Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57087
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

Summary

Det overordnede mål med denne metode er at give de optimale forsøgsbetingelser fra prøveforberedelse til billede erhvervelse og genopbygning for at udføre 2D dobbelt farve dSTORM billeder af mikrotubuli og mellemliggende filamenter i faste celler

Abstract

Cytoskeleton, der består af aktin microfilaments, mikrotubuli og mellemliggende filamenter (IF), spiller en central rolle i kontrollen af celle form, polaritet og motilitet. Tilrettelæggelsen af aktin og mikrotubulus net har været grundigt undersøgt, men som af IFs er ikke endnu fuldt karakteriseret. IFs har en gennemsnitlig diameter på 10 nm og form et netværk strækker sig i hele cellen cytoplasma. De er fysisk forbundet med aktin og mikrotubuli gennem molekylære motorer og cytoskeletal linkers. Dette stramme sammenslutning er kernen i de reguleringsmekanismer, der sikrer den koordinerede regulering af de tre cytoskeletal netværk kræves for de fleste cellefunktioner. Det er derfor afgørende at visualisere IFs alene og også sammen med hver af de andre cytoskeletal netværk. Men hvis netværk er meget tætte i de fleste celletyper, navnlig glial celler, hvilket gør sin beslutning meget vanskeligt at opnå med standard Fluorescens mikroskopi (lateral opløsning på ~ 250 nm). Direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (dSTORM) er en teknik, der tillader en gevinst i laterale opløsning af en størrelsesorden. Vi viser her, at lateral dSTORM beslutning er tilstrækkelig til at løse den tætte organisation Hvis netværk og navnlig, hvis bundter omkring mikrotubuli. Sådan stram association er tilbøjelige til at deltage i den koordinerede regulering af disse to netværk og maj, forklare hvordan vimentin IFs skabelon og stabilisere mikrotubulus organisation samt kunne påvirke mikrotubulus afhængige vesikulære handel. Mere generelt viser vi hvordan observation af to cytoskeletal komponenter med tofarvet dSTORM teknik bringer ny indsigt i deres gensidigt samspil.

Introduction

Cytoplasmatisk mellemliggende filamenter (IFs) er 10 nm-diameter homo- eller heteropolymers af en celle type bestemt undersæt af hvis proteiner. IFs deltage i en lang række cellulære funktioner såsom celle motilitet, spredning og stress reaktioner. Deres vigtigste rolle understreges af det faktum, at mere end 90 menneskelige sygdomme er direkte forårsaget af mutationer i hvis proteiner; for eksempel, ændringer i hvis sammensætning ledsager tumor vækst og spredning af1,2,3. Der stigende bevis for, at de tre cytoskeleton systemer fungerer i samarbejde at kontrol cellulære funktioner såsom celle polarisering, division og migration2,3. Da der er en tæt kobling mellem rumlige arkitektur og funktioner, er det afgørende at få indsigt i den strukturelle organisering af IF med de andre filamenter og bedre forstå den cytoskeletal cross-talk. denne artikel indeholder en protokol for at udføre super-resolution teknik tofarvet dSTORM (direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi)4 og hvordan det bruges til at undersøge samspillet mellem hvis og mikrotubuler i faste, kulturperler celler i 2 dimensioner (2D).

Flere super-resolution teknikker er blevet udviklet i løbet af sidste årti, og der opdagelser var på oprindelsen af Nobelprisen i kemi i 20145. Blandt alle disse teknikker ligger enkelt molekyle lokalisering-baserede metoder som PALM6 (Photo-Activated lokalisering mikroskopi) som bruger photoswitchable fluorescerende proteiner, STORM7 med par fluorophores eller dSTORM4 med konventionel fluorophores. Alle disse metoder er baseret på samme princip, som består af (i) de fleste af de fluorescerende reportere skiftet ind i en "off" tilstand"(ikke-fluorescerende), (ii) den stokastiske aktivering af en delmængde af dem ind i et fluorescerende stat for at lokalisere deres geografiske position med nanometer nøjagtighed, og (iii) en gentagelse af denne proces for at aktivere så mange delmængder af fluorophores som muligt. En endelige billede er rekonstrueret ved hjælp af alle lokaliseringer af de aktiverede molekyler, giver en lateral opløsning ned til ~ 20-40 nm. Flere kommercialiseret optiske systemer så PALM/STORM er nu tilgængelige for biologer for rutinemæssig eksperimenter. Her, blev et sådant system brugt til at studere de strukturelle sammenslutning af mikrotubuli og IFs. Blandt alle de enkelt-molekyle lokalisering-baserede metoder, tofarvet dSTORM teknik blev valgt, fordi det er velegnet til at observere meget tynd gråt regioner (< 1 µm) af vedhængende celler og kan give betydelig forbedring af billedopløsning med minimal investering i tid og penge. DSTORM er faktisk en meget praktisk og alsidigt teknik, der er kompatibel med standard organiske farvestoffer rutinemæssigt anvendes til cellulære farvning og immunfluorescens.

Mens én farve dSTORM billeder er relativt enkle at opnå ved hjælp af fluorophore Alexa6478, kræver dobbelt farve dSTORM for at optimere de eksperimentelle betingelser, så to farvestoffer kan blinke korrekt i den valgte buffer, især når der er begrænset Laser power. Fremragende papirer er allerede tilgængelige på metoder til at oprette flerfarvede imaging med dSTORM9,10,11,12,13, og disse papirer forklare i detaljer de mulige kilder til artefakter og forringet billedopløsningen samt hvordan man kan overvinde dem. I denne artikel, de optimale eksperimentelle betingelser med hensyn til celler fiksering, immunfarvning, prøveforberedelse er imaging erhvervelse og billede genopbygning beskrevet for at erhverve billeder af tætte cytoplasmatisk hvis netværk og mikrotubuli i glial celler med dual-farve dSTORM. Kort efter ekstraktion/fiksering metoden i Chazeau mfl12 blev tilpasset til glial celler og bruges sammen med en efter fiksering skridt, optimeret antistoffer koncentration, en STORM buffer med 10 mM MEA beskrevet i Dempsey9 et al., som var fundet for at være optimal for eksperimenterende sæt op og prøvetypen.

Gliaceller express primært tre typer af hvis proteiner: vimentin, nestin og GFAP (glial sure fibrillære proteiner). Disse tre proteiner blev vist til co polymerisere i astrocytter14. Vi viste tidligere ved hjælp af super-opløsning struktureret belysning mikroskopi (SR SIM), at disse tre hvis proteiner kan findes i samme enkelt hvis glødetråden og at de viser lignende fordeling og dynamik i gliaceller 15. På grund af ligheder mellem de tre hvis proteiner, blev vimentin farvning brugt som en reporter for hele hvis netværket. Ved hjælp af dSTORM, vi har kunnet løse, hvordan hvis form bundter langs mikrotubuli, hvilket ikke var muligt med diffraktion begrænset mikroskopi teknikker15. Disse bemærkninger kan hjælpe til at forstå, hvordan vimentin IFs kan skabelon mikrotubuli og regulere deres vækst bane, fremme bevarelsen af en polaritet akse i celle migration16. Super-opløsning billeder givet vigtige oplysninger om den gensidige interaktion mellem de to cytoskeletal delsystemer og bragt indsigt i sammenhængen mellem fysisk association og lokale funktion, som kunne være celletype specifikke17. I almindelighed, kan tofarvet dSTORM bruges til at studere krydstale mellem cytoskeletal elementer eller andre typer af organeller, forudsat at god immunfarvning betingelser er nået med hensyn til tæthed og specificitet. Denne teknik vil være nyttigt til at bedre karakterisere cytoskeleton ændringer observeret under astrogliosis og i glioblastom, den mest almindelige og mest maligne tumor i centralnervesystemet, hvor udtryk for hvis proteiner er ændret 18 ,19,20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips forberedelse (dag 1, 30 min)

  1. Placer 18-mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glas coverslips på en plast rist.
  2. Sætte rack i et 100 mL bægerglas fyldt med acetone og blød i 5 min.
  3. Overføre rack til et 100 mL bægerglas fyldt med absolut ethanol og blød i 5 min.
  4. Overføre rack til en ny 100 mL bægerglas fyldt med absolut ethanol og Bægerglasset anbringes i en ultralyds renere enhed (se tabel over materialer) ved stuetemperatur. Tryk på "on" og vente på 10 min.
  5. Sætte rack under en laminar flow hætte og lad coverslips tørre eller tørre coverslips med filtreret luft flow.
  6. Sætte rack med coverslips i en plasma renere enhed. Tænd vakuumpumpen, lukke døren, vente i 3 min. at lave vakuum og skifte på plasma i 1 min. brug at coverslips kort efter rengøring. Opbevar ikke dem.

2. celle plating (dag 1, 20 min)

  1. Vokse glial celler linjen U373 i Minimum afgørende Medium (MEM) med 10% føtal bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin, og 1% ikke-essentiel aminosyre i 10 cm diameter plast petriskål.
  2. Placer rene glas coverslips i 12-godt plader under laminar flow hood og tilsættes 1 mL af forvarmet celle medium pr. brønd.
  3. Tage en parabol, der indeholder celler fra celle inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  4. Fjern mediet og tilsæt 10 mL PBS.
  5. Fjerne PBS og tilsættes 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA.
  6. Placer fadet tilbage i inkubatoren for 2-3 min.
  7. Der tilsættes 10 mL af varmt medium forvarmes ved 37 ° C på skålen og resuspend cellerne.
  8. Frø omkring 100 000 celler pr. brønd (~ 150 µL af celler) i de 12-godt plader, der indeholder coverslips.
  9. Vent i mindst 6 timer (eller natten over) at tillader celle spredning.

3. celle fiksering (dag 2, 2h)

  1. Forberede cytoskeleton buffer med 80 mM rør, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, og ph indstilles til 6,9.
  2. Vaske cellerne en gang med PBS.
  3. Fjerne PBS og forsigtigt tilsættes 1 mL pr. brønd af udvinding/fiksering løsning (0,25% glutaraldehyd, 0,3% Triton X-100 i cytoskeleton buffer) forvarmes ved 37 ° C.
  4. Inkuber i 60 s ved stuetemperatur.
  5. Fjerne løsningen og forsigtigt tilsættes 1 mL pr. brønd af forvarmet og frisklavede 4% PFA (PARAFORMALDEHYD) opløsning fortyndes i cytoskeleton buffer.
    Forsigtighed: Brug handsker og arbejde under den kemiske hætte.
  6. 12-godt pladen anbringes tilbage i varmeskab ved 37° C i 10 min.
  7. Fjerne PFA og tilsættes 3 mL PBS pr. brønd.
    Bemærk: Arbejde under den kemiske hætte med handsker og sætte den genvundne PFA i en bestemt placering.
  8. Vaskes to gange med PBS.
  9. Fjerne PBS og tilføje frisklavede 10 mM Kristian4 opløsning fortyndes i PBS for at slukke autofluorescence kommer fra glutaraldehyd.
  10. Inkuber i 7 min. ved stuetemperatur.
  11. Sætte den genvundne Kristian4 i en bestemt placering.
  12. Vaskes tre gange 5 min med PBS.
  13. Fjerne PBS og føje de blokering løsning (5% BSA løsning i PBS).
  14. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur (eller natten over ved 4 ° C).
    Bemærk: Cytoskelettet buffer kan opbevares ved stuetemperatur i et par måneder. PFA, Kristian4 og glutaraldehyd bør håndteres med særlig omhu (hætte, handsker og specifikke genvindingskurve). Løsninger bør tilføjes og fjernes forsigtigt for at bevare integriteten af cellerne. Det er vigtigt ikke at lade cellerne tørre.

4. immunfarvning (dag 2, 5h)

  1. Forberede løsning af primære antistoffer ved hjælp af anti-vimentin og anti-tubulin med en 1: 500 fortynding i den blokerende løsning.
  2. Sat 100 µL dråber fortyndet primære antistoffer på en paraffin film lag og placere coverslips oven på dem med celler vender nedad.
  3. Inkuber celler med primære antistoffer for 2 h. Læg coverslips tilbage i en 12-godt tallerken fyldt med PBS. Skyl tre gange for 5 min hver gang i PBS ved stuetemperatur på en orbitalryster.
  4. I mellemtiden Forbered den sekundære antistoffer løsning ved hjælp af anti-mus Alexa647 og anti-rat Alexa555 ved en fortynding på 1:1, 000 i blokerende løsning. Inkuber celler med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Fortsætte som 4.2. beskytter cellerne mod lys.
  5. Sætte coverslip tilbage i en 12-godt tallerken fyldt med PBS. Skyl tre gange for 5 min hver gang i PBS ved stuetemperatur på en orbitalryster. Fjern PBS og tilsæt 0,5 mL PBS blandet med 1 µL af 0,1 µm tetraspeck perler.
  6. Sætte brøndene på en orbitalryster i 30 min. Skyl med PBS. Fjerne PBS og inkuberes celler i 5 min. med en 4% PFA løsning i PBS. Skyl tre gange i PBS.
    Bemærk: Fast celler kan opbevares i et par uger i PBS ved 4° C. Immunfarvning bør gøres i sidste øjeblik.

5. Prøvetilberedning (dag 3, 5 min)

  1. Sætte delprøver af MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glucose stavbakterier (100 x, 50 mg/mL), katalase (500 x, 20 mg/mL) i en is-kurven.
  2. Forberede 50 mL af Tris-NaCl buffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) suppleret med 10% af glukose (100 mg/mL).
  3. Forberede 1,2 mL imaging buffer lige før imaging med 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glucose stavbakterier, 40 µg/mL katalase (80-200 U/mL) i Tris-NaCl buffer med 10% glukose.
  4. Montere den coverslip, der indeholder mærket cellerne på den magnetiske prøveholderen (f.eks. chamlide kammer) og tilføje den billeddiagnostiske buffer for at fylde helt salen. Sæt låget og sørg for, at der ingen luftboble mellem de billeddiagnostiske buffer og låget.
  5. Rense bunden af prøven med absolut ethanol og kontrollere, at der ikke er læk. Brug fedt for at forsegle prøveholderen korrekt, hvis nødvendigt.
    Bemærk: Udarbejde 1 M bestand af MEA løsning (pH 8.3 justeret ved hjælp af HCl), af glucose stavbakterier på 50 mg/mL og materiel af katalase på 20 mg/mL i vand, lave delprøver og gemme dem på-20 ° C i op til en måned for MEA og et år for glucose stavbakterier og katalase. Ikke genfryses delprøver. Forberede Tris-NaCl buffer på forhånd, og opbevare det ved stuetemperatur i flere måneder. Tilføje glucose på dagen af forsøget (trin 5.3).

6. billede erhvervelse (dag 3, ~ 1h pr. celle)

  1. Tænde mikroskopet. Tænd for erhvervelse software og tryk på Start system.
  2. Vælg erhvervelse Tab. Udvid værktøjet Imaging Setup i gruppen Installationsstyring værktøj. Vælg tilstanden laser WF (bredt felt) for erhvervelsen. Vælg målsætningen, 100 X NA 1.46 . Vælg tilstanden JOHANNAS u-HP , som bruger en kollimator for at reducere synsfeltet er belyst og koncentrere Laseren energi i et mindre område. Brug den optovar linse 1,6 x , der giver en pixelstørrelse på 100nm.
  3. Vælg værktøjet tidsserier og nedsat tid bortfalder med 50 000 rammer og 0.0 ms mellem rammer. Udvid værktøjet kanaler i gruppen erhvervelse parameter værktøj og vælge "Vis alle".
  4. Angive Alexa647 sporet: check 642 og 405 laser linjer for excitation og acceptere for at vende dem. Vælg filteret "655 LP" emission i Imaging Setup. Omdøbe "647".
  5. Klik på '+' i værktøjet af kanaler til at tilføje en anden lys pass og Vælg tilstanden "skifte spor hver: ramme" i værktøjet Imaging Setup . Kontrollere 561, 488 og 405 laser linjer og acceptere for at vende dem. Vælg den "BP 570-650 + LP750" emission filter og bruge optovar linse 1,6 x. Kontroller, at JOHANNAS-uHP-tilstand er valgt. Omdøbe spor "555".
  6. Vælg værktøjet erhvervelse mode og indstiller billedstørrelsen til 200 x 200 pixels. Vælg værktøjet fokus enheder og strategi og indstille konkret fokus på 1 000 rammer (hvis der er et fokus-lock system).
  7. Placere olie på målet og prøven. Vælg fanen Find , og Åbn lukkeren af fluorescens lampe. Finde fokus og kigge efter cellen til billedet ved hjælp af okularet. Sætte det i midten af synsfeltet ved hjælp af joysticket.
  8. Vælg fanen Køb til at gå tilbage til tilstanden erhvervelse. Vælg "647" sporet, indstille 642-laser power til 0,2%, indstille 405-laser magt til 0, indstille eksponeringstiden til 50 ms og en gevinst på 50. Vælg den fortløbende erhvervelse mode at observere celle på skærmen. Justere fokus. Sørg for, at der er mindst én tetraspeck perle i synsfeltet, øge kontrasten for at se dem, hvis nødvendigt. Brug en auto-skalaen tilstand for displayet. Tag en wide-felt epifluorescensmikroskop billede af vimentin netværk ved at klikke på Fastgør og Gem den. Hvis du vil kontrollere JOHANNAS belysning, klik på JOHANNAS, justere vinklen på belysning og/eller kollimator, hvis det er nødvendigt at have et homogent felt af belysning og gemme den.
    Bemærk: Det er vigtigt, at JOHANNAS og epifluorescerende billeder er af høj kvalitet før du starter rå dataopsamling. Diskontinuerlig, ikke ensartet mærket filamenter vil give anledning til dårlig kvalitet dSTORM billeder.
  9. Uncheck den "647" track og vælg og indskrive den "555" spor. Tag et epifluorescensmikroskop billede af mikrotubulus netværk og Gem den. Tage en JOHANNAS billede og gemme det også.
  10. Uncheck den "555" track, Vælg og indskrive den "647" spor, og tryk på fortløbende. Sætte gevinsten til 0 og eksponeringstid til 10 ms. angivet 642-nm laser power til 100% for at pumpe det meste af Alexa647 farvestoffer til den mørke tilstand (~ 2 kW/cm2). Når fluorophores begynder at blinke, sætte eksponering til 15 ms og få til 300. Vælg tilstanden JOHANNAS belysning. Brug rækkevidde indikator tilstand uden auto-skala til at kontrollere, at enkelt molekyle signaler ikke mætte kameraet (angivet med den røde farve). I så fald nedsætte gevinsten indtil mætning forsvinder. Tetraspeck perler vil forblive mættet i begyndelsen af erhvervelse. Tryk på Stop stoppe kontinuerlig observation af cellen.
  11. Udvid værktøjet Online forarbejdning og tjekke Online behandling PALM for at visualisere STORM billedet under erhvervelse. Brug følgende parametre: 9 for Peak maske størrelse (9 pixel diameter), og 6 for Peak intensitet for støj. Teser parametre vil definere de molekyler, der tages i betragtning i behandlingen (lyst nok og ikke overlappende). PAL - statistikværktøj, Vælg Plot type: histogramog Histogram kilde: præcision. Tryk på Start erhvervelse.
  12. I løbet af erhvervelse, koncentrere hvis nødvendigt (hvis der er ingen fokuslås enhed). Justere parametre (eksponering, laser beføjelser) og til sidst skifte på 405-nm laser linje (starter ved 0,001%) at holde en medium tæthed af fluorophores med en minimumafstand på 1 µm mellem enkelt molekyler (> 9 pixel 100 nm, Peak maske størrelse) ( Figur 1A-B). Hvis molekylet tæthed er en lille smule for høj, skal du bruge HILO (meget hælder og laminerede optisk ark) tilstand af belysning i stedet for JOHANNAS. Dette vil øge laser power med 20%. Sørg for, at toppen af lokalisering præcision på histogrammet under rekonstruerede billedet er centreret omkring eller under 10 nm.
    Bemærk: Normalt antallet af molekyler aftager med tiden, og 405-nm laser power øges langsomt i overensstemmelse hermed. Målet er at mindske lokalisering præcision (histogrammet vises under super-opløsning billedet) så meget som muligt med et højdepunkt under 10 nm (figur 1 c). Øge kontrasten mellem PALM billedet, hvis nødvendigt, hvis alt for mange lyse perler findes i feltet.
  13. Tryk på Stop til at stoppe filmen, når mere end 106 lokaliseringer er nået (typisk efter 40 000 rammer). Sætte lasere tilbage til 0,2% (642 nm) og 0 (405 nm). Gem de rå data over STORM erhvervelse med formatet .czi. Uncheck track "647" i værktøjet af kanaler, og vælg og kontrollere track "555".
  14. Indstille eksponering til 25 ms og få til 0. Tryk på knappen fortløbende og indstille både 488 og 561 lasere på 100% til at pumpe Alexa555 farvestoffer til den mørke tilstand (~ 2 kW/cm2 hver). Når fluorophores begynder at blinke, sætte gevinsten til 250, bruge HILO belysning mode og kontrollere at enkelt molekyler ikke mætte kameraet med rækkevidde indikator tilstand. Hvis det er tilfældet, mindske gevinsten. Tryk på Stop. Formindske 488-laser power til 50%.
  15. Tryk på Start erhvervelse. I løbet af erhvervelse, øge gradvist gevinst skal altid på grænsen af mætning. Øge trin for trin 405-nm laser magt til at holde en medium tæthed af enkelt molekyle i synsfelt (Se trin 6.18). Mindske 488 laser power til 20-30%, når den 405 laser er højere end 15%. Derefter falde gradvist 488 samtidig øge 405 laser linje for at holde blinkende af molekylerne så hurtigt som muligt. 488 laser linje kombineret med 561 excitation laser ved maksimal intensitet øger både på og rabat prisen af fluorophores, hvorimod 405 laser linje kun øger den hastighed, på.
  16. Stop erhvervelse når mere end 500.000 lokaliseringer er nået (efter ca 20 000 rammer) eller mere, når ingen mere molekyler blinker. Gem de rå data over STORM erhvervelse med formatet .czi.
    Bemærk: Start altid med højere bølgelængde at undgå blegning (eller aktivering) af andre farver. Da chamlide afdeling ikke er forseglet, er det muligt at ændre den billeddiagnostiske buffer regelmæssigt, f.eks. at teste forskellige buffer betingelser. Ved hjælp af linjen 488 laser nedbryder Alexa 555 farvestoffer er nødvendige, når 561 laser power er begrænset (med 100 mW lasere).

7. billede genopbygning (5 min)

  1. I værktøjet PAL-Drift skal du bruge typen Model-baserede korrektion med automatiske segmenter med en maksimal størrelse på 8. Tryk på Anvend flere gange i træk indtil forskydningen er korrigeret. Denne model-baserede rettelse gælder en algoritme baseret på tværs-korrelation analyse, som korrigerer afdrift.
  2. Ved hjælp af PAL-Filter forbedre værktøjer, udseendet af STORM billede ved at vælge kun de molekyler, som var bedst lokaliseret. For eksempel begrænse lokalisering præcision til 30 nm og PSF til 120-180 nm.
  3. Bruge en pixel opløsning på 5 eller 10 nm i værktøjet PAL-render , samt en Gaussisk visningstilstand, med en udvidelse faktor 1 polyesterfibre. Vælg Render auto dynamikområde HR med en 95% værdi og Render auto dynamikområde SWF med en 90%-værdi. Vælg Render bedste kvalitet.
  4. Vælg PALM konvertere, i menuen PALM i fanen behandling (post-processing tilstand). Tryk på Vælg , og derefter anvende. Gemme den oprettede billede med et format. LSM (og ikke .czi, meget vigtigt).
    Bemærk: Billede genopbygning kan udføres umiddelbart efter erhvervelsen eller senere ved hjælp af billedbehandling tilstand af erhvervelse software. I off linje post-processing tilstand, er det muligt at genanalyserer stakke med forskellige værdier af parametre (peak maske størrelse, peak intensitet for støj). Altid vælge at "kassere overlappende molekyler" og ikke "gennemsnitlig før lokalisering".

8. vurdering af lokalisering præcision af en STORM billede (10 min)

  1. Åbn din STORM rådata og bruge billed oparbejdelse tab. Vælg metoden PALM og derefter PALM igen. Tryk på Vælg.
  2. Tryk på Anvend for at starte genopbygningen bruger et peak maske størrelse 9 og et peak intensitet for støj af 6 (eller de parametre, du vælger for billedet).
  3. Vælg grafik rektangelværktøjet og tegne et rektangel på raw billedet omkring et enkelt molekyle nuværende på glasoverfladen. Der er som regel et par enkelt molekyler der.
  4. Tryk på Anvend igen, og kun de molekyler til stede inde i rektanglet regionen vil blive analyseret.
  5. PAL - statistikværktøj, Vælg Plot type: histogram og Histogram kilde: X eller Y stilling, at visualisere holdning histogrammer.
  6. Gem tabellen med listen over lokaliseringer til venstre under billederne.
  7. Ved hjælp af en software til dataanalyse, oprette histogrammer af X og Y positioner (fig. 1 d).
  8. Passer distributioner af en Gaussisk og gemme σX og σY -værdier. Lokalisering præcision σSMLM anslås af (σX *σY) ^ 0,5.
  9. Gentag trin 8.3-8,8 på så mange molekyler som muligt og gennemsnitlig σSMLM

9. kanal registrering (5 min)

  1. Åbn STORM billedet af hver farve ved hjælp af Fiji (billedet J) software.
  2. Vælg værktøjet tryllestav til at måle positioner af hver tetraspeck perler.
  3. Beregning af X og Y Skift for hver perle og gennemsnitlig dem.
  4. Brug kommandoen "Oversætte" til at oversætte det andet billede med den beregnede X og Y forskydninger.
  5. Flette de to billeder ved hjælp af kommandoen Sammenflet kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et mikroskop udstyret med 50 mW 405 nm og 100 mW 488, 561 og 642 nm solid-state lasere, en EMCCD 512 x 512 kamera, en alfa planlægger Apo 100 X / 1.46 mål og Band Pass 570-650 / lang Pass 655 emission filtre blev anvendt til de repræsentative resultater præsenteres nedenfor.

Figur 1A giver et eksempel molekyle tæthed og signal-støj-forhold, der skal bruges under raw-billede erhvervelse. Billeder af god kvalitet er fremstillet med et minimum af ~ 1 µm mellem tilstødende molekyler. I god blinkende betingelser, bør fluorophores være til stede i kun én ramme. God blinker kræver for at tilpasse imaging buffer betingelserne (pH, reduktiv agent, ilt scavenging system) og laser beføjelser, som indflydelse på - og off-satserne for fluorophores, og derfor pligt cyklus (brøkdel af tid, en fluorophore bruger i på staten)9,11. Figur 1B, tværtimod, giver et eksempel på raw-billede hvor molekylet tæthed er for høj og enkelt molekyle kan ikke løses.

Figur 1 c viser en typisk histogram af lokalisering nøjagtigheder for alle molekylerne opdaget og analyseret af fabrikanten software fra en stak af 20 000 rammer. Denne histogram svarer til dSTORM billedet af mikrotubulus netværk vist i figur 3B. Værdier af lokalisering præciseringer, som fabrikanten software er i god aftale med værdier anslåede følgende trin 8, ved hjælp af pegeredskabet præcisionen af et enkelt molekyle lokaliseret på andet tidspunkt punkter22 (fig. 1 d).

Figur 2A viser et typisk eksempel på dSTORM billede af vimentin filamenter immunolabeled med Alexa647. Stigningen i opløsning kan tydeligt iagttages på sammenligning med billedet erhverves med en standard wide-felt mikroskop (figur 2B-C). Fluorescens intensitet profiler repræsenteret i figur 2D vis at super-resolution mikroskopi imaging giver løse vimentin bundter. DSTORM beslutning er tilstrækkelig til at tælle antallet af filamenter i bundterne.

Figur 3 viser et typisk eksempel på dual-farve dSTORM billede af vimentin og tubulin netværk immunolabeled med Alexa647 og Alexa555 henholdsvis. Overlejring af de to net viser, at vimentin bundter er ofte lokaliseret langs mikrotubuli, giver vigtige strukturelle oplysninger om kobling mellem de to cytoskeleton delsystemer.

Figur 4 viser forskellige eksempler på dSTORM billeder af mikrotubuli fremstillet i ikke-optimale betingelser. Første, brug af Alexa488 og en buffer med 143 mM beta-mercaptoethanol (en anden reduktiv agent brugte i stedet for MEA9,10,11) og en ilt skylleluften system (sammensat af 0,5 mg/mL glucose stavbakterier og 40 µg/mL katalase), fluorophores var blinkende men ikke var lys nok til at være netop lokaliseret (for lav photon tal) (figur 4A). For det andet ved hjælp af Alexa555 med 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA og en ilt scavenging system, fluorophores kunne ikke være pumpet til deres mørke tilstand og derfor ikke være godt rumligt adskilt (for høj normeret maksimalydelse, dvs brøkdel af tiden i tilstanden "on" er for lang) (figur 4B). Endelig, ved hjælp af Alexa568, med 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA og en ilt scavenging system, fluorophores ikke var lyse og var blinker langsomt med meget lange "på" og "off" stater (lav photon nummer og for høje normeret maksimalydelse) (fig. 4 c). I alle disse ikke-optimale betingelser, var mikrotubulus netværk dårligt gengives i super-opløsning. Afslutningsvis optimale betingelser kræver fluorophores med høj photon nummer og lav normeret maksimalydelse9,10 i den tilsvarende imaging buffer. Bemærk at optimere mærkning tæthed og imaging buffer betingelser til at opnå god blinkende betingelser er en standard procedure for dual-farve dSTORM og er ikke specifik for IF-mikrotubulus billeddannelse.

Ifølge Nyquist-Shannon sætning, er det nødvendigt at have fluorophores mindst hver 10 nm til har en opløsning på 20 nm. Udvidet til 2D strukturer, anslået Dempsey mfl, at en mærkning af ~ 104 fluorophores pr. µm2 er nødvendig. Hvis netværket er tættere og dens filamenter er tyndere (10 nm vs 25 nm diameter uden de primære og sekundære antistoffer) sammenlignet med mikrotubulus netværk, konstaterede vi, at to gange mere lokaliseringer er nødvendige for at beskrive hvis netværket. Vi opnåede gode billeder med 5 000 lokaliseringer/µm2 for hvis og 2500 lokaliseringer/µm² for mikrotubuli, fremstillet med 40 000 rammer og 20 000 rammer henholdsvis. Billedet med den højeste opløsning blev opnået med en lokalisering præcision af σSMLM ~ 8-12 nm anslået efter skridt 8 i protokollen (pegende præcision af et enkelt molekyle lokaliseret på andet tidspunkt peger22). Denne estimering af lokalisering præcision var i god aftale med de værdier, der er leveret af fabrikanten softwaren vist i et histogram over lokalisering præciseringer udvundet fra alle detekterede molekylerne i den rå data (eksempel vist i figur 1 c). Sådan lokalisering præcision kan levere et billede med en opløsning på ~ 30 nm (2,35 * præcision) Hvis mærkning tætheden er høj nok. Vi rutinemæssigt observeret vimentin glødelampe med en fuld bredde på halv maksimum (FWMH) ~ 40 nm og mikrotubuli bredde FWMH ~ 55 nm. Da billedopløsningen afhænger både lokalisering præcision og lokalisering tæthed, leverer vi forsøgsbetingelser, som giver mulighed for de bedste resultater under hensyntagen til begge kriterier.

Figure 1
Figur 1 : Optimal tæthed af enkelt molekyler i forbindelse med erhvervelse og lokalisering præcision forkalkulationen.
(A-B) Venstre: Repræsentative raw-billeder fra et enkelt billede med en optimal tæthed af enkelt molekyler i den lyse stat (A) og med en for høj tæthed (B) under STORM erhvervelse (trin 6.12.) af faste U373 celler farves med anti-vimentin og anti-mus Alexa647. Højre: RAW-billeder hvor de enkelt molekyler med fluorescens niveau over Peak intensitet til støj tærskel (sat til 6) er omgivet af cirkler (hvid eller rød). Circle diameter er indstillet af Peak maske størrelse (sat til 9 pixel) og farven bestemmer om molekylerne overlapper (rød) eller ej (hvid). Bemærk, at høj tæthed af enkelt molekyler (i B) fører til en høj mængde af overlappende molekyler, der ikke er taget hensyn til STORM billede genopbygning. A indsatser: graf, der viser en typisk fluorescens intensitet profil af et enkelt molekyle i rød og Gaussian passer i sort. I dette eksempel, lokalisering præcision er σx = 6,7 nm. Skalalinjen, 1 µm. (C) typisk histogram af lokalisering nøjagtigheder for alle molekyler opdaget og analyseret af fabrikanten software. Det kan visualiseres og opdateres regelmæssigt i løbet af erhvervelse af de rå data takket være online behandling. Denne histogram svarer til dSTORM billedet af mikrotubulus netværk vist i figur 3B. (D) Venstre: STORM billede af et enkelt molekyle præsenterer på glasoverfladen efter genopbygning. Højre: Histogrammer af X og Y holdninger fremstillet efter Gaussisk montering. Gaussisk montering af X og Y distributioner give et skøn over lokalisering præcisionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant dSTORM billede af et netværk, vimentin. dSTORM billede (A), tilsvarende standard wide-felt billede (B) og overlay (C) viser den førende kant af en U373 glial celler fastsat som beskrevet i protokollen og farvet for vimentin med Alexa647. Bund: zoom i det fremhævede område. (D) tværgående intensitet profiler langs den gule linje på de zoomede billeder i A og B. skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant dobbelt farve dSTORM billede af vimentin og mikrotubulus netværk. (A) Vimentin netværk farves med Alexa647 (samme som i figur 2A). (B) mikrotubulus netværk mærket med Alexa555. (C) Overlay vimentin (rød) og mikrotubulus (cyan) netværk med en zoom område til højre. DSTORM billede af vimentin blev opnået med ~1.5 millioner af lokaliseringer ud af 40 000 rammer. DSTORM billede af mikrotubuli blev opnået med ~ 850 000 lokaliseringer ud af 20 000 rammer. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Eksempler på ikke-optimale Billeddannende betingelser af mikrotubuli. Når fluorophores blink, men er ikke lys nok med en Alexa488 mærkning af tubulin i U373 glial celler og 143 mM BetaMercaptoethanol og ilt skyllevæske i den billeddiagnostiske buffer (A), når fluorophores er lys nok, men kan ikke være korrekt forarmet i mørke staten (på den maksimale laser power tilgængelig) og blinker langsomt med Alexa555 mærket tubulin i 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA og ilt skyllevæske buffer (B) og når fluorophores blinke langsomt og er ikke lyse ved hjælp af Alexa568 mærket tubulin i en storm buffer, som indeholder 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA og ilt scavenger (C). I alle disse tilfælde, har dSTORM billeder forringet opløsning. Skala bar, 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentant tofarvet dSTORM billede af vimentin og mikrotubulus netværk i en U373 celle fast med kolde methanol i 5 min. (A) Vimentin og (B) mikrotubuli netværk mærket med Alexa647 og Alexa555 henholdsvis med fremhævet zoomer. Bemærk tilstedeværelsen af enkelt molekyler på forsiden af de celler, der er lokaliseret i cytoplasmaet faldende den globale opløsning af glødetrådens netværk. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning af dSTORM rekonstruerede billeder
Rekonstrueret dSTORM billede af den producent software (A) og tordenvejr (FiJi plugin) (B). C overlejring af (A) i magenta og (B) i grøn. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Vi præsenterer her en protokol, som minimerer artefakter i dSTORM billeder af mikrotubuli og IFs i gliaceller. Artefakter kan oprettes på hvert trin af prøveforberedelsen og billedbehandling: fiksering, blokering, immunolabeling, glider under erhvervelse, ikke-optimale blinkende betingelser23. Vi liste nedenfor de mest kritiske trin.

Rengøring af coverslips er et vigtigt skridt til at begrænse ikke-specifik binding af fluorophores på overfladen og derfor at begrænse baggrundsstøj i dSTORM billede.

Vi foreslår, at fastsættelse af prøven med et skridt af udvinding og fiksering løsninger ved hjælp af en blanding af glutaraldehyd og triton, og derefter fiksering med PFA (PARAFORMALDEHYD) (trin nr. 3). Fiksering protokol blev tilpasset fra Chazeau mfl12: vi faldt udvinding/fiksering trin inkubationstiden til 60 s (trin 3,4), fjerne glukose fra cytoskeleton buffer, og springes over ekstra trinnet af permeabilization. Fordelen ved denne metode er, at de frit bevægelige cytoskeletal underenheder er drænet væk, giver mulighed for super-opløsning imaging med mindre baggrund12. Mere generelt trinnet fiksering er kritiske fordi dårlig fiksering (ved hjælp af gamle PFA, kolde løsninger, alt for lang/kort inkubation trin) føre til delvis ødelæggelse af glødetrådens netværk (brudt mikrotubuli, mikrotubuli, som ikke når den celle forreste og/eller i en lav befolkningstæthed). Bemærk, at det er også muligt at bruge metanol fiksering, især hvis kun vimentin netværk er afbildet som beskrevet i Leduc al.15. Baggrundsstøj kan dog iagttages inde i cellen (figur 5). Selv om dSTORM billeder fås med methanol fast celler er af dårligere kvalitet, de stadig give oplysninger om hvad begge hvis og mikrotubulus netværk bør ligne f.eks. på sigt af glødetrådens tæthed. Fiksering med kun glutaraldehyd gav meget dårlige resultater for IFs, selv om det er den bedste protokol for mikrotubulus fiksering23.

I immunfarvning del er det vigtigt at bruge anti-museantistoffer, som minimerer krydsreaktion med antistoffer udviklet i rotte. Vi kunne ikke bruge Fab fragmenter (anti-mus) af denne grund, fordi De krydsreagere ikke-specifikt med rotte anti-tubulin ud over musen anti-vimentin.

På grund af den begrænsede laser power tilgængelige er det nødvendigt at bruge både 488 og 561 nm laser linjer til at pumpe Alexa555 farvestoffer til den mørke tilstand. Høj 488 laser power (~ 50%) er også nødvendigt under erhvervelse til at overholde god blinker og lav duty cycle (brøkdel af tiden en fluorophore tilbringer i tilstanden på), selv om det øger baggrundsstøj samt. JOHANNAS belysning mode begrænser excitation af fluorophores i et tyndt lag (~ 200 nm ovenfor glas coverslip). Det øger signal-støj-forhold ved at mindske baggrundslys, men også reducerer excitation magt. HILO tilstand tillader aksial skæring og kan være effektiv til at optimere signal til støjforhold. Det er derfor en god mellemting mellem epi og JOHANNAS. Bruge tilstanden HILO er afgørende for at ophidse effektivt Alexa555 fluorophores, som kræver høj laser power at blinke korrekt.

En anden kritisk trin er erhvervelse af rådata (trin 6). Det er nødvendigt at justere parametrene erhvervelse (eksponering, gevinst, JOHANNAS og endda fokus når ingen fokus blokenhed er tilgængelig) mens filmen er erhvervet. Holde en optimal tæthed af lyse fluorophores er vigtig (figur 1A): det skal være så lav at rumligt adskille hver farvestof, men høj nok til at visualisere hele strukturen efter 40 000 rammer. Hvis antallet af aktiverede molekyler er for lav, skal længere stakke erhverves. Vi opnåede gode billeder med ~ 5000 lokaliseringer pr. µm² for IFs og 2 500 lokaliseringer pr. cm² for mikrotubuli.

Ændringer og fejlfinding af metoden

Det er vigtigt at arbejde med friske prøver og optimeret imaging buffere. pH skal justeres præcist, navnlig for MEA.

Vimentin og mikrotubuli bør ser ensartet mærket når afbildet med standard wide-felt mikroskopi teknik (WF). Hvis filamenter ser præget/knust med klassisk mikroskopi, vil dette blive forstærket, når du bruger super opløsning. I dette tilfælde er det bedre at forberede nye prøver. Ikke-optimeret fiksering betingelser (gamle PFA etc.) kan resultere i mikrotubuli ser fragmenteret. Høj baggrund på glasoverfladen kan opstå fra en ineffektiv blokering. I så fald kan BSA (bovint serumalbumin) erstattet af FBS (føtal bovint serum), og bruges i hver inkubation trin.

Hvis mærkning tætheden er for høj (figur 1B) og kan ikke være tilstrækkeligt skubbet i den mørke off-tilstand, selv med den højeste laser power, mængden af sekundære antistoffer bør sænkes (bedre end mindske mængden af primære antistoffer). Dette kræver imidlertid forberedelse af nye prøver. Generelt er det nødvendigt at vurdere empirisk mængden af sekundære antistoffer til at bruge.

Hvis fluorophores ikke blinke normalt (de skal være i den lyse tilstand i løbet af kun én ramme), kontrollere, at de billeddiagnostiske buffer pH-værdi er korrekt (pH 8.3). Udarbejde nye løsninger, hvis problemet fortsætter (især MEA). Tjek altid, JOHANNAS kollimatoren er på (JOHANNAS u_HP). Med begrænset laser power, at opnå ordentlig blinker kan være udfordrende (på og slukker satser samt dye lysstyrke afhænger af laser power, som beskrevet i van de Linde mfl11). Andre farvestoffer som Alexa488 eller Atto488 kan udforskes hvis mere magt af excitation laser er tilgængelig14.

Hvis fluorophores op med at blinke inden udgangen af de 40 000 rammer, ændre den billeddiagnostiske buffer, som måske er blevet oxideret. Kontroller, at der er ingen luftbobler mellem bufferen og låget efter buffer ændringen. Forseglede prøver kan være afbildet i et par timer i en rå.

Hvis STORM film er erhvervet på en regelmæssig JOHANNAS mikroskop udstyret med en EMCCD, er det muligt at bruge tordenvejr24 for at rekonstruere billederne. Lignende indstillinger er tilgængelige for afdrift korrektion, billede filtrering og image rendering. Tordenvejr er en plugin, der anvendes med Fiji/imageJ software. Lignende resultater blev opnået med fabrikanten software og tordenvejr (figur 6).

BARNESENG (cyclooctatetraene) kan føjes til den billeddiagnostiske buffer til at forbedre lokalisering præcisionen af enkelt molekyler. Det øger antallet af fotoner, der udsendes pr. cyklus for Alexa64725. En bedre lokalisering præcision var faktisk observerede (ned til 6 nm) når tilføjer 2 mM barneseng til STORM buffer beskrevet i trin 5 eller med 100 mM MEA som beskrevet i henvisning25. Men i disse betingelser, antallet af lyse molekyler under erhvervelse falder meget hurtigere end uden barneseng, begrænse det samlede antal molekyle lokaliseringer for enden af erhvervelse og potentielt fører til manglende prøveudtagning af hvis netværket. Andre billeddiagnostiske buffere blev rapporteret til at arbejde godt sammen med Alexa farvestoffer, for eksempel med laktase og oxyrase som ilt scavenging system26. I denne protokol, vi rapportere buffer sammensætning, som gav de bedste resultater på sigt af beslutningsforslag for vores type af prøver og imaging sat op, men hver prøvetype kræver buffer optimering, ud over mærkning og fiksering betingelser optimering.

Begrænsninger af metoden og mulige forbedringer

Den metode, der præsenteres her er begrænset til faste celler og 2D-billeder. Brug en standard imaging sæt op med en JOHANNAS mikroskop og en EMCCD, den mest begrænsende faktor var laser beføjelser (100 mW for 561 nm laser var ikke tilstrækkeligt til at gøre Alexa555 farvestoffer blink). En 532-nm laser linje kan være mere effektive til at vække disse farvestoffer. En eventuel forbedring af metoden ville være at udføre 3D dSTORM ved hjælp af optisk bygningsfejl27. Dette ville kræve minimal ændring af protokollen, bortset fra en lavere mærkning tæthed og en øget stelnummer. 3D dobbelt farve STORM billede ville give en bedre visning af IFs svøbt omkring mikrotubuli, især i bundter. Bemærk at actin filamenter kan også observeres ved hjælp af metoden samme fiksering og en optimeret mængden af fluorescerende phalloidin8. 3 farve STORM kan bruges til at overholde organisation af de tre cytoskeletal delsystemer.

Ved hjælp af primære og sekundære antistoffer øger størrelsen på genstand for interesse, da den sekundære antistof er lokaliseret op til 20 nm fra målet. Typisk, en 25-nm diameter mikrotubulus vil have en bredde af ~ 50 nm efter mærkning. Én mulighed for at forbedre afstanden mellem mål og farvestoffet er direkte mærke de primære antistoffer med passende farvestoffer. Ideelt set bør nanobodies mærket med organiske farvestoffer brugt28.

Vi give her blot en enkel metode til at estimere den gennemsnitlige lokalisering præcision af et enkelt molekyle efter Endesfelder mfl22. Den samlede opløsning af billederne, der tager højde for både lokalisering præcision og mærkning tæthed, kan også måles ved hjælp af Fourier Ring korrelation tilgang29.

Vedrørende kanal registrering er det vanskeligt at overlejre perfekt alle perlerne i synsfeltet. En mere kompleks korrektion kan findes i Chazeau mfl 12.

Begrænsninger som følge af den blinkende af fluorophores og blegning af sonderne kan overvindes ved hjælp af DNA-PAINT (DNA point akkumulering for billeddannelse i nanoskala topografi)30. I denne metode, er den blinker nødvendige for enkelt molekyle lokalisering lavet af forbigående binding af kort-dye-mærket oligonukleotider til deres supplerende mål.

Konklusion

Denne artikel præsenterer et robust protokol for at udføre tofarvet dSTORM imaging i 2 dimensioner af cytoskeletal filamenter i faste celler. De eksperimentelle betingelser, der blev fundet optimale med hensyn til fiksering, immunolabeling og imaging buffer for vores prøvetypen er beskrevet i detaljer. Derefter processen med rå dataopsamling og typen af blinkende billeder, der skal registreres (molekyle tæthed, signal / støjforhold, fluorophore duty cycle osv) er præsenteret samt hvordan at rekonstruere dSTORM billeder, korrekt drift og filtrere data. Disse trin er generiske for dual-farve dSTORM imaging og prøve ikke type specifikke. Endelig er det vist, hvordan denne teknik hjælper med at løse den tætte organisation af de to koblede cytoskeletal net.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Mickael Lelek, Orestis Faklaris og Nicolas Bourg nemlig givtig diskussion, Andrey Aristov og Elena Rensen til hjælp med super-opløsning teknik og Shailaja Seetharaman for grundig gennemlæsning af manuskriptet. Vi parlamentsarbejdet UtechS fotoniske BioImaging (Imagopole) Citech af Institut Pasteur (Paris, Frankrig) samt Frankrig-BioImaging infrastruktur-netværk understøttes af det franske nationale forskning agentur (ANR-10-INSB-04; Investeringer i fremtiden), og Région Ile-de-France (program Domaine d'Intérêt Majeursøen-Malinf) for brug af Elyra mikroskop. Dette arbejde blev støttet af den franske National forskning agentur (ANR-16-CE13-0019) og Ligue Contre le Cancer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 133 mellemliggende filamenter vimentin mikrotubulus STORM super-resolution mikroskopi cytoskelet
Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S.… More

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter