF عادية مزودة امككد، فمن الممكن استخدام عاصفة رعدية24 لإعادة بناء الصور. تتوفر خيارات مماثلة لتصحيح الانحراف وتصفية الصورة وعرض الصورة. عاصفة رعدية هو المساعد المستخدمة مع البرنامج فيجي/إيماجيج. تم الحصول على نتائج مماثلة مع برنامج الشركة المصنعة وعواصف رعدية (الشكل 6).
عند استخدام سرير (سيكلوكتاتيترايني) يمكن أن تضاف إلى المخزن المؤقت التصوير لتحسين دقة الترجمة جزيئات مفردة. أنه يزيد عدد الفوتونات المنبعثة لكل دورة Alexa64725. لوحظ في الواقع بأفضل دقة ترجمة (وصولاً إلى 6 نانومتر) عند إضافة 2 مم عند استخدام سرير إلى المخزن المؤقت عاصفة الموصوفة في الخطوة 5 أو مع 100 ملم اتفاق بيئي متعدد الأطراف كما هو موضح في مرجع25. ومع ذلك، يتناقص عدد جزيئات مشرقة خلال اقتناء في ظل هذه الظروف، الكثير أسرع من دون عند استخدام سرير، الحد من العدد الإجمالي لتعريب جزيء في نهاية اقتناء ويحتمل أن تؤدي إلى وكيل لأخذ عينات الشبكة إذا. المخازن المؤقتة التصوير الأخرى أفيد أن تعمل جيدا مع الأصباغ أليكسا، على سبيل المثال باستخدام اللاكتاز وأوكسيراسي كالأوكسجين مسح النظام26. في هذا البروتوكول، يمكننا تقرير تكوين المخزن المؤقت التي تعطي أفضل النتائج في مدة القرار لدينا نوع من العينات وتصوير إعداد، ولكن يتطلب كل نوع العينة الأمثل العازلة، بالإضافة إلى وضع العلامات، وتحسين شروط التثبيت.
قيود الأسلوب و التحسينات الممكنة
الطريقة المعروضة هنا يقتصر على الخلايا الثابتة وصور ثنائية الأبعاد. باستخدام معيار التصوير مجموعة حتى مع مجهر TIRF وامككد، كان عاملاً آخر يحد من صلاحيات الليزر (100 ميغاواط الليزر 561 من شمال البحر الأبيض المتوسط لم يكن كافياً لجعل الأصباغ Alexa555 الطرفة). قد يكون خط ليزر 532 نانومتر أكثر كفاءة لإثارة هذه الأصباغ. إمكانية تحسين الأسلوب الذي سيكون لأداء دستورم ثلاثي الأبعاد باستخدام الاستجماتيزم الضوئية27. وهذا يتطلب الحد الأدنى من التعديلات للبروتوكول، باستثناء أقل كثافة التوسيم وعدد زيادة إطار. اللون المزدوج 3D صورة العاصفة سيقدم عرض أفضل للاتحاد ملفوفة حول microtubules، لا سيما في حزم. لاحظ أن خيوط الأكتين يمكن أيضا أن استخدام نفس أسلوب التثبيت ومبلغ أمثل فالويدين نيون8. ويمكن استخدام لون 3 العاصفة لمراقبة المنظمة من ثلاثة أنظمة فرعية cytoskeletal.
استخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية يزيد من حجم موضع اهتمام منذ جسم الثانوي يتم ترجمة ما يصل إلى 20 نيوتن متر من الهدف. عادة، سوف يكون microtubule قطرها 25-شمال البحر الأبيض المتوسط عرض ~ 50 نانومتر بعد وضع العلامات. إحدى الإمكانيات لتحسين المسافة بين الهدف والصبغة تسمية الأجسام المضادة الأولية مع الأصباغ المناسبة مباشرة. ومن الناحية المثالية ينبغي nanobodies المسمى بالأصباغ العضوية المستخدمة28.
نحن نقدم هنا مجرد طريقة بسيطة لتقدير دقة الترجمة متوسط جزيء واحد عقب انديسفيلدير et al22. حل شامل للصور التي تأخذ في الاعتبار كل دقة الترجمة ووصفها بكثافة، ويمكن أيضا قياس استخدام نهج "فورييه خاتم الارتباط"29.
وفيما يتعلق بتسجيل القناة، من الصعب تراكب تماما جميع الخرز الحالية في مجال الرؤية. يمكن العثور على تصحيح أكثر تعقيداً في كازو et al 12.
يمكن التغلب على القيود الناشئة عن تطرف من فلوروفوريس وتبيض التحقيقات باستخدام الحمض النووي--الطلاء (تراكم النقاط الحمض النووي للتصوير في تضاريس النانو)30. في هذا الأسلوب، يتم إنشاء الوميض اللازمة للتعريب جزيء واحد ملزمة عابرة من النوكليوتيد قصيرة-صبغ-المسمى بأهدافها مكملة.
الاستنتاج
تعرض هذه المقالة بروتوكول قوية للقيام بتصوير دستورم اللون المزدوج في بعدين من خيوط سيتوسكيليتال في الخلايا الثابتة. الظروف التجريبية التي تم العثور عليها الأمثل من حيث المخزن المؤقت التثبيت، إيمونولابيلينج، وتصوير لنوع العينة لدينا موصوفة في التفاصيل. ثم، في عملية الحصول على البيانات الخام ونوع الصور وامض التي يجب أن تكون مسجلة (دورة جزيء الكثافة، إشارة إلى نسبة الضوضاء، واجب fluorophore إلخ) يرد فضلا عن كيفية إعادة بناء الصور دستورم، وتصحيح الانحراف وتصفية البيانات. هذه الخطوات هي عامة لتصوير ثنائي اللون دستورم وعينه غير محددة النوع. أخيرا، فإنه يظهر كيف يساعد هذا الأسلوب على حل المنظمة كثيفة من شبكتين cytoskeletal المقرونة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر ليليك ميكائيل، فاكلاريس أوريستيس ونيكولا بورغ لمناقشة مثمرة، أندري اريستوف وايلينا رينسين للحصول على مساعدة تقنية فائقة القرار وسيتارامان شيلاجا للقراءة المتأنية للمخطوطة. ونعترف مع الامتنان ستيش أوتيتشس بيويماجينج الضوئية (إيماجوبولي) من معهد باستور (باريس، فرنسا)، فضلا عن شبكة البنية التحتية بيويماجينج فرنسا تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينسب-04؛ الاستثمارات في المستقبل)، والقارسة ضمور (برنامج Domaine د ' الاهتمام القاهرة-مالينف) لاستخدام المجهر اليرا. أيد هذا العمل مكافحة السرطان الرابطة والوكالة الفرنسية للبحوث الوطنية (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al.
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
