Summary
Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.
Abstract
Pilzinfektionen sind in den letzten Jahrzehnten eine wichtige medizinische Voraussetzung geworden, aber die Anzahl der verfügbaren Antimykotika ist begrenzt. In diesem Szenario ist die Suche nach neuen Antimykotika notwendig. Das Protokoll berichtet hier beschreibt eine Methode, um Bildschirm Peptide für ihre antimykotischen Eigenschaften. Es basiert auf der Microdilution-Empfindlichkeitstest Brühe aus den Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen an der Erforschung der antimikrobielle Peptide als potenzielle neue Antimykotika. Dieses Protokoll beschreibt einen funktionelle Assay zur Beurteilung der Aktivität von Antimykotika Verbindungen und kann leicht geändert werden, um einer bestimmten Klasse von Molekülen unter Untersuchung zu entsprechen. Da die Assays in 96-Well-Platten mit kleinen Volumina durchgeführt werden, kann eine großangelegte Screening in kürzester Zeit abgeschlossen werden, vor allem, wenn in einer Automatisierung durchgeführt. Dieses Verfahren wird veranschaulicht, wie ein standardisierte und einstellbare klinisches Protokoll die Bank-Arbeit Verfolgung neuer Moleküle, die Therapie von Pilzerkrankungen zu verbessern helfen kann.
Introduction
Pilzinfektionen sind geworden ein wichtiges medizinisches Anliegen in den letzten Jahrzehnten haben erheblich zugenommen, vor allem auf einen Anstieg der Zahl von immungeschwächten Personen wie diejenigen in der Krebsbehandlung und Menschen mit HIV/AIDS oder transplantierten Organe1,2. Jedoch beitragen eine sehr begrenzte Auswahl an verfügbaren Antimykotika und die zunehmende Zahl von Berichten über Pilzresistenz dazu zu den großen Problemen bezüglich der Therapie der systemischen Mykosen3.
Eine potenzielle Quelle für neue antimykotische Substanzen sind antimikrobielle Peptide (AMPs), kleine kationischen Peptide, die von vielen Organismen als Bestandteil ihrer angeborenen Immunantwort auf eine Infektion4produziert. Die Screening-Methode, diese Verbindungen gegen Pilzerreger zu testen ist jedoch nicht standardisiert. Verschiedene Verfahren wurden zur antimykotische Aktivität des AMPs, manchmal für das gleiche Modell Mikroorganismus5,6,7zu beurteilen. Diese Unterschiede und den Mangel an Details in einigen Protokollen erschweren Vergleiche zwischen Verbindungen und behindert Reproduzierbarkeit.
Eine Möglichkeit, die Prüfung von neuen Medikamenten-Kandidaten zu standardisieren soll pilzbefallverhütende Anfälligkeit in klinischen Umgebungen, wie z. B. die klinische Definition verwendet und Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 Leitlinien folgen. Jedoch diese antimykotische Sensitivitätstests sind zu restriktiv, und nehmen nicht in Betracht-Variante im Stoffwechsel über Arten, da sie nur für wenige ausgewählte Agenten errichtet wurden. Zum Beispiel nehmen sie nicht zu berücksichtigen die metabolischen Bedürfnisse nicht gärenden Hefen.
Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Tätigkeit des Interessenten antimykotische Substanzen und hier für die Suche nach antimykotische Peptide eingeführt. Es basiert auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest aus der CLSI M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen, die das Screening von neuen Verbindungen8,9zu optimieren. Diese Änderungen ermöglichen den Einsatz von geringen Mengen an Substanz, Temperatur- oder erste Inokulum und verschiedene Medien für ein optimales Wachstum der Pretest, während die Ergebnisse anhand von Referenz-Antimykotika als Steuerelemente Standardisierung. Diese Methode, mit der Verwendung von Multi-gut Kultur Platten ermöglicht es schnell und zuverlässig eine große Anzahl von Verbindungen auf den Bildschirm.
Aufgrund seiner Flexibilität kann dieses Protokoll mit unterschiedlichen chemischen Klassen von Verbindungen und gegen andere Mikroorganismen, mit wenigen Anpassungen verwendet werden.
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Protocol
(1) Lösungen und Medien
- Bereiten Sie 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sabouraud-Dextrose-Bouillon und Sabouraud-Dextrose-Agar nach Tabelle 1.
(2) Pilz Inokulum Wachstumsbedingungen
- Speichern Sie alle Pilzstämmen als gefrorene Bestände in 35 % Glycerin bei-80 ° C, bis benötigt.
- Führen Sie die folgenden Schritte vor jedem Experiment.
- Für Candida Albicans -Stämme:
- Ein Lager Fläschchen Auftauen und 200 µL bis 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Bouillon in einem sterilen 50 mL Polypropylen-Rohr mit einer Kappe und Kultur über Nacht bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min) zu übertragen. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung der Kultur.
- Für Cryptococcus Neoformans Stämme:
- Kratzen Sie die Eisfläche des ein Lager Fläschchen. Die Zellen auf Sabouraud-Dextrose-Agar-Platten Teller und inkubieren Sie für 48 h bei 30 ° C. Halten Sie nach sichtbares Wachstum der isolierten Kolonien die Platten in den Kühlschrank (4 ° C) für bis zu 15 Tage mit Paraffin Film versiegelt.
- Eine mittlere isolierte Kolonie von der Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder sterilen Impfkeimen Schleife zu sammeln und 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Brühe in einem sterilen 50 mL konische Röhrchen zu impfen. Inkubieren Sie für ca. 24 h bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min).
- Überschreiten Sie die 24 h Inkubation nicht. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung. Es ist immer gut, die Wachstumsphase der Zellen vor jedem Test zu standardisieren, da dies ein wichtiger Faktor Antibiotikaresistenzen.
Hinweis: Beide Pilze wurden bei 30 ° C für die rasche Vermehrung in unseren Experimenten angebaut, aber die Temperatur kann geändert werden, um die Ziele der Studie, zum Beispiel klinische Behandlung (37 ° C). Am wichtigsten ist, sollte dieser erste Inkubationszeit im Voraus für jeden Pilz Isolat eingerichtet und erhalten während der Tests auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Für Candida Albicans -Stämme:
- Nach Pilzwachstum sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren die konische Rohre bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und 10 mL PBS.
- Die Zellen und die Zentrifuge bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur wieder aufzuwirbeln.
- Wiederholen Sie die PBS waschen und Zentrifugation noch zweimal. Nach der dritten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 5 mL (entsprechend der Größe der Pellets) 2 X RPMI-1640 Medium.
- 1 mL einer Verdünnung 1: 100 oder 1:1,000 in einem Microcentrifuge Schlauch (abhängig von der Trübung der Zellsuspension) vorzubereiten.
- Aliquoten 10 µL dieser Verdünnung, legen Sie sie in einer Hemocytometer-Kammer und die totale Anzahl der Zellen in den vier Quadranten unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Konzentration durch die Formel: (total Zelle Nummer/4) x Verdünnung Faktor X 104 (Kammer Verdünnung konstant).
- Sollte eine 100 % Rentabilität Rentabilität zählt und Wachstum Bedingungen für das Isolat untersucht systematisch korreliert haben.
Hinweis: Die Standardisierung und Qualitätssicherung der Lebensfähigkeit zählt können durch Rücken-Plating in Übereinstimmung mit den Europäischen Ausschuss für antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) antimykotische minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Methode für Hefen10 erfolgen . - Wenn die Wachstum/Lebensfähigkeit Korrelation nicht für das Isolat unter Studie nachgewiesen, Messen Sie die pilzartige Lebensfähigkeit durch lebende Zellen in einem Hemocytometer mit Hilfe der Farbstoffe, die selektiv abgestorbene Zellen, wie z. B. Phloxine B11, Trypan Blau Farbe zählen 12, oder Janus Grün13. Verwenden Sie die Pilzzellen für dieses Protokoll nur, wenn die Lebensfähigkeit der Bevölkerung zu diesem Zeitpunkt 90 % oder höher.
Hinweis: Tot/lebendig Farbstoffe funktionieren nicht gut mit dem Pilz der Wahl. Bitte testen sie vor dem Gebrauch. Beispielsweise funktioniert die Trypan blau färben nicht gut mit C. Neoformans.
- Sollte eine 100 % Rentabilität Rentabilität zählt und Wachstum Bedingungen für das Isolat untersucht systematisch korreliert haben.
- Danach bereiten die Zellsuspensionen in 2 X RPMI-1640-Mittel (2 X angepasst Inokulum in RPMI-1640 Medium). 96-Well Platten sollten Sie ein Volumen von 5 mL für jede Platte.
- Bereiten Sie alle C. Albicans Stämme ein Lager Zellsuspension von 4 x 103 Zellen/mL. Diese Konzentration ist 2 X der letzte Zelle Konzentration in jede Vertiefung (2 x 103 Zellen/mL).
- C. Neoformans Stämme Vorbereitung einer Aktie Kultur von Zellen 2 x 104 Zellen/mL. Diese Konzentration ist zweimal die endgültige Zellkonzentration in jede Vertiefung (1 x 104 Zellen/mL).
- Andere Pilze-test eine bekannte Antimykotika, welche Konzentration ideal für die besondere Untersuchung in Bezug auf die Inkubationszeit werden. Berücksichtigen Sie Stoffwechsel und die doppelte Zeit des Pilzes.
(3) Peptide (unbekannter Agent)
- Die gefriergetrockneten Peptide bei-20 ° C zu speichern und in entionisiertem Wasser vor jedem Experiment auflösen. Die maximale Speicherdauer einmal in Wasser aufgelöst hängt von der Art der jedes Peptid.
- Bereiten Sie Aliquote zweimal die höchste Endkonzentration im Test (2 X) getestet. Im Idealfall bereiten Sie eine kleine Anzahl von aliquoten mit genügend Peptid für einmaligen Gebrauch, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
Hinweis: Die Wahl der Konzentration sollte auf Literatur und die Eigenschaften des Peptids beruhen. Es wird empfohlen, die serielle Verdünnungen mit ca. 100 µM des Peptids, starten und dann verringern oder erhöhen diese Konzentrationsbereich abhängig von den erzielten Ergebnissen.
(4) Referenz Antimykotika (Positivkontrolle)
- Für diejenigen mit Wasser verdünnt: bereiten Sie eine 2 X Lösung der höchsten Konzentration der Analyse (siehe Abschnitt 5: antimykotische Assay für die Verdünnung Schritte).
- C. Albicans Stämme Vorbereitung einer Lösung aus 128 µg/mL von Fluconazol oder 128 µg/mL Caspofungin. Die Platte Konzentration für beide werden 64 µg/mL.
- Bereiten Sie für C. Neoformans Stämme eine Lösung von 32 µg/mL Amphotericin B (wasserlösliche Lösung). Die Platte Konzentration werden 16 µg/mL.
Hinweis: Normalerweise wird Amphotericin B verdünnt in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), da dieser Anti-Pilz schlecht löslich in Wasser. Allerdings gibt es wasserlösliche Amphotericin B Präparate im Handel erhältlich.
- Für Antimykotika in einem organischen Lösungsmittel verdünnt: Vorbereiten einer 100 X Stammlösung in DMSO, dann bis 10 X im Wasser für den Gebrauch zu verdünnen.
Hinweis: Dadurch wird im Brunnen, die Endkonzentration von DMSO 1 % nicht überschreiten. Ein Brunnen, wo der Pilz in Medien mit 1 % DMSO wächst als Kontrolle erforderlich ist, angesichts der Tatsache, dass einige Pilze diese Konzentration des Lösungsmittels nicht gut vertragen. Denken Sie daran, dass DMSO lichtempfindlich ist, also die Platte mit Folie abdecken oder legen Sie sie in eine dunkle Kammer für die Dauer der Inkubationszeit.
5. antimykotische Assay
Hinweis: In-vitro- antimykotische Assays sind basierend auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest von Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit einigen Änderungen durchgeführt.
- Bereiten Sie eine zweifache serielle Verdünnung jedes Peptid und Steuern Sie Antimykotika in Polystyrol 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 50 µL.
- Mit einer Pipette 100 µL Antimykotika/Peptid in der 2 X-Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in Spalten 1-3, in Zeile A. hinzufügen
- Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL steriles Wasser in die andere Vertiefungen, in Reihen B bis H.
- 50 µL der Brunnen mit der höchsten Konzentration (Reihe A) zu entfernen, an der nächsten gut des nächsten Concentration (Zeile B) übertragen und homogenisieren.
- Wiederholen Sie die Schritte bis zu den Brunnen mit der niedrigsten Konzentration und verwerfen Sie 50 µL des Brunnens (Reihe H) zu. Lassen Sie Spalten 11 und 12 (Reihen A, B, C) mit nur Wasser für Blindkontrolle oder negativ/Wachstumskontrolle.
- Fügen Sie 50 µL 2 X eingestellte Inokulum in RPMI-1640 Medium in jede Vertiefung (Spalten 1 bis 3 und Spalte 11 (negativ/Wachstumskontrolle)); die Endkonzentration für C. Albicans werden 2 x 103 Zellen/mL und die Endkonzentration für C. Neoformans Stämme 104 Zellen/mL werden.
- Bereiten Sie leere Kontrollen (50 µL Wasser + 50 µL 2 X RPMI-1640 Medium ohne Zellen) und negativ/Wachstumskontrolle (50 µL Wasser + 50 µL eingestellt Inokulum 2 X RPMI-1640 Medium ohne Antimykotika) und Last in der well-Platte wie beschrieben oben.
- Wiederholen Sie die Prozedur für jede Verbindung getestet werden und die gewählten antimykotische Kontrolle (Spalten 4-10).
Hinweis: Die serielle Verdünnungen können vertikal durchgeführt werden, als das Experiment unten oder horizontal in der Platte (d. h. wenn die Anzahl der Verdünnungen der gegebenen Verbindung /-Extrakt, der muss getestet werden acht oder mehr).- Wenn die Verbindungen verweisen Drogen oder einer seiner Komponenten sind lichtempfindlich, führen Sie den Test in reduziertes Licht, die Platten mit Folie abdecken oder legen Sie in eine dunkle Kammer während Inkubationen.
- Beachten Sie die folgenden optionalen Empfehlungen.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer klaren Abdeckplatte, die Gasaustausch, ermöglicht, wie diese Verdunstung reduziert.
- Legen Sie die Platte in eine feuchte Kammer; Es hilft auch, die Verdunstung zu reduzieren.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h oder 48 h für alle C. Albicans -Stämme und für 48 h mit 200 u/min schütteln für C. Neoformans. Das untere Endvolumen (100 µL) sorgt dafür, dass keine Spillover auftritt.
Hinweis: Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen MIC Lesungen bei 24 h und 48 h für C. Albicans -Stämme beobachtet. Lesungen in 48 h sind jedoch einfacher zu visualisieren. - Beobachten Sie alle Brunnen, mit Hilfe von einem umgekehrten optischen Mikroskop vor der Inkubationszeit und nach Änderungen in der Morphologie als auch auf Anzeichen von Kontamination zu überprüfen überprüft.
Hinweis: Lesungen können visuell gemacht und fotografiert am Ende des Experiments. Vor jeder Lesung leicht homogenisieren der Plattenrandes. Das liest können auch durchgeführt werden, durch die Messung der OD bei 600 nm, wenn Zelle Klumpen oder Filamentierung nicht eingehalten werden. - Durchführen Sie die Experimente, mindestens dreimal an gesonderten Terminen.
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Representative Results
Das MIC ist definiert als die niedrigste antimikrobielle Compoundkonzentration, die vollständig sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit hemmt. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle Methode, um potentielle Antimykotika Bildschirm haben, jeder Brunnen mit klaren Medien ähnlich wie die leeren Brunnen ein positives Ergebnis gilt während jeder mit Trübung analog zu den negativen/Wachstum-Kontroll-Vertiefungen gut als negativ bewertet. Allerdings besteht ein Interesse daran, ob ein gegebener AMP fungistatisch oder Fungizide, können die Medien von der positiven Vertiefungen auch vergoldet auf Sabouraud-Dextrose-Agar oder von einem anderen Rentabilitätsprüfung überprüft.
Angesichts der Tatsache, dass der Mechanismus der Wirkung eines Romans zusammengesetzte unbekannt ist, ist es daher wichtig zu überprüfen, ob die Referenz-Antimykotika innerhalb des erwarteten Bereichs fällt, für den Pilz (Check offizielle Richtlinien, Tabellen oder Daten in der Literatur) vor der Überprüfung isolieren die getestete MIC für die Verbindung (in diesem Fall, ein AMP; Abbildung 1 und Abbildung 2), zu bestätigen, dass die Bedingungen ideal sind. Wenn es nicht im Bereich von angesehenen fällt, muss das Experiment erneut ausführen, da es unmöglich sein wird, festzustellen, ob alle Änderungen beobachtet ausschließlich auf die getestete Substanz zurückzuführen sind. Es ist ebenso entscheidend für alle Brunnen unter einem optischen Mikroskop zu beobachten, vor und nach der Inkubationszeit für Veränderungen in der Morphologie und Verschmutzung überprüfen.
Abbildung 1. Bewertung der antimykotische Aktivität für drei Peptide gegen Cryptococcus Neoformansmit Brühe Microdilution Assay. Pilz-Konzentration ist bei 1 x 104 Zellen/mL. Drei Peptide wurden getestet (AMP1, Spalten 1 bis 3; AMP2, Spalten 5 bis 7; AMP3, Spalten 8 bis 10) mit Konzentrationen von 100 µM (Reihe A) bis hin zu 0,78 µM (Reihe H). Wachstumskontrolle und Blank sind in den Spalten 11 und 12, beziehungsweise. Das Bild wurde nach 48 h Inkubation mit einer Digitalkamera aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Bewertung der antimykotische Aktivität für drei Peptide gegen Candida Albicans mit Brühe Microdilution Assay. Pilz-Konzentration ist bei 2 x 103 Zellen/mL. Drei Peptide wurden getestet (AMP1, Spalten 1 bis 3; AMP2, Spalten 4 bis 6; AMP3, Spalten 7 bis 9) mit Konzentrationen von 100 µM (Reihe A) bis hin zu 0,78 µM (Reihe H). Wachstumskontrolle und Blank wurden in den Test einbezogen, aber werden nicht auf dem Foto angezeigt. Das Bild wurde nach 48 h Inkubation mit einer Digitalkamera aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2, ist 48 h genug Zeit, positive und negative Brunnen für C. Neoformans und C. Albicansvisuell zu unterscheiden. Es ist bemerkenswert, dass die Ergebnisse für C. Neoformans 24 h erzielt wurden früher als nach den Richtlinien des CSLI ohne Modifikationen. Für jede dreifacher Ausfertigung, die positiven und negativen gut und daher das Mikro für jede Verbindung sind leicht erkennbar. Dies ermöglicht eine schnelle Bestimmung der MIC für mehrere Verbindungen sowie für die Wahl welche Moleküle Verdienst weiteren Untersuchungen. Unterdessen zeigt Abbildung 3 ein schlechtes Ergebnis, wahrscheinlich aus unsachgemäßer Pipettieren während der Verdünnungsschritt. Dies kann in Spalte 5, Reihe C, beobachtet werden, wo ein Unterschied in C. Neoformans Wachstum über Wiederholungen (Spalten 5 bis 7) vorhanden ist.
Abbildung 3. Beispiel für einen Fehler in technischen repliziert in eine serielle Verdünnung Assay. Das Bild zeigt eine serielle Verdünnung des AMPs von 100 µM (Reihe A) bis hin zu 0,78 µM (Reihe H). C. Neoformans Wachstum unterscheiden zwischen Wiederholungen in den Spalten 5-7, Reihe C, höchstwahrscheinlich aufgrund Pipettieren Fehler bei Verdünnung Vorbereitung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Für die Auslegung der Platten in Abbildung 1 ist ein Antimykotikum Assay für drei verschiedene AMPs gegen C. Neoformans, gelegen an Spalten 1-3 für AMP1 und Spalten 5 bis 7 für AMP2 Spalten 8-10 für AMP3 mit Konzentrationen von 100 µ M (Reihe A) bis 0,78 µM (Reihe H). Negativ/Wachstumskontrolle war in Spalte 11 Zeilen A bis C, gesetzt, während die Blindkontrolle in Spalte 12, Zeilen A bis C. gesetzt wurde Für AMP1 (Spalten 1-3, Zeilen A-C) und AMP2 (5-7 Spalten, Zeilen A-D), wächst beachten Sie, dass bei einer höheren Konzentration der Medien transparent und es gibt keine sichtbar. Im Gegensatz dazu bei niedrigeren Konzentrationen der Brunnen sind undurchsichtig (Spalten 1-3, D-H und Spalten Zeilen 5 bis 7 Zeilen E-H). Daher gilt die Reihe C enthalten die MIC für AMP1, während das Mikrofon für AMP2 in Reihe D, d. h. 25 µM und 12,5 µM bzw. ist. AMP3 müssen neu bewertet werden, wie der Pilz in allen Konzentrationen getestet wuchs. Die Überprüfung für AMP3 ist notwendig, die Ursache sein könnte, dass das Prüfmedium ist die antimykotische Aktivität der Gummimischung, mikrobielle Kontamination stören, oder eine höhere Resistenz des Pilzes an den Agent getestet. Für die letzte Möglichkeit werden muss zur Erhöhung der Konzentration Reichweite getestet. Wie festgestellt, die keine-Hemmung und Kontrolle Brunnen sind homogen, sie auch durch OD Messung bei 600 bewerten zu können nm.
Wie Abbildung 2wurden drei verschiedene Peptide gegen C. Albicansgetestet. Die Mikrofone für AMP1 (Spalten 1-3), AMP2 (Spalten 4 bis 6) und AMP3 (Spalten 7 bis 9) wurden 50 µM, 6 µM und 25 µM bzw.. C. Albicans, kann aufgrund von Filamentierung in die Inkubationstemperatur in Klumpen in der keine-Hemmung und Kontrolle Brunnen OD Referenzmessung für das Lesen erschwert beobachtet werden.
Manchmal wird kein Wachstum in den Vertiefungen beobachtet. Dies ist möglicherweise aufgrund einer Toxin-Kontamination in den Medien (in diesem Fall das Wachstum steuert auch kein Wachstum zeigen) oder einer höheren Anfälligkeit für den Agent (in diesem Fall, die Wachstum Steuerelemente zeigen Wachstum). Dementsprechend kann für diesen Fall eine Abnahme im Konzentrationsbereich erforderlich sein.
| Medium | Vorbereitung | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (ergänzt mit L-Glutamin und Phenol rot; ohne Bicarbonat) | |
| 330 mM 3-(N- Morpholino) Propan Sulfonsäure (MOPS) | ||
| Anpassen auf pH 7,0 mit NaOH | ||
| Sterilisieren Sie durch Filtration (0,22 µM Filter) | ||
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoklaven bei 121° C für 15 Minuten. | ||
| Sabouraud-Dextrose-Bouillon | 15 g Pulver in 500 mL destilliertem Wasser. | |
| Auf pH 7,0 mit NaOH einstellen | ||
| Autoklaven bei 121° C für 15 Minuten. | ||
| Sabouraud-Dextrose-Agar | 32,5 g Pulver in 500 mL destilliertem Wasser. | |
| Auf pH 7,0 mit NaOH einstellen | ||
| Autoklaven bei 121° C für 15 Minuten. | ||
Tabelle 1. Medien und Reagenz Vorbereitung.
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Discussion
Microdilution Tests können potenzielle antimykotische Aktivität der Zielsubstanz mit kleinen Mengen der Substanz zu analysieren und gleichzeitig testen Sie es in den unterschiedlichsten Konzentrationen. Dementsprechend wird dieses Protokoll als ersten Schritt im Screening für potenzielle neue antimykotische Substanzen empfohlen. Die hier vorgestellten Protokoll basiert auf der M27-A3 Protokoll, ursprünglich entwickelt, um Hilfe bei der Auswahl der antimykotischen Therapie in Kliniken, und lässt sich eine Vielzahl neuer antimykotische Behandlung anpassen. Insgesamt kann dieses Protokoll auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Extraktes oder zusammengesetzte konzentrieren. Beispielsweise kann ein potenzieller Kandidat im Test fälschlicherweise unwirksam angezeigt, da eine Verbindung in den Medien seine Wechselwirkung mit der Pilzzelle, wie die Wirkung von RPMI auf Histatin 514blockieren kann. In diesem Fall ist eine Alternative Medium für wenn die RPMI stört, Hefe Stickstoff Basis (YNB) Puffer mit MOPS pH 715.
Das Protokoll erlaubt auch Modifikationen in Pre Wachstumsbedingungen, Inokulum Konzentration, Inkubationstemperatur und für lichtempfindliche Bauteile, solange die Referenz antimykotische Ergebnisse im Bereich Richtlinien sind. Die Referenz-Antimykotika sollten auf die aktuelle Therapie für die getesteten Pilzarten beruhen. Darüber hinaus gibt es ein Verweis zusammengesetzte potenziellen Medikaments – z. B., ein bekannter antimikrobiellen Peptid mit antimykotische Aktivität gegen das getestete Modell Pilz in der Natur ähnlich – es sollte als eine weitere Referenz-Steuerelement verwendet werden.
Pre-Wachstumsbedingungen können geändert werden, um die Pilze zu entsprechen und Forschung muss. Wie im Protokoll wurden bei 30 ° C für bessere Verbreitung, C. Neoformans und C. Albicans angebaut. Dennoch kann diese Temperatur geändert werden, abhängig von den Stoffwechsel der Pilze: z. B. Paracoccidioides Brasiliensis erfordert Wachstum bei 37 ° C, die Hefe-Form beizubehalten, und aufgrund seiner langsamen Vervielfältigung, für 5-7 Tage angebaut werden soll. Daher ist es wichtig zu verstehen, die Pilz-Eigenschaften für die Prüfung eines möglichen neuen Medikaments. Andererseits sollte das Alter und die Phase des Wachstums der verwendeten Zellen nach dem Zweck der einzelnen Studien definiert werden, und vor allem die erste Inkubationszeit sollte vorher eingerichtet und erhalten während der Tests auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten .
Ebenso, wenn die Verbindung/Extrakt, Referenz Antimykotika oder Verdünnungsmittel lichtempfindlich ist, sollten Schritte hinzugefügt werden, um zu verhindern, dass dessen Abbau, wie arbeiten mit weniger Licht, die Platten mit Folie abdecken oder platzieren die Platten in einer dunklen Kammer während Inkubationszeiten.
Darüber hinaus können den Randeffekt und Verdunstung mit Zugabe von Wasser in den leeren Brunnen verringert werden nicht mit den äußeren Brunnen und füllt sie mit Wasser oder indem man die Platte in eine feuchte Kammer.
Eine der wichtigsten Einschränkungen bei Verwendung dieser Methode wird seinen Fokus auf die inhibitorischen Aktivität einer getesteten Verbindung, im Gegensatz zur Unterscheidung zwischen Fungizide oder fungistatische Wirkung. Dennoch, da das Ziel eine schnelle Screening von potenziellen neuen Antimykotika, identifizieren die visuelle Erstprüfung MIC mit eine klare Positive ("Clear/nicht-Trübung" Brunnen) und ein negatives ("Trübung" Brunnen) Ergebnis, hilft Verbindungen des Interesses zu studieren weiter, und damit die Gesamtkosten des Screenings auf neue Verbindungen reduzieren.
Da der Wirkmechanismus dieser neuen Verbindungen unbekannt ist, kann diese dasselbe Protokoll verwendet werden, bestimmen die Verbindung Fähigkeit zu hemmen oder töten Pilzzellen durch Zugabe von ein paar zusätzliche Schritte, wie z. B. Beschichtung der positiven Vertiefungen oder lebenden/Toten Farbstoffen. Andere kleineren Änderungen können hinzugefügt werden, das Protokoll für einen Schachbrett-Titration-Assay verwenden, um Synergie-Effekte der Verbindung mit anderen Drogen zu identifizieren.
Obwohl der Test lesen in der Regel durch visuelle Analyse von Pilzwachstum unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zum Wachstum in den Brunnen mit kein Antimykotikum (negativ/Wachstumskontrolle) durchgeführt wird, es kann auch erfolgen durch Messung seiner OD bei 600 nm. Doch obwohl die OD-Messung für homogene Lösungen genau ist, wachsen einige Pilze in Klumpen, so brechen die Präzision der Methode – z. B., Candida spp. durch Filamentierung während der Inkubationszeit.
Auf der anderen Seite einer der großen Vorteile des Protokolls, die hier beschrieben wird, im Vergleich zu den CLSI M27-A3-Richtlinien ist, dass es Konto Belüftung der Medien für nicht gärenden Pilze, wie berücksichtigt C. Neoformans. Auch der CLSI-Richtlinien verwendet nur eine kleine anfängliche Inokulum, erfordern somit längere Inkubationszeit für Pilzwachstum und MIC-Definition. Einige Studien haben gezeigt, dass höhere Initialen Befallsdruck und schütteln die Platte während der Inkubation die pilzbefallverhütende Anfälligkeit Tests ohne erhebliche Auswirkungen auf MIC Entschlossenheit16,17verbessern. Unser Protokoll bestimmen genau das Mikro für neue Verbindungen gegen C. Neoformans in eine verkürzte Inkubationszeit, innerhalb von 48 h, im Vergleich zu 72 h von CLSI Richtlinien vorgeschlagen.
Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll einer 100 µL Endvolumen statt 200 µL empfohlen von CLSI Leitlinien, wodurch die Menge der getesteten neuen Verbindung erforderlich für die antimykotische Assay verwendet. Verdunstung von externen Brunnen kann ein Anliegen sein, jedoch bereits in diesem Abschnitt, um die Verdunstung zu reduzieren beschriebene Lösungen verwendet werden, ohne Kompromisse bei der Untersuchungsergebnisse.
Darüber hinaus können durch Ausführen der Verdünnungen direkt in der Platte und somit unter Umgehung der CLSI Verdünnung Richtlinien Mikrozentrifugenröhrchen verwenden, Mehrkanal-Pipetten verwendet werden. Dieses Protokoll Versammlung ist weniger kompliziert als die in der CLSI-Richtlinien und auch weniger Material verwendet.
Ein entscheidender Schritt im Zusammenhang mit Pilzzelle Vorbereitung ist die Verwendung von Zellen, die so frisch wie möglich sind. Es ist auch entscheidend für die Assays mit den Zellen in der gleichen Wachstumsphase durchzuführen, da gibt es mehrere Berichte in der Literatur über die Unterschiede bei der pilzbefallverhütende Anfälligkeit bei die Kultur im Alter von18,19. Eine sorgfältige Auswahl der Referenzstämme ist auch wichtig. Sehr empfindlichen oder selten isolierten Arten produzieren vielleicht kein klares Bild über die antimykotische Potenzial. Aus dem gleichen Grund ist es hilfreich, Sub-Kultivierung Schritte nicht viele Variablen hinzufügen des Tests zu vermeiden. Zum Beispiel für Candida-Stämme (die schneller wachsen), möchten wir den Agar-Platte-Schritt zu umgehen, indem man das Inokulum direkt in flüssigen Medien.
Beachten Sie, dass die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Extraktes oder zusammengesetzte getestet werden müssen berücksichtigt werden. Zum Beispiel wenn Extrakt oder zusammengesetzte Bedürfnisse in Lösungsmitteln als Wasser aufgelöst werden müssen dafür sorgen, die eine entsprechende Pilzwachstum Kontrolle enthält, die der gleichen Lösemittelkonzentration mit dem Pilz allein. Dies soll garantieren, dass Wachstumshemmung beobachtet nicht aufgrund des Lösungsmittels anstelle der getesteten Verbindung oder extrahieren. In diesem Fall, es könnte besser sein, der CLSI-M27A3 Empfehlungen für DMSO verdünnt Antimykotika, wie z. B. die Auflösung der Droge in einer Konzentration von mindestens 100-Mal höher als die höchste geprüfte Konzentration reduzieren den Anteil der Lösungsmittel in der Platte.
Was die Stabilität empfiehlt es sich, kleine Aliquote des untersuchten Extrakte oder Verbindungen zu halten. Durch die Speicherung des Volumens notwendig für ein einzelnes assay bei der entsprechenden Temperatur, übermäßige Manipulation der aliquoten und wenn die Extrakte oder Verbindungen eingefroren gespeichert werden, Frost-Tau-Wechseln vermieden werden können.
Schließlich ist eines der grundlegendsten Schritte die Genauigkeit der Mikrotestplatte serielle Verdünnung, angesichts der Tatsache, dass Pipettier Fehler entlang der aufeinander folgenden Verdünnungen propagiert wird. Von nun an stehen die Pipette Präzision und richtiges Pipettieren Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Also, ist es unerlässlich, um Gebrauch kalibriert Pipetten und immer, dass Überprüfung wenn das Volumen hinzufügen und von jedem Bohrloch entfernen korrekt ist. Stellen Sie sicher, dass Rückstände oder Überbleibsel aus dem Drogenhandel nicht in die Pipettenspitze bleibt. Wenn die Verbindung dazu neigt, an der Spitze zu halten, könnte es besser Tipps zwischen die Verdünnungen zu wechseln sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Kaps-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF für finanzielle Unterstützung. Wir sind dankbar, Dr. Hugo Costa Paes für das Manuskript überarbeiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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