Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57087
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

Summary

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için vermektir

Abstract

Aktin microfilaments, mikrotübüller ve ara filamentler (Eğer), oluşan sitoiskeleti hücre şekil, polarizasyon ve motilite kontrol önemli bir rol oynar. Aktin ve Mikrotubul ağları organizasyonu kapsamlı eğitim gördü ama bu IFS değil henüz tam olarak karakterize edilir. IFS hücre sitoplazma uzanan bir ağda bir ortalama çapı 10 nm ve formu vardır. Onlar fiziksel olarak aktin ve mikrotübüller moleküler motorlar ve hücre iskeleti halkalı ile ilişkilidir. Bu sıkı ilişki çoğu hücre fonksiyonları için gerekli üç hücre iskeleti ağ koordine Yönetmeliği sağlamak düzenleyici mekanizmaları kalbinde olduğunu. Bu nedenle IFS yalnız ve aynı zamanda ağların her biri diğer hücre iskeleti ile birlikte görselleştirmek önemlidir. Ancak, eğer ağlar, birçok hücre türü, özellikle gliyal hücreler, içinde son derece yoğun çözünürlüğü standart floresan mikroskobu ile ulaşmak çok zor kılan (lateral Görüntü çözünürlüğünün ~ 250 nm). Doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (dSTORM) bir kazanç bir büyüklük yanal çözünürlük sağlayan bir tekniktir. İşte, lateral dSTORM çözünürlüğü yoğun organizasyon Eğer ağlar ve özellikle, eğer demetleri mikrotübüller çevreleyen gidermek için yeterli olduğunu göstermektedir. Böyle sıkı dernek bu iki ağ ve Mayıs koordine yönetmelikte katılmak, açıklamak olasıdır nasıl vimentin IFS şablon Mikrotubul organizasyon stabilize ve Mikrotubul bağımlı veziküler kaçakçılığı etkileyebilir. Daha genel olarak, biz nasıl iki hücre iskeleti bileşeni çift renkli dSTORM tekniği ile gözlenmesi karşılıklı etkileşimlerini içine yeni bir bakış açısı getiriyor gösterir.

Introduction

Sitoplazmik ara filamentler (IFS) 10 nm-çapı homo - ya da eğer proteinlerin hücre türü belirli alt heteropolymers vardır. IFS çok sayıda hücre hareketliliği, yayılmasını önleme ve stres yanıt gibi hücresel işlevler katılmak. Onların önemli rol ile 90'dan fazla insan hastalıkları doğrudan Eğer proteinlerde mutasyonlar neden aslında vurgulanır; Örneğin, eğer bileşiminde değişiklikler tümör büyüme ve1,2,3yayılan eşlik eder. İşbirliği-e doğru kontrol hücresel fonksiyonları hücre polarizasyon, bölünme ve geçiş2,3gibi üç sitoiskeleti sistemi çalışmalarında kanıt orada büyüyor. Kayma mimarisi ve işlevler arasında sıkı bir bağlantı olduğundan, bu anlayışı ile diğer filamentler Eğer yapısal organizasyonu içine alın ve hücre iskeleti çapraz-hadis daha iyi anlamak çok önemlidir. Bu makalede süper çözünürlük tekniği çift renkli dSTORM (doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu)4 ve arasındaki etkileşimi araştırmak için nasıl kullanıldığına ve mikrotübüller gerçekleştirmek için bir protokol sağlar sabit, kültürlü hücreler 2 boyutlu (2D).

Geçtiğimiz birkaç süper çözümleme teknikleri geliştirilmiştir on yıl ve orada keşifler Nobel Kimya Ödülü kökeni 20145idi. Tüm bu tekniklerin arasında tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri kullanan photoswitchable floresan proteinler, PALM gibi6 (Photo-Activated yerelleştirme mikroskobu) fırtına7 fluorophores veya dSTORM4 çift ile yatıyor geleneksel fluorophores ile. Tüm bu yöntemler (i) anahtarı floresan gazetecilere çoğunun "kapalı" bir duruma oluşan aynı ilkeye dayanır"(non-floresan), (II) bir alt kümesini bir floresan içine Stokastik aktivasyonu devlet yerelleştirmek için onların uzamsal konumu nanometre doğruluk ve (III) fluorophores mümkün olduğunca çok sayıda alt kümeleri etkinleştirmek için bu işlem tekrarı. Son görüntü etkin moleküllerin ~ 20-40 yanal çözünürlük sağlayan tüm yerelleştirmeler kullanarak yeniden düzenlenir nm. Birkaç ticari optik sistemleri PALM/fırtına izin şimdi biyologlar rutin deneyler için kullanılabilir. Burada, böyle bir sistem mikrotübüller ve IFS yapısal Derneği Eğitim için kullanıldı. Çok ince lamel bölgeleri gözlemlemek için de uygundur çünkü tüm tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri arasında çift renkli dSTORM tekniği, seçildi (< 1 µm) yapisan hücre ve görüntü çözünürlüğü ile önemli gelişme sağlayabilir en az zaman ve para yatırım. Gerçekten de, dSTORM hücresel boyama ve ayirt için rutin olarak kullanılan standart organik Boyar maddeler ile uyumlu bir çok uygun ve çok yönlü bir tekniktir.

Bir renk dSTORM görüntüleri fluorophore Alexa6478kullanarak elde etmek nispeten basit olmakla birlikte, özellikle ne zaman var sınırlı iki boya düzgün seçilmiş arabellekte yanıp böylece deneysel koşullar optimize etmek için çift renk dSTORM gerektirir lazer güç. Mükemmel kağıtları zaten yöntemlerde çok renkli görüntüleme dSTORM9,10,11,12,13ile ayarlamak için kullanılabilir ve bu belgeleri açıklamak içinde ayrıntı olası kaynakları eser ve bozulmuş görüntü çözünürlüğü yanı sıra nasıl bunların üstesinden. Bu makalede, en iyi deneysel koşullar açısından hücreleri fiksasyon, immunostaining, numune hazırlama, görüntüleme edinme ve görüntü yeniden yapılanma yoğun sitoplazmik Eğer ağlar ve mikrotübüller içinde görüntüleri elde etmek için açıklanmıştır Çift renkli dSTORM gliyal hücrelerle. Kısaca, Chazeau ve ark12 ' açıklanan çıkarma/fiksasyon yöntemi gliyal hücreler için adapte oldu ve sonrası fiksasyon adım ile en iyi duruma getirilmiş antikorlar konsantrasyon kullanılan, 10 mM ile bir fırtına tampon MEA Dempsey9 oldu vd. tarif örnek türü ve deneysel kurmak için en uygun bulunmuştur.

Gliyal hücreler esas olarak hızlı Eğer proteinlerin üç türü: vimentin, testin ve GFAP'nin (gliyal asidik fibrillary protein). Bu üç proteinler astrocytes14' te ortak polimerize gösterilmiştir. Biz daha önce yapılandırılmış süper çözünürlük aydınlatma mikroskobu (SR SIM) bu üç Eğer proteinler aynı tek Eğer filaman içinde bulunabilir ve bunlar gliyal hücreler 15dakika içinde benzer dağıtım ve dinamik görüntüler gösterdi. Üç Eğer proteinler arasındaki benzerlikleri nedeniyle vimentin boyama tüm Eğer ağ için muhabir olarak kullanıldı. DSTORM kullanarak, biz nasıl eğer form demetleri kırınım ile mümkün değildi mikrotübüller boyunca mikroskobu teknikleri15sınırlı gidermek başardı. Bu gözlemler vimentin IFS şablon mikrotübüller nasıl anlayabilirim ve hücre göç16sırasında bir polarizasyon ekseni bakım teşvik onların büyüme yörünge düzenleyen yardımcı olabilir. Süper çözünürlük fotoğraf anahtar bilgileri iki hücre iskeleti alt sistemlerin karşılıklı etkileşimi üzerinde sağlanan ve kayma Derneği ve hücre tipi belirli17olabilir yerel işlev arasındaki bağlantıyı bir anlayış getirdi. Genel olarak, iyi immunostaining koşulları yoğunluğu ve özgüllük açısından ulaşmış olması koşuluyla çift renkli dSTORM hücre iskeleti elemanları veya organelleri, diğer türleri arasında çapraz karışma eğitim için kullanılabilir. Bu teknik daha iyi astrogliosis sırasında ve glioblastoma sitoiskeleti değişiklikleri tanımlamak yararlı olacak, burada eğer proteinlerin deyimidir merkez sinir sisteminin en yaygın ve en kötü huylu tümör 18 değişmiş ,19,20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips hazırlık (gün 1, 30 dk)

  1. 18-mm nº1.5H (+/-5µm 170 µm) cam coverslips plastik bir rafa yerleştirin.
  2. Aseton ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL ölçek rafa koymak.
  3. Raf mutlak etanol ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL kabı aktarın.
  4. Ultrasonik temizleyici cihazda kabı yerleştirin ve raf mutlak etanol ile dolu yeni bir 100 mL kabı transfer (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında. "Tarih" basın ve 10 min için bekleyin.
  5. Laminar akış başlık altında rafa koymak ve kuru veya filtre uygulanmış hava akımı ile coverslips kuru coverslips yapalım.
  6. Coverslips ile raf bir plazma temizleyici cihazı yerleştirdim. Vakum pompası üzerinde geçiş, kapıyı kapat, vakum yapmak ve kısa bir süre sonra temizlendikten sonra plazma 1 dk. kullanım coverslips geçiş için 3 dakika bekleyin. Onları saklamak değil.

2. hücre kaplama (gün 1, 20 dk)

  1. Gliyal hücre kültürünü U373 içinde en az gerekli orta (MEM) % 10 Fetal sığır Serum, %1 penisilin-streptomisin ve % 1 gerekli olmayan amino asit ile 10 cm Çap plastik kabında büyümek.
  2. 12-şey plakaları laminar akış başlık altında temiz cam coverslips yerleştirin ve Önceden ısıtılmış cep orta iyi başına 1 mL ekleyin.
  3. Hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) hücreleri içeren bir tabak al.
  4. Orta kaldırın ve 10 mL PBS ekleyin.
  5. PBS kaldırın ve 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA.
  6. Kuluçka makinesi 2-3 dakika içinde geri çanak yerleştirin.
  7. Yemek olarak 37 ° C'de ısıtılmış sıcak orta 10 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.
  8. Coverslips içeren 12-şey tabak (hücre ~ 150 µL) kuyuya başına tohum yaklaşık 100 000 hücre.
  9. En az 6 h (ya da bir gecede) hücre yayılmasını sağlamak bekleyin.

3. hücre fiksasyon (2 gün, 2 saat)

  1. 80 mM borular, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, sitoiskeleti önbellekle hazırlamak ve pH 6,9 için ayarlayın.
  2. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
  3. PBS kaldır ve yavaşça çıkarma/fiksasyon çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin (%0.25 oxazolidin, % 0.3 Triton X-100 sitoiskeleti arabelleği) 37 ° C'de ısıtılmış
  4. 60 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında.
  5. Çözümü kaldır ve yavaşça sitoiskeleti arabellekte seyreltilmiş Önceden ısıtılmış ve taze hazırlanmış %4 PFA (paraformaldehyde) çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin.
    Uyarı: Kimyasal başlık altında iş ve eldiven kullanabilirsiniz.
  6. 12-şey plaka da kuluçka 37 ° C'de 10 dakika geri koyun.
  7. PFA kaldırın ve PBS 3 mL iyi başına ekleyin.
    Not: Eldiven ile kimyasal başlık altında iş ve geri dönüşümlü PFA belirli bir depo gözünde koymak.
  8. İki kez PBS ile yıkayın.
  9. PBS kaldırın ve oxazolidin gelen autofluorescence gidermek için PBS içinde seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 mM NaBH4 çözüm ekleyin.
  10. Oda sıcaklığında 7 min için kuluçkaya.
  11. Geri dönüşümlü NaBH4 belirli bir depo gözünde koymak.
  12. Üç kez 5 dk PBS ile yıkayın.
  13. PBS kaldırın ve engelleme çözüm (PBS içinde %5 BSA çözelti) ekleyin.
  14. Oda sıcaklığında (veya gecede 4 ° C'de) 1 h için kuluçkaya.
    Not: Sitoiskeleti arabellek oda sıcaklığında birkaç ay depolanabilir. İngiltere'de yılın, NaBH4 ve oxazolidin özel bakım (başlık, eldiven ve belirli geri dönüşüm kutuları) ile ele alınmalıdır. Çözümler eklenir ve yavaşça hücrelerin bütünlüğünü korumak için kaldırıldı. Kuru hücreleri izin önemlidir.

4. Immunostaining (gün 2, 5h)

  1. Birincil antikorlar anti-vimentin ve anti-tübülin 1:500 seyreltme engelleme çözümde bulunan kullanılarak çözüm hazırlamak.
  2. Seyreltilmiş birincil antikorlar 100 µL damla parafin film tabakası üzerinde koymak ve onları üstüne coverslips hücrelerle aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
  3. 2 h. PBS ile coverslips geri bir 12-şey tabak içinde dolu koymak için birincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez.
  4. Bu arada, ikincil antikorlar çözüm engelleme çözümde bir 1:1, 000 seyreltme adlı Anti-fare Alexa647 ve anti-sıçan Alexa555 kullanarak hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. 4.2 gibi devam edin. hücrelerin ışıktan korunması.
  5. Coverslip geri PBS ile dolu bir 12-şey plaka koymak. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez. PBS kaldırmak ve 0.5 mL 0,1 µm tetraspeck boncuk 1 µL ile karışık PBS ekleyin.
  6. Wells bir orbital Çalkalayıcı 30 dk. durulama PBS ile koymak. PBS kaldırmak ve hücreleri bir % 4 İngiltere'de yılın çözümde PBS ile 5 min için kuluçkaya. Üç kez PBS durulayın.
    Not: Birkaç hafta içinde PBS 4 ° C'de sabit hücreleri saklanabilir Immunostaining son anda yapılmalıdır.

5. numune hazırlama (gün 3, 5 dk)

  1. Aliquots MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glikoz oksidaz (100 x, 50 mg/mL), katalaz (500 x, 20 mg/mL) bir buz sepete koy.
  2. Tris-NaCl arabelleği 50 mL hazırlamak (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) glikoz (100 mg/mL) % 10'u ile desteklenmiştir.
  3. Arabellek hemen önce 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glikoz oksidaz, 40 µg/mL katalaz (80-200 U/mL) ile görüntülemede görüntüleme 1.2 mL % 10 glikoz Tris-NaCl önbellekle hazırlayın.
  4. Manyetik örnek kutusunda (örneğin chamlide odası) etiketli hücreleri içeren coverslip dağ ve tamamen odası doldurmak için görüntüleme tampon ekleyin. Kapak koyun ve hiçbir hava kabarcığı görüntüleme arabellek ve kapak arasında olduğundan emin olun.
  5. Mutlak etanol ile örnek alt temiz ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Düzgün gerekirse örnek sahibi imzalamaya yağ kullanın.
    Not: MEA çözüm (HCl kullanarak ayarlanır pH 8.3), glikoz oksidaz 50 mg/mL, hisse senedi ve katalaz, 20 mg/mL su stokunun 1 M stok hazırlamak, aliquots yapmak ve bana ve glikoz oksidaz ve katalaz için bir yıl için bir ay için-20 ° C'de depolayabilirsiniz. Aliquots refreeze değil. Tris-NaCl arabellek önceden hazırlamak ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın. Glikoz deney (Adım 5.3) günü ekleyin.

6. resim alma (3. gün, ~ 1h hücre başına)

  1. Mikroskobunun geçin. Satın alma yazılımı geçin ve sistem Starttuşuna basın.
  2. Satın alma sekmesini genişletme Imaging kurulum aracı Kur Yöneticisi aracını grubunda seçin. Satın alma lazer WF (geniş alan) modunu seçin. 100 X NA 1.46 hedefi seçin. Aydınlatılmış görüş alanı azaltmak için bir kolimatör kullandığı TIRF u-HP modunu seçin ve lazer enerji daha küçük bir alanına konsantre. 100nm piksel boyutunu verir optovar 1.6 x objektif kullanın.
  3. Saat serisi aracını seçin ve zaman atlamalı 50 000 çerçeveler ve çerçeveler arasında 0.0 ms ayarlayın. Kanalları aracını edinme parametre araç grubunda genişletin ve "Tümünü göster" seçin.
  4. Alexa647 parça ayarla: 642 ve 405 lazer uyarma hatlarında ve bunları açmak için kabul kontrol edin. "655 LP" emisyon filtre Görüntüleme kurulumuseçin. "647" yeniden adlandırın.
  5. Tıklayın '+' kanalları aracı başka bir ışık geçişi eklemek ve modu seçin "makas her: çerçeve" Imaging kurulum aracında. 561, 488 ve 405 lazer satırları kontrol edin ve bunları açmak için kabul edin. Seçin "BP 570-650 + LP750" emisyon filtre ve kullanma optovar lens 1.6 x. TIRF-uHP modu işaretli olup olmadığını denetleyin. Parça "555" yeniden adlandırın.
  6. Toplama modu aracını seçin ve çerçeve boyutu 200 x 200 piksel olarak ayarlayın. Odak aygıtlar ve strateji aracını seçin ve (Eğer bir odak kilidi sistemi) 1.000 kişi karelere kesin odağı ayarlayın.
  7. Petrol hedefte ve örnek koydu. Yerleştirme sekmesini seçin ve floresan lamba çekim açın. Odağı bulmak ve hücrenin mercek kullanarak görüntüye bakın. Joystick kullanarak görüş alanı ortasına koymak.
  8. Geri alma moduna gitmek için satın alma sekmesini seçin. "647" dersi seçin, 642-lazer güç %0,2 olarak ayarlarsanız, 405-lazer güç 0 olarak ayarlayın, pozlama süresi 50 ms ve 50 kazanç için ayarla. Hücrenin üstünde belgili tanımlık perde gözlemlemek için sürekli Alım modunu seçin. Odağı ayarlayın. Görüş alanı içinde en az bir tetraspeck boncuk olduğundan emin olun, gerekirse görmek için kontrastı arttırmak. Bir Otomatik ölçek modu için kullanın. Snap tıklatarak vimentin ağ geniş alanlı epifluorescence görüntüsünü almak ve kaydedin. TIRF aydınlatma kontrol etmek için TIRF üzerinde tıklatın, aydınlatma ve/veya Kolimatör açısını aydınlatma homojen bir alanınız ve kaydetmek ayarlayın.
    Not: TIRF ve epifluorescent görüntüleri raw veri toplama başlamadan önce kaliteli olmalarını önemlidir. İş öğelerinin sürekli olmayan, non-birörnek etiketli filamentler neden kalitesiz dSTORM resimlere olmaktadır.
  9. "647" parça işaretini kaldırın ve seçin ve "555" parça. Mikrotubul ağ epifluorescence görüntüsünü alın ve kaydedin. TIRF görüntü çekmek ve çok kaydedin.
  10. "555" parça işaretini kaldırın, seçin ve "647" parça kontrol ardından süreklibasın. Kazanç 0 olarak koymak ve pozlama süresi 10 Bayan için 642-nm lazer güç Alexa647 boyalar en karanlık durum (~ 2 kW/cm2) pompa için % 100'e ayarlayın. Yanıp sönen fluorophores başladıktan sonra 15 ms maruz koymak ve 300 için kazanç. Aydınlatma TIRF modunu seçin. Olmadan otomatik ölçek aralığı gösterge modu tek molekül sinyalleri (kırmızı renkle gösterilir) kamera emdirmek değil doğrulamak için kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazanç azaltın. Tetraspeck boncuk satın başında doymuş kalacaktır. Hücre sürekli gözlem durdurmak için Dur tuşuna basın.
  11. Online işleme Aracı'nı genişletin ve fırtına görüntü alma sırasında görselleştirmek için PALM işleme Online kontrol edin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: 9 için en yüksek maskesi boyutu (9 piksel çapı) ve en yüksek yoğunluk gürültü için 6. Tezler parametreleri (örtüşen yeterince parlak ve değil) işleme dikkate alınıp molekülleri tanımlayabilirsiniz. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafikve çubuk grafik kaynak: hassas. Satın alma Başlattuşuna basın.
  12. Satın alma sırasında gerekirse (hiçbir odak kilidi aygıt varsa) yönlendirmesi. (Pozlama, lazer gücü) parametrelerini ayarlamak ve sonunda (%0,001 fluorophores bir Orta yoğunluk 1 µm tek molekül arasında en az bir mesafe ile tutmaya başlayan) 405 nm lazer çizgi geçiş (> 9 piksel 100 nm, tepe maskesi boy) ( Şekil 1A-B). Molekül yoğunluğu biraz çok yüksek ise, TIRF yerine aydınlatma HILO (son derece eğimli ve lamine optik levha) modunu kullanın. Bu lazer güç % 20 oranında artacak. Yeniden oluşturulan resmi aşağıda histogramı yerelleştirme hassas zirvesine çevresinde veya altında 10 ortalanır emin olun nm.
    Not: Genellikle zamanla molekülleri sayısını azaltır ve 405 nm lazer gücü yavaş yavaş buna göre artar. Yerelleştirme duyarlık (süper çözümleme görüntüsünün altında görüntülenen çubuk grafik) altında 10 bir tepe ile mümkün olduğu kadar azaltmak için hedeftir nm (şekil 1 c). Gerekirse, çok fazla parlak boncuk alanında varsa PALM resmin zıtlığını artırın.
  13. 10'dan fazla6 yerelleştirmeler (genellikle 40 000 kare sonra) ulaştığında film durdurmak için Dur tuşuna basın. Lazerler %0,2 geri koymak (642 nm) ve 0 (405 nm). Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Parça "647" kanalları aracında, işaretini kaldırın ve seçin ve parça "555".
  14. Pozlama süresi için 25 ms ayarlayın ve 0'a kazanç. Sürekli düğmesine basın ve pompa Alexa555 boyalar karanlık durumuna (~ 2 kW/cm2 her) için % 100 488 ve 561 lazerler ayarla. Yanıp sönen, kazanç 250 için koymak fluorophores başladıktan sonra HILO aydınlatma modu kullanın ve tek molekülleri kameranın ölçüm göstergesi modu ile emdirmek değil olduğunu kontrol edin. Bu durumda, kazanç azaltın. Durtuşuna basın. 488-lazer gücü % 50 azaltmak.
  15. Satın alma Başlattuşuna basın. Satın alma sırasında giderek her zaman doygunluk limitte olmak kazanç artırın. Adım adım tek molekül bir Orta yoğunluk görüş alanı içinde (bkz: adım 6,18) tutmak için 405 nm lazer gücünü arttırın. 405 lazer 15 daha yüksek olduğunda % 20-30 488 lazer gücü azaltın. Sonra yavaş yavaş 488 molekülleri mümkün olduğunca hızlı yanıp sönen tutmak için 405 lazer çizgi artırırken azaltın. 405 lazer çizgi sadece üzerinde oranını artırır, ancak maksimum yoğunluk, 561 uyarma lazer ile birleştiğinde 488 lazer çizgi hem açık hem de kapalı fluorophores oranda artırır.
  16. Yok daha fazla molekül yanıp fazla 500 000 yerelleştirmeler (yaklaşık 20 000 kare sonra) ulaştığında satın alma ya da daha fazla durdurur. Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin.
    Not: Her zaman diğer renkler (veya etkinleştirme) ağartma önlemek için daha yüksek dalga boyu ile başlar. Chamlide odası kapalı değil beri görüntüleme arabelleğin düzenli olarak, örneğin değiştirmek mümkündür farklı tampon koşullarda test etmek için. Alexa 555 boyalar tüketmek için 488 lazer çizgi kullanarak yalnızca 561 lazer güç (100 mW lazer ile) sınırlı olduğunda gereklidir.

7. resim yeniden yapılanma (5 dk)

  1. PAL-Drift Aracı'nda, 8 en fazla olacak boyutunu ile otomatik parçalarla modeli tabanlı düzeltme türünü kullanın. Drift düzeltilene kadar Uygula birkaç kez üst üste basın. Bu modeli tabanlı düzeltme drift düzeltir çapraz korelasyon analizi üzerinde alan bir algoritma uygular.
  2. PAL-filtresi araçlarını kullanarak, fırtına görüntünün görünümünü hangi en iyi lokalize molekülleri seçerek geliştirin. Örneğin, 30 Yerelleştirme kesinlik sınırı nm ve 120-180 nm için PSF.
  3. Piksel çözünürlüğe sahip 5 veya 10 nm PAL-render aracın yanı sıra bir Gauss görüntüleme modu, bir genişleme faktörü 1 seçin PSF Render auto dinamik alan HR %95 değeri ve Render auto dinamik alan SWF %90 değeri ile kullanın. Render en iyi Kalite'yi seçtiğinizde.
  4. PALM dönüştürmek, işleme sekmesi (son işlem modu) PALM menüsünden seçin. Seçin ve ardından Uygulatuşuna basın. Oluşturulan görüntü ile bir biçimde kaydedin. LSM (ve değil .czi, çok önemli).
    Not: Görüntü yeniden hemen satın alma veya sonraki satın alma yazılımı görüntü işleme modunu kullanarak sonra gerçekleştirilebilir. İşlem modu sonrası kapalı hattında yığınlar parametreleri (en yüksek maskesi boyutu, gürültü en yüksek yoğunluk) farklı değerlerle yeniden Çözümle mümkündür. Her zaman "örtüşen molekülleri atmak" ve "yerelleştirme önce ortalama değil" seçin.

8. bir fırtına görüntü (10 dakika) yerelleştirme duyarlığını tahmini

  1. Fırtına ham veri açın ve görüntü işleme sekmesini PALM yöntem ve sonra PALM tekrar kullanın. Seçtuşuna basın.
  2. 9 ve 6 (veya görüntü için seçtiğiniz parametreleri) gürültü için en yüksek yoğunluk en yüksek maskesi boyutunu kullanarak yeniden başlatmak için Uygula tuşuna basın.
  3. Dikdörtgen grafik aracını seçin ve raw görüntü tek bir molekül cam yüzeyinde mevcut çevresinde bir dikdörtgen çizin. Genellikle bir kaç tek molekülleri orada vardır.
  4. Basın Uygula tekrar ve yalnızca dikdörtgen bölgesini içine mevcut molekülleri incelenecek.
  5. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafik ve çubuk grafik kaynak: X pozisyon ya da pozisyon histogramlar görselleştirmek için Y konumu.
  6. Görüntüleri aşağıda solda yerelleştirmeler listesi ile tabloyu kaydedin.
  7. Veri analizi, bir yazılım kullanarak oluşturmak histogramlar x ve Y konumları (şekil 1 d).
  8. Dağıtımları bir Gauss tarafından uygun ve σX ve σY değerlerini kaydedin. Yerelleştirme hassas σSMLM (σX *σ tarafındanY) tahmini ^ 0,5.
  9. Mümkün olduğunca çok sayıda molekülleri üzerinde 8.3-8.8 adımı yineleyin ve σSMLM ortalama

9. kanal kayıt (5 dk)

  1. Fiji (görüntü J) yazılımını kullanarak her renkte fırtına görüntüyü açın.
  2. Her tetraspeck boncuk konumlarını ölçmek için Değnek aracını seçin.
  3. Her boncuk X ve Y tıklatınÇağrı hesaplamak ve onları ortalama.
  4. İkinci görüntü ile hesaplanan çevirmek için "Tercüme" komutunu kullanın X ve Y vardiya.
  5. Kanalları Birleştir komutunu kullanarak iki resim birleştirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroskop 512 x 512 kamera, bir alfa planı Apo 100 X 50 mW 405 nm ve 100 mW 488, 561 ve 642 nm katı hal lazerleri, bir EMCCD ile donatılmış / 1,46 objektif ve grubu 570-650 Pass / uzun 655 emisyon filtreler geçiş temsilcisi sonuçları aşağıda sunulan için kullanıldı.

Şekil 1A raw resim alma sırasında kullanılması gereken gürültü oranı sinyal ve molekül yoğunluğu bir örnek verir. İyi kalitedeki görüntüler ~ 1 µm komşu molekül arasında en az ile elde edilir. İyi yanıp sönen şartlarda fluorophores tek bir çerçeve içinde bulunması gerekir. Görüntüleme arabellek koşulları (pH, indirgeyici Ajan, oksijen sistemi atma) ayarlamak için iyi yanıp sönen gerektirir ve üzerinde - ve off-oranları fluorophores ve bu nedenle görevi etkisi lazer gücü (kesir bir fluorophore içinde geçirdiği zaman döngüsü duruma)9,11. Şekil 1B, aksine, burada molekül yoğunluğu çok yüksek ve tek molekül çözümlenemeyen raw görüntü bir örnek verir.

Şekil 1 c yerelleştirme precisions tespit ve bir yığın 20 000 kare üretici yazılımından tarafından analiz tüm molekülleri için tipik bir histogramını gösterir. Bu çubuk grafik şekil 3B' gösterilen Mikrotubul ağ dSTORM görüntüsünü karşılık gelir. İyi anlaşma ile farklı zaman Puan22 , (şekil 1 d) Lokalize tek bir molekül işaretleme duyarlığını kullanarak değerleri tahmini aşağıdaki adım 8, yerelleştirme precisions üretici yazılımı tarafından sağlanan değerleri vardır.

Şekil 2A vimentin filamentler immunolabeled Alexa647 ile dSTORM görüntüsünü tipik bir örneği gösterir. Çözünürlük artışı standart geniş alanlı mikroskopla (şekil 2B-C) elde görüntüsü ile karşılaştırma üzerinde açıkça görülebilir. Süper kararlılık mikroskobu düşsel vimentin demetleri çözme sağlayan şekil 2B olarak temsil floresan yoğunluğu profilleri göster. DSTORM çözümü filamentler demetleri mevcut sayısını saymak yeterlidir.

Şekil 3 sırasıyla Alexa647 ve Alexa555 ile vimentin ve tübülin ağlar immunolabeled görüntüsünü çift renkli dSTORM tipik bir örneği gösterir. İki ağ yerleşimi vimentin demetleri kez mikrotübüller, önemli yapısal bilgileri iki sitoiskeleti alt sistemler arasında bağlantı sağlayan boyunca lokalize gösterir.

Şekil 4 dSTORM mikrotübüller uygun olmayan koşullarda elde edilen görüntülerin çeşitli örnekler gösterilmektedir. İlk olarak, Alexa488 ve bir arabellek kullanarak 143 mM beta-mercaptoethanol (MEA9,10,11yerine kullanılan başka bir indirgeyici Ajan) ve (0,5 mg/mL glikoz oksidaz ve 40 µg/mL oluşan bir oksijen atma sistemi katalaz), fluorophores yanıp sönen vardı ama tam olarak yerelleştirilmiş (çok düşük foton) olmak parlak değildi (şekil 4A). İkinci olarak, Alexa555 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA ve sistem atma bir oksijen ile kullanarak, fluorophores karanlık durumlarına geri pompalanır değil ve bu nedenle de dağınık şekilde olamaz (çok yüksek iş hacmi, yani zaman kısmını "açık" durumda ayrılmış çok uzundur) (şekil 4B). Son olarak, Alexa568, 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA ve sistem atma bir oksijen ile kullanarak, fluorophores parlak değildi ve yavaş yavaş ile çok uzun "Tarih" ve "off" devletler (düşük foton sayı ve çok yüksek iş hacmi) yanıp sönen edildi (şekil 4 c). Tüm bu uygun olmayan koşullar içinde Mikrotubul ağ kötü süper çözünürlük fotoğraf hale oldu. Sonuç olarak, fluorophores yüksek foton numarası ile optimal koşullar gerektirir ve düşük görev döngüsü içinde karşılık gelen görüntüleme tampon9,10 . En iyi duruma getirme yoğunluğu etiketleme ve tampon koşulları iyi yanıp sönen koşulları elde etmek için düşsel çift renkli dSTORM için standart bir uygulamadır ve eğer Mikrotubul görüntüleme için spesifik değildir unutmayın.

Nyquist-Shannon teoremi göre en az her 10 fluorophores sahibi olmak gereklidir nm 20 çözünürlüğe sahiptir nm. 2D yapıları için genişletilmiş, Dempsey ve ark ~ 104 fluorophores µm2 başına etiketlerine göre gerekli olduğunu tahmin. Olarak Eğer ağ daha yoğun ve daha ince (10 nm vs 25 nm çapında olmadan birincil ve ikincil antikorları) karşılaştırmak-e doğru Mikrotubul ağ onun filamentler, iki kez daha fazla yerelleştirmeler Eğer ağı açıklamak gerekli görülmektedir. Biz 5 000 yerelleştirmeler/µm2 If ve mikrotübüller, 40 000 çerçeveler ve 20 000 çerçeveler ile sırasıyla elde için 2500 yerelleştirmeler/µm² ile iyi görüntüler elde. Yüksek çözünürlüklü görüntü σSMLM yerelleştirme hassasiyetle elde edildi ~ 8-12 nm tahmini (işaret eden başka zaman lokalize tek bir molekül duyarlığını Puan22) protokolünün adım 8. Bu tahmini yerelleştirme duyarlık iyi anlaşmada yerelleştirme precisions ham veri ( şekil 1 ciçinde gösterilen örnek) tüm algılanan molekülleri çıkarılan histogramını gösterilen Üretici yazılım tarafından sağlanan değerleri ile oldu. Böyle yerelleştirme hassas ~ 30 çözünürlüğe sahip bir resim verebilir nm (2,35 * hassas) etiketleme yoğunluğu yeterince yüksek ise. Biz düzenli olarak tam genişliğinde, yarım en fazla (FWMH) ~ 40 nm ile vimentin filaman ve mikrotübüller FWMH ~ 55 genişliğe sahip gözlenen nm. Yerelleştirme duyarlık ve yerelleştirme yoğunluğu üzerinde görüntü çözünürlüğüne bağlıdır, biz en iyi sonuçları her iki ölçütü dikkate alarak izin deneysel koşullar sağlar.

Figure 1
Resim 1 : Sırasında edinme ve yerelleştirme hassas tahmin tek moleküllerin en uygun yoğunluğu.
(A-B) Sol: Tek bir kare ile (A) parlak durumda tek moleküllerin en uygun bir yoğunluk ve çok yüksek yoğunluklu temsilcisi ham görüntüleri (B) sabit U373 hücreleri fırtına edinimi (adım 6.12.) sırasında anti-vimentin ve anti-fare ile lekeli Alexa647. Sağ: RAW formattaki fotoğrafların tek molekülleri (6 için ayarla) gürültü eşik için en yüksek yoğunluk seviyesinden floresan ile çevrelendiği çevrelerin (beyaz veya kırmızı). Çemberin çapı en yüksek maskesi boyutu (9 piksel ayarlı) tarafından ayarlanır ve molekülleri (kırmızı) çakışıp çakışmadığını rengi belirler (beyaz). Bu yüksek yoğunluklu (içinde (B)) tek molekülleri kurşun STORM görüntü yeniden inşası için dikkate alınmaz molekülleri çakışan yüksek bir miktara dikkat edin. A iç metin: kırmızı tek bir molekül ve onun Gauss tipik floresan yoğunluğu profilini gösteren grafik uygun siyah. Bu örnekte, yerelleştirme hassas σx is 6,7 = nm. Ölçek çubuğu, 1 µm. (C) tipik histogramını yerelleştirme precisions için tüm molekülleri algıladı ve üretici yazılımı tarafından analiz. Bu görüntülenmeyecektir ve çevrimiçi işlem sayesinde ham veri toplama sırasında düzenli olarak güncelleştirilir. Bu çubuk grafik şekil 3B' gösterilen Mikrotubul ağ dSTORM görüntüsünü karşılık gelir. (D) Sol: Tek bir molekül görüntüsünü fırtına cam yüzeyde imar sonra sunar. Sağ: Histogramlar Gauss uydurma sonra elde edilen X ve Y konumları. X ve Y dağıtımları uydurma Gauss yerelleştirme duyarlıkla bir tahminde bulunabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Vimentin ağ görüntüsünü temsilcisi dSTORM. dSTORM görüntü (A), ilgili standart geniş-alan görüntü (B) ve (C) iletişim kuralında tanımlandığı gibi sabit ve Alexa647 ile vimentin için lekeli bir U373 gliyal hücreye öncü gösterilen yerleşimi. Alt: Vurgulanan bölgenin zoom. (D) enine yoğunluğu profilleri a Yakınlaştırılmış görüntülerde sarı hattı boyunca ve B. ölçek bar, 2 µm ve 500 nm zoom. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Temsilci çift renkli dSTORM görüntü vimentin ve Mikrotubul ağlar. (A) Vimentin ağ lekeli Alexa647 ile ( şekil 2Aolduğu gibi aynı). (B) Mikrotubul ağ Alexa555 ile Etiketlenmiş. (C) kaplaması vimentin (kırmızı) ve sağındaki yakınlaştırma bölgesiyle Mikrotubul (mavi) ağlar. Vimentin dSTORM görüntüsünü ~1.5 milyon yerelleştirmeler 40 000 çerçeveler dışarı ile elde edildi. Mikrotübüller dSTORM görüntüsünü ~ 850 000 yerelleştirmeler 20 000 çerçeveler dışarı ile elde edildi. Ölçek bar, 2 µm ve 500 nm zoom. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Mikrotübüller uygun olmayan görüntüleme koşulları örnekleri. Ne zaman fluorophores yanıp ama ne zaman fluorophores yeterince parlak ama düzgün olamaz bir Alexa488 tübülin U373 gliyal hücreler ve 143 mM BetaMercaptoethanol ve oksijen çöpçü görüntüleme arabellek (A), etiketleme ile parlak değildir fluorophores yavaş yavaş yanıp sönme ve Alexa568 kullanarak parlak değildir zaman karanlık Üniversitesinde (kullanılabilir en yüksek lazer gücü) ve göz kırpma yavaş yavaş 143 mm BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA tübülin ve oksijen tutucu tampon (B) etiketli Alexa555 ile ve tükenmiş 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA ve oksijen tutucu içeren bir fırtına tampon tübülin etiketli (C). Tüm bu durumlarda, dSTORM görüntü çözünürlüğü bozulmuş olması. Ölçek bar, 2 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : U373 hücrenin vimentin ve Mikrotubul ağların temsilcisi çift renkli dSTORM görüntü sabit 5 dakika süreyle soğuk metanol ile (A) mikrotübüller ağları Vimentin ve (B) Alexa647 ve Alexa555 ile sırasıyla vurgulanan yakınlaştırır ile Etiketlenmiş. Ön filaman ağların genel çözünürlük azalan sitoplazma lokalize hücre tek molekülleri varlığını unutmayın. Ölçek bar, 2 µm ve 500 nm zoom. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : DSTORM karşılaştırma görüntüleri yeniden
Üretici yazılım (A) ve fırtına (FiJi eklenti) (B) tarafından yeniden dSTORM görüntü. (C) ilişkin bir bindirme (A) magenta ve (B) yeşil. Ölçek bar, 2 µm ve 500 nm zoom. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İletişim kuralı kritik adımlar

Burada hangi mikrotübüller dSTORM görüntülerini eserleri ve IFS gliyal hücreler içinde en aza indirgemek bir iletişim kuralı mevcut. Eserler numune hazırlama ve görüntüleme her adımda oluşturulan: engelleme, fiksasyon, immunolabeling, drift satın alma sırasında uygun olmayan yanıp sönen koşulları23. Biz en kritik adımları listelenmektedir.

Coverslips temizlik fluorophores yüzeyi non-spesifik bağlama sınırlamak için önemli bir adım olduğunu ve bu nedenle dSTORM resimdeki arka plan gürültü sınırlamak için.

Biz bir adım PFA (paraformaldehyde) (adım n ° 3) ile oxazolidin ve triton ve fiksasyon bir karışımını kullanarak çıkarma ve fiksasyon çözümleri ile örnek sabitleme öneririz. Fiksasyon Protokolü Chazeau ve ark12den uyarlanmıştır: çıkarma/fiksasyon adım kuluçka süresi 60 azalma s (Adım 3.4), glikoz sitoiskeleti arabelleğinden kaldırmak ve permeabilization ekstra adım atlanır. Bu yöntemin avantajı serbestçe hareket eden hücre iskeleti alt birimleri, süper kararlılık düşsel daha az arka plan12ile izin drene var. Daha genel olarak fiksasyon adım önemlidir çünkü kötü fiksasyon (eski İngiltere'de yılın, soğuk çözümleri, çok uzun/kısa kuluçka adımları kullanarak) kurşun filaman ağları kısmi imha için (kırık mikrotübüller, hücre açık ulaşmak olmayan mikrotübüller ve/veya buna bir düşük yoğunluklu). Eğer sadece vimentin ağ Leduc ark15' te açıklandığı gibi özellikle yansıma da metanol fiksasyon, kullanmak mümkün olduğunu unutmayın. Ancak, arka plan gürültü (şekil 5) hücre içinde görülebilir. DSTORM görüntüleri sabit metanol ile elde edilen, ancak yoksul kalitesini hücrelerdir, hala bilgi ne hem de eğer verirler ve Mikrotubul ağlar gibi örneğin içinde dönem-in filament yoğunluğu görünmelidir. Mikrotubul fiksasyon23en iyi protokolü olmasına rağmen sadece oxazolidin ile fiksasyon IFS için çok kötü sonuçlar verdi.

İmmunostaining bölümünde köstebeğiyle geliştirilen antikorlar ile cross-reaction en aza indirmek Anti-fare antikorlar kullanılması önemlidir. Fare Anti-tübülin ek olarak fare anti-vimentin ile özel cross-react çünkü biz Fab parçaları (Anti-fare) bu sebeple kullanılamadı.

Kullanılabilir sınırlı lazer gücü nedeniyle Alexa555 boyalar karanlık durumuna pompa için 488 ve 561 nm lazer çizgileri kullanmak gereklidir. Yüksek 488 lazer güç (~ %50) satın alma sırasında arka plan gürültü de artırır, ancak iyi yanıp sönen ve düşük iş hacmi, (zaman fluorophore bir kısmını açık durumunda geçirdiği) gözlemlemek için gereklidir. TIRF aydınlatma modu fluorophores ince bir tabaka olarak uyarma sınırlar (~ 200 nm cam coverslip yukarıda). Arka plan ışığı azaltarak sinyal-gürültü oranı artar, ancak aynı zamanda uyarma güç azaltır. HILO modu Aksiyel kesit sağlar ve sinyal-gürültü oranı en iyi duruma getirmek için verimli olabilir. Bu nedenle epinefrin ve TIRF arasında iyi bir orta olduğunu. HILO modu kullanılarak verimli bir şekilde düzgün yanıp sönmeye yüksek lazer gücü gerektiren Alexa555 fluorophores heyecanlandırmak için esastır.

Başka bir önemli adım ham veri (adım 6) değil. (Pozlama, kazanç, TIRF ve hiçbir odak blok aygıtları kullanılabilir olduğunda bile odak) satın alma parametrelerini ayarlamak için gerekli olan süre film kazanılır. Parlak fluorophores en uygun bir yoğunluğu tutmak olduğunu önemli (şekil 1A): dağınık şekilde tüm yapısını sonra 40 000 çerçeveler görselleştirmek için yeterince yüksek ama her boya ayırmak için düşük olması gerekir. Aktif molekül sayısı çok düşük ise, uzun yığınları satın. Biz ile iyi görüntüler elde ~ µm² başına 5000 yerelleştirmeler IFS için ve 2 500 yerelleştirmeler cm² mikrotübüller için ücret.

Değişiklikler ve sorun giderme yöntemi

Taze örnekler ile çalışmak önemli ve en iyi duruma getirilmiş arabellekleri görüntüleme. pH kesin olarak, özellikle MEA için ayarlanmalıdır.

Vimentin ve mikrotübüller (WF) standart geniş alanlı mikroskobu tekniği ile görüntülü zaman düzgün etiketli görünmelidir. Filamentler noktalama işaretleriyle/klasik mikroskobu ile kesik bakarsanız, bu süper çözümlemesi yaptığında AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır. Bu durumda, yeni örnekleri hazırlamak daha iyidir. Sigara optimize fiksasyon koşulları (eski İngiltere'de yılın vb) parçalanmış seyir mikrotübüller neden olabilir. Yüksek arka plan cam yüzey üzerinde bir verimsiz bloke edilen ortaya çıkabilir. Bu durumda, BSA (sığır serum albümin) FBS (fetal sığır serum) tarafından değiştirilmesi ve her kuluçka adımda kullanılan.

Etiketleme yoğunluğu çok yüksek ise (şekil 1B) ve yeterince karanlık kapalı-durumunda olan, hatta en yüksek lazer gücü ile orta miktarda itti değil antikorlar (birincil antikor miktarı azalan daha iyi) indirdi. Ancak, bunun yeni örnekleri hazırlanması gerekir. Genel olarak, ampirik olarak kullanmak için ikincil antikorlar miktarını değerlendirmek gereklidir.

Eğer fluorophores normalde blink değil (onlar yalnızca bir dilimi içinde parlak durumda olmalıdır), görüntüleme tamponunun pH doğru (pH 8.3) olup olmadığını kontrol edin. Sorun (özellikle MEA) devam ederse yeni çözümler hazırlamak. Her zaman TIRF Kolimatör (TIRF u_HP) olup olmadığını kontrol edin. Sınırlı lazer gücü ile doğru yanıp sönen elde etmek zor olabilir (açık ve kapalı oranları boya parlaklık bağlı olarak lazer güç, hem de açıklandığı gibi van de Linde ve ark11). Daha fazla güç uyarma lazer kullanılabilir14ise Alexa488 veya Atto488 keşfedilmeyi olabilir gibi diğer boya.

Fluorophores 40 000 kare bitmeden yanıp sönen durdurursanız, okside görüntüleme arabellek değiştirin. Arabellek değişiklikten sonra hiçbir hava kabarcıkları arabellek ve kapak arasında olduğundan emin olun. Mühürlü örnekleri için bir kaç saat içinde bir ham görüntüsü.

Bir EMCCD ile donatılmış düzenli TIRF mikroskop üzerinde fırtına film aldıysanız, görüntüleri yeniden oluşturmak için fırtına24 kullanmak mümkündür. Benzer seçenekler drift düzeltme, görüntü filtreleme ve görüntü işleme için kullanılabilir. Fırtına Fiji/imageJ yazılımı ile kullanılan bir eklentidir. Üretici yazılım ve fırtına (şekil 6) ile benzer sonuçlar elde edilmiştir.

COT (cyclooctatetraene) tek molekülleri yerelleştirme kesinliğini artırmak için görüntüleme tampon eklenebilir. Alexa64725devir başına yayılan fotonlar sayısını artırır. Daha iyi bir yerelleştirme hassas gerçekten gözlenmiştir (6 aşağı nm) 2 mM KARYOLASI fırtına arabelleğe ekleme açıklandığı zaman adım 5 veya 100 mM ile MEA açıklandığı gibi başvuru25. Ancak, bu koşullar içinde çok parlak molekülleri satın alma sırasında sayısını azaltır molekül yerelleştirmeler satın alma sonunda toplam sayısını sınırlama ve potansiyel olarak Eğer ağ altında örnekleme için önde gelen KARYOLASI, olmadan daha hızlı. Diğer görüntüleme arabellekleri de Alexa boyalar örneğin laktaz ve oxyrase sistem26atma oksijen kullanarak, çalışmak için rapor edilmiştir. Bu iletişim kuralı, biz içinde dönem-in çözünürlük bizim türü örnekleri ve kurmak görüntüleme için en iyi sonucu veren arabellek oluşturma raporu ama her örnek türü arabellek optimizasyonu, ek olarak etiketleme ve fiksasyon koşulları optimizasyonu gerektirir.

Yönteminin sınırlamalarını ve olası gelişmeler

Burada sunulan yöntem sabit hücreleri ve 2D görüntüleri ile sınırlıdır. TIRF mikroskop ve bir EMCCD kümesi görüntüleme bir standart kullanarak, en sınırlayıcı bir faktör oldu lazer gücü (100 mW 561 nm lazer için yanıp Alexa555 boyalar yapmak için yeterli değildi). 532 nm lazer çizgi bu boyalar heyecanlandırmak için daha verimli olabilir. Yöntemin olası bir gelişme 3D dSTORM optik astigmat27kullanarak gerçekleştirmek için olur. Bu iletişim kuralı, bir alt etiketleme yoğunluğu ve artan çerçeve numarası dışında en az değişiklikler gerektirir. 3D çift renkli fırtına görüntü mikrotübüller, özellikle paketlerde ambalajlayın sarılı IFS daha iyi bir görünümünü sağlar. Aktin filamentleri da aynı fiksasyon yöntemi ve floresan phalloidin8en iyi duruma getirilmiş bir miktarda kullanarak gözlenen olduğunu unutmayın. 3 renk fırtına üç hücre iskeleti alt sistemleri organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.

Birincil ve ikincil antikorları kullanarak ikincil antikor 20 kadar yerelleştirilmiş beri ilgi nesnesi boyutunu artırır nm hedef. Tipik olarak, bir 25-nm çapında Mikrotubul genişliğinde olacak ~ 50 nm etiketleme sonra. Hedef ve boya arasındaki uzaklığı artırmak için bir doğrudan uygun boya ile birincil antikorlar etiketlemek için ihtimal. İdeal ile organik boya etiketli nanobodies kullanılan28olmalıdır.

Biz burada sadece tek bir molekül Endesfelder ve ark22takip ortalama yerelleştirme duyarlığını tahmin etmek için basit bir yöntem sağlar. Her iki yerelleştirme hassas dikkate alır ve yoğunluğu, etiketleme da Fourier yüzük korelasyon yaklaşım29kullanarak ölçmek genel çözünürlüğünü görüntüler.

Kanal kayıt ile ilgili görüş alanı mevcut mükemmel her boncuk yerleşimi zordur. Daha karmaşık bir düzeltme Chazeau ve ark 12' bulunabilir.

DNA-boya (DNA noktaları birikimi Nano topografya görüntüleme için)30kullanarak fluorophores yanıp sönen ve probları ağartma kaynaklanan sınırlamalar üstesinden gelebilir. Bu yöntem, tek molekül yerelleştirme için gerekli yanıp sönen geçici bağlama kısa boya etiketli oligonucleotides tamamlayıcı hedefleri için oluşturulur.

Sonuç

Bu yazı 2 boyutlu sabit hücrelerde hücre iskeleti filamentler, çift renkli dSTORM görüntüleme gerçekleştirmek için sağlam bir protokol sunar. Bizim örnek türü için arabellek fiksasyon, immunolabeling ve görüntüleme açısından en uygun bulundu deneysel koşullar ayrıntılarda açıklanmıştır. Sonra ham veri toplama ve var olmak yazmak zorunda yanıp sönen resim türünü süreci (molekül yoğunluğu, sinyal gürültü oranı, fluorophore görev döngüsü vb) nasıl yanı sıra dSTORM görüntüleri yeniden, drift ve filtre bilgileri düzeltmek için sunulmaktadır. Aşağıdaki adımları çift renkli dSTORM görüntüleme için genel olan ve türü özel örnek değil. Son olarak, nasıl bu teknik iki eşleşmiş hücre iskeleti ağ yoğun organizasyonu çözmek için yardımcı olur gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Mickael Lelek, Orestis Faklaris ve verimli tartışma için Nicolas Bourg, Andrey Aristov ve Elena Rensen süper çözünürlük tekniği ile ilgili yardım ve Shailaja Seetharaman şekilde alt alta yazılmalıdır dikkatli okumak için teşekkür ederiz. Minnetle anıyoruz Institut Pasteur UtechS fotonik BioImaging (Imagopole) Citech (Paris, Fransa) yanı sıra Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-10-INSB-04; tarafından desteklenen Fransa-BioImaging altyapı ağı Yatırımlar gelecek için) ve Région Ile-de-France (Domaine d programı ' Intérêt Majeur-Malinf) Elyra mikroskop kullanımı için. Bu eser tarafından desteklenmiştir Ligue Contre le kanser ve Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 133 ara filamentler vimentin Mikrotubul fırtına süper çözünürlük mikroskobu sitoiskeleti
Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S.… More

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter