Summary
En enkel og tilpasningsdyktig kjøttkraft microdilution metode for screening soppdrepende forbindelser og ekstrakter.
Abstract
Fungal infeksjoner er blitt en viktig medisinsk tilstand i de siste tiårene, men antall tilgjengelige antifungal medisiner er begrenset. I dette scenariet er etter nye antifungal medisiner nødvendig. Protokollen rapporterte her viser en metode for skjermen peptider for sine soppdrepende egenskaper. Den er basert på kjøttkraft microdilution mottakelighet test fra kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 retningslinjer med modifikasjoner for forskning antimikrobielle peptider som potensielle nye antifungals. Dette beskriver en funksjonell analyse for å vurdere aktiviteten til soppdrepende forbindelser og kan enkelt endres for å passe en bestemt klasse av molekyler under etterforskning. Siden analyser utføres i 96-brønnen plater med små volumer, kan en storstilt screening fullføres på kort tid, spesielt hvis utført i automatisering omgivelser. Denne fremgangsmåten viser hvordan en standardisert og justerbar klinisk protokoll kan hjelpe benk-arbeid jakten på nye molekyler å forbedre behandlingen av fungal sykdommer.
Introduction
Fungal infeksjoner har blitt en medisinsk betydning i de siste tiårene, har betydelig økte hovedsakelig på grunn av en økning i antallet immunsupprimerte personer som gjennomgår behandling og de som lever med HIV/AIDS eller transplantert organer1,2. Men bidra et svært begrenset utvalg av tilgjengelige antifungal medisiner og det økende antallet rapporter om sopp motstand mot dem til store problemer angående therapeutics systemisk mycoses3.
En potensiell kilde til nye soppdrepende forbindelser er antimikrobielle peptider (ampere), små kationisk peptider produseres av mange organismer som en del av deres medfødte immunforsvaret til infeksjon4. Metoden screening teste disse forbindelser mot sopp patogener er likevel ikke standardisert. Forskjellige prosedyrer har blitt brukt til å vurdere soppdrepende aktiviteten til forsterkere, noen ganger for samme modell microorganism5,6,7. Disse forskjellene og mangel på detaljer i noen protokoller komplisere sammenligninger mellom forbindelser og vanskeliggjør reproduserbarhet.
En måte å standardisere testing av nye narkotika kandidater er å følge retningslinjene brukes til å definere soppdrepende mottakelighet i klinisk innstillinger, for eksempel kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 retningslinjer. Men testene soppdrepende følsomhet er for restriktive, og tar ikke hensyn til betraktning variasjon i stoffskiftet tvers av arter, som de bare ble etablert for noen velger agenter. For eksempel tar de ikke hensyn til metabolske behovene til ikke-fermenting gjær.
Denne protokollen gir analysen aktivitet av potensielle soppdrepende forbindelser, og implementeres her for Søk etter soppdrepende peptider. Den er basert på kjøttkraft microdilution mottakelighet test fra CLSI M27-A3 retningslinjer med modifikasjoner som optimaliserer screening av ny forbindelser8,9. Disse endringene tillate bruk av små mengder av sammensatte, variasjoner i temperatur eller første inoculum og ulike medier for optimal pre-test vekst, samtidig standardisere resultatene med bruk av referanse antifungals som kontroller. Denne metoden med bruk av flere godt kultur plater, gjør det mulig å raskt og pålitelig skjermen en rekke forbindelser.
På grunn av iboende fleksibiliteten, kan denne protokollen brukes med forskjellige kjemiske klasser av forbindelser og mot andre mikroorganismer, med noen tilpasninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. løsninger og Media
- Forberede 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, fosfat bufret saltvann (PBS), Sabouraud druesukker buljong og Sabouraud druesukker agar per tabell 1.
2. fungal Inoculum vekst forhold
- Lagre alle fungal stammer frosne aksjer i 35% glyserol ved-80 ° C, inntil nødvendig.
- Utfør følgende trinn før hvert eksperiment.
- For Candida albicans stammer:
- Tine lager ampuller og overføre 200 µL til 10 mL av Sabouraud druesukker kjøttkraft i et sterilt 50 mL polypropylen rør med cap og kultur overnatting på 30 ° C med agitering (200 rpm). Husk å helle røret og la hetten litt åpen for bedre lufting av kulturen.
- For Cryptococcus neoformans stammer:
- Skrape den frosne overflaten på lager ampuller. Plate cellene på Sabouraud druesukker agar tallerkener og Inkuber 48 h på 30 ° C. Etter synlige veksten av isolerte kolonier, holde platene i kjøleskapet (4 ° C) forseglet med parafin film for opptil 15 dager.
- Samle en mellomstore isolert koloni fra platen bruker et sterilt tannpirker eller sterilt vaksinere loop og vaksinere 10 mL av Sabouraud druesukker kjøttkraft i et sterilt 50 mL konisk rør. Inkuber ca 24 h på 30 ° C under omrøring (200 rpm).
- Ikke overstige 24-timers inkubasjon. Husk å helle røret og la hetten litt åpen for bedre lufting. Det er alltid godt å standardisere vekst scenen cellene før hver test, siden dette er en viktig faktor som påvirker resistensutvikling.
Merk: Begge sopp ble dyrket på 30 ° C for rask overføring i vårt forsøk, men temperaturen kan endres for å gjenspeile målene for studien, for eksempel klinisk behandling (37 ° C). Viktigst, skal første inkubasjon nå være etablert på forhånd for hver fungal isolere og opprettholdes alle tester å sikre reproduserbarhet.
- For Candida albicans stammer:
- Etter soppvekst, samle cellene av sentrifugering konisk rørene på 1200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Forkaste nedbryting og tilsett 10 mL PBS.
- Resuspend celler og sentrifuger igjen på 1200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Gjenta PBS vask og sentrifugering to ganger mer. Etter tredje vask, resuspend cellene i 5 mL (ifølge pellet størrelsen) 2 X RPMI-1640 medium.
- Forberede 1 mL av en 1: 100 eller 1:1,000 fortynning i et microcentrifuge rør (avhengig av turbiditet av cellen suspensjon).
- Aliquot 10 µL av dette fortynning, plasserer den i en hemocytometer kammer og telle antall celler i fire hjørne kvadrantene under mikroskopet. Beregn konsentrasjonen formelen: (totalt celle nummer/4) x fortynning faktor x 104 (kammer fortynning konstant).
- Vurdere en 100% levedyktighet hvis levedyktighet teller og vekst forhold har vært systematisk korrelert for isolere blir studert.
Merk: Standardisering og kvalitetskontroll av levedyktighet teller kan gjøres av tilbake-plating i henhold til europeiske komité antimikrobielle mottakelighet Testing (EUCAST) soppdrepende Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) metode for gjær10 . - Hvis vekst/levedyktighet sammenhengen ikke er opprettet for isolere under studien, måle fungal gjennomførbarheten ved å telle levende celler i en hemocytometer ved hjelp av fargestoffer som selektivt farge døde celler, for eksempel phloxine B11, trypan blå 12, eller Janus grønn13. Bruk fungal cellene for denne protokollen bare hvis levedyktigheten til befolkningen på dette punktet er 90% eller høyere.
Merk: Døde/levende fargestoffer fungerer ikke bra med soppen valgfrihet. Prøv dem før bruk. For eksempel fungerer trypan blå fargestoff ikke godt med C. neoformans.
- Vurdere en 100% levedyktighet hvis levedyktighet teller og vekst forhold har vært systematisk korrelert for isolere blir studert.
- Etter at forberede av cellen suspensjon i 2 X RPMI-1640 medium (2 X justert inoculum i RPMI-1640 medium). Vurdere et volum på 5 mL for hver plate 96-brønns plater.
- For alle C. albicans stammer, forberede en lager celle suspensjon av 4 x 103 celler/mL. Denne konsentrasjonen er 2 X av den siste celle konsentrasjonen i hver brønn (2 x 103 celler/mL).
- For C. neoformans stammene, forberede en lager kultur for celler 2 x 104 celler/mL. Denne konsentrasjonen er dobbelt siste celle konsentrasjonen i hver brønn (1 x 104 celler/mL).
- For andre sopp, test med en kjent antifungal som konsentrasjon vil være ideelt for studien i forhold til den inkubasjon tid. Ta metabolisme og duplisering tid av sopp i betraktning.
3. peptider (ukjent Agent)
- Lagre lyofilisert peptidene på 20 ° C og oppløse dem i deionisert vann før hvert eksperiment. Den maksimale tiden når oppløst i vann avhenger av innholdet i hver peptid.
- Forberede dele to ganger den høyeste siste konsentrasjonen testet i analysen (2 X). Ideelt sett forberede et lite antall dele med nok peptid for en gangs bruk å unngå fryse-Tin sykluser.
Merk: Valg av konsentrasjon bør være basert på litteratur og egenskapene for peptid. Det anbefales å starte føljetong fortynninger med omtrent 100 µM av peptid, og deretter redusere eller øke konsentrasjonen området avhengig av fått resultatene.
4. referanse Antifungals (positiv kontroller)
- For de fortynnet i vann: forberede en 2 X løsning av den høyeste konsentrasjonen av analyse (se seksjon 5: soppdrepende analysen for fortynning trinn).
- For C. albicans stammer, forberede en løsning av 128 µg/mL av fluconazole eller 128 µg/mL av caspofungin. Plate konsentrasjonen for begge blir 64 µg/mL.
- For C. neoformans stammene, forberede en løsning av 32 µg/mL av amfotericin B (vannløselige løsning). Plate konsentrasjonen vil være 16 µg/mL.
Merk: Normalt amfotericin B er utvannet i dimethyl sulfoxide (DMSO), siden dette Antifungal er dårlig løselig i vann. Det er imidlertid vannløselige amfotericin B forberedelser kommersielt tilgjengelig.
- For antifungals fortynnet i en organisk løsemiddel: forberede en 100 X lagerløsning i DMSO, så fortynne den 10 X i vann for bruk.
Merk: Dermed i brønnen siste konsentrasjonen av DMSO vil ikke overstige 1%. En brønn hvor soppen vil vokse i mediet som inneholder 1% DMSO kontroll er nødvendig at noen sopp ikke tolererer godt denne konsentrasjonen løsemiddel. Husk at DMSO er lysfølsomme, så dekk platen med folie eller plassere den i en mørk kammer for varigheten av inkubasjonstiden.
5. soppdrepende analysen
Merk: In vitro soppdrepende analyser utføres basert på kjøttkraft microdilution mottakelighet test fra kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 retningslinjene med noen modifikasjoner.
- Forberede en todelt føljetong fortynning av hver peptid og kontrollere antifungal i 96-brønnen polystyren microplates til et endelig antall 50 µL.
- Bruke en pipette legge 100 µL av soppdrepende/peptid i 2 X konsentrasjonen av den høyeste ønsket endelige konsentrasjon i kolonner 1-3, i raden A.
- Bruker en flerkanals pipette, legge til 50 µL av sterilt vann til andre brønnene, i rader B H.
- Fjerne 50 µL av med den høyeste konsentrasjonen (linje A), overføre til neste godt av neste konsentrasjonen (linje B) og homogenize.
- Gjenta trinnene ovenfor til brønnen med den laveste konsentrasjonen og kast 50 µL av denne brønnen (rad H). La kolonner 11 og 12 (rader A, B, C) med bare vann for tom kontroll eller negative/vekst kontroll.
- Legge til 50 µL av 2 X justert inoculum i RPMI-1640 medium i hver brønn (kolonner 1-3 pluss kolonnen 11 (negativ/vekst kontroll)); siste konsentrasjonen for C. albicans vil være 2 x 103 celler/mL, og den endelige konsentrasjonen for C. neoformans stammene vil være 104 celler/mL.
- Forberede tomt kontroller (50 µL vann + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium uten celler) og negative/vekst kontroll (50 µL vann + 50 µL justert inoculum 2 X RPMI-1640 medium uten soppdrepende), og Last inn i godt plate som beskrevet ovenfor.
- Gjenta prosedyren for hver sammensatte skal testes og valgte soppdrepende kontrollen (kolonner 4-10).
Merk: De serielle fortynninger gjøres vertikalt som eksperimentet nedenfor, eller horisontalt i platen (dvs. hvis fortynninger av gitt sammensatte/ekstrakt som trenger å bli testet er åtte eller mer).- Hvis forbindelser, refererer narkotika eller noen av dets komponenter er lysfølsomme, utføre analysen i redusert lys, dekke platene med folie eller sted i en mørk kammer under incubations.
- Vurder følgende valgfrie anbefalinger.
- Forsegle platen med en klar dekselplaten som tillater gassutveksling, som dette reduserer fordamping.
- Plass platen i et fuktig rom; det vil også redusere fordampning.
- Inkuber platene på 37 ° C for 24 h eller 48 timer for alle C. albicans stammer og 48 timer med 200 rpm rister for C. neoformans. Lavere endelige volumet (100 µL) sikrer at ingen ekstra oppstår.
Merk: Ingen signifikant forskjell ble observert mellom MIC målinger på 24 h og 48 h for C. albicans stammer. Likevel er målinger på 48 h lettere å visualisere. - Observere alle brønner, med hjelp av en invertert optisk mikroskop, før inkubasjonstiden og etter for å bekrefte endringer i morfologi også å se etter tegn på forurensning.
Merk: Målingene kan gjort visuelt og fotografert på slutten av eksperimentet. Før hver, homogenize litt platen. Lest kan også utføres ved å måle dens OD på 600 nm, hvis cellen grupperer eller filamentation er ikke observert. - Utføre eksperimenter minst tre ganger på forskjellige datoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MIC er definert som den laveste antimikrobielle sammensatte konsentrasjonen som hemmer helt synlige soppvekst på slutten av inkubasjonstiden. Siden formålet med denne protokollen er å ha en rask metode å skjermen potensielle antifungals, regnes alle godt med klart medier ligner på tom brønnene et positivt resultat, mens noen godt med turbiditet analoge til negative/vekst kontroll brønnene er betraktet som negativt. Men hvis interessert i å vite om en gitt AMP er fungistatic eller sopp, kan media fra positiv brønnene også være belagt på Sabouraud druesukker Agar eller sjekket av en annen levedyktighet test.
Gitt at virkningsmekanismen av en roman sammensatt er ukjent, det er derfor avgjørende å bekrefte hvis referanse soppdrepende ligger innenfor forventet for den fungal isolere (Sjekk offisielle retningslinjer, tabeller eller data i litteratur) før du sjekker den testet mikrofon for sammensatt (i dette tilfellet, en forsterker; Figur 1 og figur 2) å bekrefte at forholdene er ideelle. Hvis det ikke faller innenfor respektert, vil det være nødvendig å kjøre eksperimentet siden det vil være umulig å avgjøre hvis endringer observert forfaller for testet sammensatte. Det er like viktig å observere alle brønnene under en optisk mikroskop før og etter inkubasjonstiden kontroll av endringer i morfologi og forurensning.
Figur 1. Evaluering av soppdrepende aktivitet for tre peptider mot Cryptococcus neoformansmed kjøttkraft microdilution analysen. Sopp konsentrasjonen er på 1 x 104 celler/mL. Tre peptider ble testet (AMP1, kolonner 1 til 3; AMP2, kolonner 5 til 7; AMP3, kolonner 8 til 10) med konsentrasjoner mellom 100 µM (linje A) 0.78 µM (rad H). Vekst kontroll og Tom er i kolonnene 11 og 12, henholdsvis. Bildet ble kjøpt med et digitalt kamera etter 48 timer med inkubering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Evaluering av soppdrepende aktivitet for tre peptider mot Candida albicans med kjøttkraft microdilution analysen. Sopp konsentrasjonen er på 2 x 103 celler/mL. Tre peptider ble testet (AMP1, kolonner 1 til 3; AMP2, kolonner 4 til 6; AMP3, kolonner 7 til 9) med konsentrasjoner mellom 100 µM (linje A) 0.78 µM (rad H). Vekst kontroll og tom ble inkludert i analysen, men vises ikke i bildet. Bildet ble kjøpt med et digitalt kamera etter 48 timer med inkubering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som observert i figur 1 og figur 2, er 48t nok tid å skille positive og negative visuelt både C. neoformans og C. albicans. Det er bemerkelsesverdig at resultatene for C. neoformans ble oppnådd 24 timer tidligere enn under CSLI retningslinjene uten modifikasjoner. For hver tre eksemplarer, positive og negative brønnen, og derfor MIC for hver sammensatte er lett merkbar. Dette gir rask MIC besluttsomhet for flere forbindelser samt for å velge hvilke molekyler fortjener videre undersøkelser. I mellomtiden er Figur 3 et eksempel et dårlig resultat, sannsynlig fra feil pipettering under fortynning trinnet. Dette kan observeres i kolonne 5, rad C, der en aldersforskjell C. neoformans vekst er til stede over replikat (kolonner 5-7).
Figur 3. Eksempel på en feil i tekniske replikeres i en seriell fortynning analysen. Bildet viser en seriell fortynning av forsterkere mellom 100 µM (linje A) 0.78 µM (rad H). Forskjeller i C. neoformans vekst finnes mellom replikat i kolonner 5-7, rad C, sannsynligvis på grunn av pipettering feil under fortynning forberedelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som for tolkningen av platene, i figur 1 er det en antifungal analysen for tre ulike forsterkere mot C. neoformans, ligger på kolonner 1-3 for AMP1, kolonner 5-7 for AMP2 og kolonner 8-10 for AMP3 med konsentrasjonene varierer fra 100 µ M (linje A) til 0.78 µM (rad H). Kontrollen negative/vekst ble plassert i kolonne 11 rader A til C, mens tomme kontrollen ble plassert i kolonnen 12 rader A C. AMP1 (kolonner 1-3 rader vekselstrøm) og AMP2 (kolonner 5-7, rader A-D), er Merk at på en høyere konsentrasjon media er gjennomsiktig, og det ingen synlige vekst. I lave konsentrasjoner brønnene er ugjennomsiktig (kolonner 1-3 rader D-H og kolonner 5-7, rader eh). Derfor anses rad C å inneholde MIC for AMP1, mens MIC for AMP2 i rad D, det vil si, 25 µM og 12,5 µM, henholdsvis. AMP3 må revurderes, som sopp vokste i alle konsentrasjoner testet. Ny vurdering for AMP3 er nødvendig for å fastslå årsaken, som kan være at testen mediet forstyrrer soppdrepende aktiviteten av den sammensatte, mikrobiell, eller en høyere motstand av sopp til agent testet. For siste muligheten, vil det være nødvendig å øke konsentrasjonen området testet. Som observert, no-hemming og kontroll brønnene er homogen, så de kunne også vurderes ved OD måling på 600 nm.
Som for figur 2, ble tre distinkte peptider testet mot C. albicans. Mikrofoner for AMP1 (kolonner 1-3), AMP2 (kolonner 4-6), og AMP3 (kolonner 7-9) var 50 µM, 6 µM og 25 µM, henholdsvis. C. albicans, kan på grunn av filamentation i inkubasjon temperatur, observeres i klumper i no-hemming og kontroll brønnene, gjør det vanskelig å bruke OD måling for lesing.
Noen ganger, er ingen vekst observert i brønnene. Dette kan skyldes en gift forurensning i media (da vekst kontrollene også viser ingen vekst) eller en høyere mottakelighet for agent (i så fall, vekst kontrollene viser vekst). Følgelig for det siste tilfellet, kan en nedgang i området konsentrasjon være nødvendig.
| Middels | Forberedelse | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 middels – 500 mL | 10.4 g RPMI-1640 (supplert med L-glutamin og fenol rød; uten bikarbonat) | |
| 330 mM 3-(N- morpholino) propan sulfonsyre (MOPPER) | ||
| Juster til pH 7.0 med NaOH | ||
| Sterilisere ved filtrering (0.22 µM filter) | ||
| Fosfat bufret saltvann (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2.7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoclave 121° c i 15 minutter. | ||
| Sabouraud druesukker kjøttkraft | 15 g pulver i 500 mL destillert vann. | |
| Justere pH 7.0 med NaOH | ||
| Autoclave 121° c i 15 minutter. | ||
| Sabouraud druesukker Agar | 32,5 g pulver i 500 mL destillert vann. | |
| Justere pH 7.0 med NaOH | ||
| Autoclave 121° c i 15 minutter. | ||
Tabell 1. Media og reagens forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution tester kan analysere potensielle soppdrepende aktiviteten mål sammensatte bruker små mengder av sammensatt, og samtidig teste det i en rekke konsentrasjoner. Følgelig anbefales denne protokollen som et første skritt i screening for potensielle nye soppdrepende forbindelser. Protokollen presenteres her er basert på M27-A3 protokollen, opprinnelig laget for å hjelpe i utvalg soppdrepende terapi i klinikker, og kan tilpasses til en rekke nye soppdrepende forbindelser. Samlet kan denne protokollen fokusere på mekanisk-funksjonene av ekstraktet eller sammensatte. For eksempel kan en potensiell kandidat i analysen feilaktig vises ineffektive fordi et sammensatt i media kan blokkere dets interaksjon med sopp cellen som effekten av RPMI på Histatin 514. I dette tilfellet er et alternativ medium for når RPMI gjør, gjær Nitrogen Base (YNB) buffer med MOPPER pH 715.
Protokollen tillater også at endringer i pre vekst forhold, inoculum konsentrasjon, inkubasjon temperatur, og lys-sensitive komponenter, som referanse soppdrepende resultatene er innenfor de retningslinjer. Referanse soppdrepende bør være basert på den gjeldende terapien for testet fungal arten. I tillegg finnes en referanse forbindelse som er like i naturen til potensielle stoffet- f.eks, en kjent antimikrobielle peptid soppdrepende aktivitet mot testet fungal modellen-det bør brukes som en ekstra Referansekontrollen.
Pre vekst betingelser kan endres for å passe sopp og forskning må. I protokollen var, C. neoformans og C. albicans vokst på 30 ° C for bedre overføringen. Likevel denne temperaturen kan endres avhengig av sopp stoffskiftet: for eksempel Paracoccidioides gummitre krever vekst på 37 ° C å opprettholde sin gjær form, og på grunn av dens langsom duplisering rate, må dyrkes for 5-7 dager. Derfor er det viktig å forstå sopp egenskapene for testing en potensiell ny stoff. Videre alder og stadium av vekst på cellene som brukes bør defineres etter hver studie og, viktigst, første inkubasjon tiden skal være etablert på forhånd og bevart gjennom alle tester å sikre reproduserbarhet .
Like, hvis den sammensatte/ekstrakt, referanse soppdrepende eller fortynner er følsomme for lys, trinnene bør legges til forhindre sin fornedrelse, som arbeider med redusert lys, dekker platene med folie eller plassere platene i en mørk kammer under inkubasjon ganger.
Videre kan kant effekt og fordampning bli redusert med tillegg av vann i Tom brønner, ikke bruker de ytre brønnene og fylle dem med vann, eller ved å sette platen i en fuktig kammer.
En av de viktigste begrensningene når benytter denne metoden er fokus på hemmende aktiviteten av et testet sammensatt, i motsetning til skille mellom fungicidal eller fungistatic. Likevel, som målet er en rask screening av den potensielle nye soppdrepende, den innledende vurderingen i visuelle MIC med en klar positiv (' klar/ikke-turbiditet' wells) og en negativ ('turbiditet' wells) resultatet, hjelper identifisere forbindelser av interesse å studere Videre, og dermed redusere totalkostnadene for screening for nye forbindelser.
Siden virkningsmekanismen av disse nye forbindelser er ukjent, kan denne protokollen brukes til å bestemme den sammensatte muligheten til å hemme fungal cellene ved å legge noen ekstra trinn, for eksempel plating positiv brønnene eller bruke live/dead fargestoffer. Andre mindre endringer kan legges bruke protokollen for et sjakkbrett titrering analysen til å identifisere eventuelle synergieffekter av sammensatt med andre rusmidler.
Selv om analysens lesing utføres vanligvis av visuell analyse av soppvekst under ulike forhold i forhold til veksten i godt med noen soppmiddel agent (negativ/vekst kontroll), det kan også gjøres ved å måle dens OD på 600 nm. Men selv OD målingen er korrekt homogen løsninger, vokse noen sopp i klumper dermed bryte presisjonen for metoden- f.eks, Candida spp. et resultat filamentation under inkubasjonstiden.
På den annen side, en av de store fordelene med protokollen beskrevet her, i forhold til CLSI M27-A3 retningslinjene, er at det tar i kontoen lufting av media for ikke-fermenting sopp, som C. neoformans. CLSI retningslinjene bruker også, bare en liten innledende inoculum, dermed krever lengre inkubasjonstiden for soppvekst og MIC definisjon. Noen studier har vist at høyere initialene inoculums og rister platen under inkubasjonen forbedre soppdrepende mottakelighet tester uten betydelige effekter på MIC besluttsomhet16,17. Våre protokollen kan nøyaktig bestemme MIC for nye forbindelser mot C. neoformans i en forkortet inkubasjonstiden, innen 48 timer, sammenlignet med 72 h foreslått av CLSI retningslinjer.
En annen fordel er at våre protokollen bruker en 100 µL siste bindet i stedet for 200 µL anbefalt av CLSI retningslinjer, dermed redusere den testede nye sammensatt kreves for soppdrepende analysen. Fordampning eksterne brønner kan være en bekymring, men løsninger allerede beskrevet i dette avsnittet for å redusere fordampning kan brukes uten at analyseresultatene.
I tillegg utfører fortynninger direkte på platen, og således omgåelsen CLSI fortynning retningslinjene å bruke microcentrifuge rør, kan flerkanals Pipetter brukes. Denne protokollen samlingen er mindre komplisert enn den i CLSI retningslinjer, og bruker også færre materialer.
En kritisk trinn gjelder fungal celle forberedelse er bruken av celler som er så frisk som mulig. Det er også viktig å utføre alle analyser med celler i den samme vekstfase, siden det er flere rapporter i litteraturen om forskjellene i soppdrepende mottakelighet når kultur alderen18,19. Valget av referanse stammer er også viktig. En svært følsom eller sjelden isolert arter kanskje ikke gi et klart bilde av soppdrepende potensial. Av samme token, er det nyttig å unngå sub dyrking trinn som ikke legge mange variabler til analysen. For eksempel for Candida stammer (som vokser raskere), foretrekker vi å omkjøringsvei agar plate foranstaltningen å inoculum direkte i flytende media.
Husk at mekanisk-funksjonene av ekstraktet eller sammensatte skal testes er viktig å vurdere. For eksempel hvis de ekstra eller sammensatte må være oppløst i løsemidler enn vann, må sørge for at en passende soppvekst kontroll inkluderer som samme løsemiddel konsentrasjonen med sopp alene. Dette er å garantere at noen vekst hemming observert ikke er grunn løsemiddelet i stedet for det testede sammensatt eller trekke ut. I dette tilfellet kan det være bedre å følge anbefalingene CLSI-M27A3 for DMSO utvannet soppdrepende stoffer, som oppløsning stoffet i en konsentrasjon minst 100 ganger høyere enn den høyeste testede konsentrasjonen å redusere prosentandelen løsemiddel i den plate.
Om stabilitet, det anbefales å holde små dele analysert ekstrakter eller forbindelser. Ved å lagre volumet nødvendig for ett analysen på riktig temperatur, overdreven manipulering av aliquot og, hvis den ekstrakter eller forbindelser lagres frosset, fryse-Tin sykluser kan unngås.
Endelig, en av de mest grunnleggende trinnene er nøyaktigheten av microplate føljetong uttynnet, gitt at pipettering feil overføres langs de påfølgende fortynninger. Heretter, er pipette presisjon og riktig pipettering teknikker viktig å sikre reproduserbarhet. Så, er det viktig å bruke kalibrerte Pipetter og alltid sjekk hvis volumet lagt til og fjernet fra hver brønn er riktig. Kontroller at rester eller rest fra stoffet ikke forblir i pipette spissen. Hvis sammensatt tendens til å holde seg til spissen, kan det være bedre å bytte tips mellom fortynninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker KAPPER-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF for økonomisk støtte. Vi er takknemlige for Dr. Hugo Costa Paes for revidere manuskriptet sitt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
