Summary
צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.
Abstract
ויזואליזציה של ה-DNA על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מנצל במגוון צבעים כגון צבעי cyanine. צבעים אלה מנוצלים בשל שלהם זיקה גבוהה ורגישות לדנ א. על מנת לקבוע אם מולקולות DNA הן באורך מלא לאחר סיום הניסוי, שיטה נדרשת כדי לקבוע אם מולקולות מוכתמים הם באורך מלא על ידי ה-DNA עם אנזימי הגבלה. עם זאת, DNA מוכתם עלול לעכב האנזימים, כך שיטה נדרשת כדי לקבוע איזה אנזימים אחד תוכל להשתמש עבור fluorochrome צבעונית הדנ א. בשיטה זו, ה-DNA הוא מוכתם צבע cyanine בין לילה כדי לאפשר את צבען ואת ה-DNA כדי equilibrate. דנ א הבא, ויטראז'ים מתעכל עם אנזים ההגבלה, נטען לתוך ג'ל, electrophoresed. הלהקות תקציר DNA ניסיוני מושווים לעיכול סיליקו כדי לקבוע את פעילות אנזים הגבלה. אם יש מספר זהה של להקות, כצפוי, ואז התגובה היא מלאה. עוד להקות מהצפוי מצביעים על עיכול חלקי ולהקות פחות מצביעים על עיכול לא שלם. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות שלה, היא משתמשת בציוד מדען צריכה בשביל באנזים הגבלה assay, ג'ל אלקטרופורזה. מגבלה של שיטה זו הוא זמין למדענים רוב האנזימים הם אנזימים זמינים מסחרית; עם זאת, אפשר להשתמש אנזימי הגבלה כלשהי.
Introduction
הסדרה טוטו (טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3 ובובו-3; טבלה 1) הוא מנוצל במגוון רחב של ניסויים איפה הפריט החזותי של ה-DNA נדרש1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. משפחת דימר cyanine נעשה שימוש נרחב שלהם תשואה קוונטית, רגישות וכתוצאה זיקה גבוהה עבור ה-DNA מולקולות18,19,20. צבעי דימר cyanine יש סלקטיביות נהדר עבור DNA נטושים כפול, כאשר intercalated יש עלייה 100 עד 1000 קיפול של קרינה פלואורסצנטית21. Pyridinium צבענים (YOYO-1, טוטו-1, YOYO-3 וטוטו-3) יש פליטה אורך גל קצר יותר מאשר שלהם quinolium לצבוע את עמיתיהם (טבלה 1) (בובו-1, פופו-1, בובו-3 ו- 3 פופו)22. כמו כן, התשואה קוונטית של הדימרים cyanine intercalated לתוך ה-DNA הוא גבוה (0.2 - 0.6)22. עם זאת, באמצעות אנזים כדי לקבוע את הפרופיל מתילציה של מולקולת ה-DNA2 או למתוח23 של מולקולה DNA כבר מוכתם הפלורסנט דורש שיטה לקביעת אנזימים מה לעכל DNA מוכתם. ניתן להשתמש בכל סוג של צבע זה intercalates לתוך ה-DNA או כל אנזים זה נותן דפוס ניכרת של המצע DNA עבור שיטה זו.
מנג. et al. קודם נקבע שיעור עיכול של DNA prestained באמצעות אלקטרופורזה בג'ל באמצעות מגוון של צבעים שונים24. . Maschmann et al. צלל ב עמוק יותר להסתכל על משפחת טוטו של צבע. שניהם נקבע שיעור עיכול של ויטראז'ים דנ א כדי לראות אם ה-DNA צבעונית עם צבע נתון יכול ובינינו עם אנזים הגבלה25. שיטות אחרות ללמוד איגוד אפקטים של צבעים intercalated עם ה-DNA בעזרת מלקחיים אופטיים26 או NMR27. אחת מהשיטות דורש ציוד מיוחד; ואילו, שיטה זו מאפשרת ציוד שיש רוב מעבדות ביולוגיה מולקולרית כדי לקבוע אם צבע מפריע לעיכול אנזים הגבלה.
בנוסף, בשיטות אחרות כדי למדוד את האורך של מולקולה נתונה, מיפוי אופטי מאורך, מוכתם במולקולות דנ א על משטח, מתעכל דנ א כדי לקבוע את המתיחה והגודל של קטעים. העיבור של צבע הוכח להגדיל את אורך מתאר של מולקולות DNA fluorescently ויטראז'ים ובהתאם את הצבע המשמש, אורך מתאר שונה21. בשיטה זו יש כבר מנוצל במגוון של הגנום1,3,4,6,13,28,29,30, 31. אולם, אם המולקולות היה מוכתם מראש, בהתאם לצבוע אנזים, האנזים לא יוכלו לגזור DNA צבעונית עם צבע נתון. לכן, בשיטה זו קובעת אם הדנ א צבעונית עם צבע נתון יכול להיות מתעכל עם אנזים. בנוסף, בהתאם לריכוז לצבוע, לצבוע מנוצל, הניידות של ה-DNA להקות בג'ל להעביר לאט יותר מאשר DNA יליד בשל ההתרה חלקית של עמוד השדרה ה-DNA כדי לפנות מקום לצבוע להוסיף בין בסיסי זוגות32 .
עם זאת, לפעמים אלה צבעי יכול חלקית או לחלוטין לעכב את הפעולה של אנזימי הגבלה מסוימת,7,24. זה נחשב להיות עקב שינוי מבני ב- DNA הנגרם על ידי ההחזקה של הפלורסנט, אשר עשוי למנוע את האנזים מהכרה רצף מסוים שלו. הבנה כיצד צבע אלה משפיעים על אנזימי הגבלה יכול לסייע בניסויים שבו נדרשת לפרופיל מתילציה או את המתיחה של DNA מוכתם.
בשיטה שלנו, ה-DNA היה מוכתם fluorochrome עניין, מתעכל עם אנזים ההגבלה. אז הדנ א היה electrophoresed-ג'ל, עם תמונה, נמדד קצב העיכול אנזים הגבלה. אנזימי הגבלה נבחרה בהתבסס על התבנית שנגזרו על ג'ל. מדי להקות גרם החפיפה של להקות DNA ולא מעט מדי להקות נתנו תמונה שלמה של ה-dna. יש חניה טובה. כדי להיות מסוגל לקבוע את הפרופיל של מולקולת הדנ א מתעכל; לכן, זה יהיה תלוי על ה-DNA בשימוש ואת האנזים. היתרון בשיטה זו הוא הפשטות שלה; זה רק דורש ציוד בשימוש של הגבלת לעיכול, ג'ל אלקטרופורזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צבעי, Buffers ו- Agarose ג'ל
-
להכין את הפתרונות הבאים מכתים דנ א או העיכול של DNA מוכתם.
- להכין x 1 TE (טריס-HCl וחומצה ethylenediaminetetraacetic; מאגר EDTA) באמצעות 10 מ מ EDTA טריס-HCl ו- 1 מ מ משורה או סטריליות. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).
- להפוך את aliquots של כל צבע: טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3, בובו-3 (טבלה 1). פיפטה 4 µL של 1 מ מ צבע לתוך ענבר כהה או שחור 1.5 mL צינור, להוסיף µL 36 של טה 1 x, לערבב בעזרת פיפטה; ריכוז זה הופך פתרון לצבוע 100 מיקרומטר (סה כ 40 µL). להשלים שלב זה עבור כל צבע. חנות ב 4 º C.
הערה: למנוע חשיפת צבע אור כדי למנוע photobleaching או השפלה של לצבוע. - להכין מאגר 1 באמצעות 10 מ מ Bis-טריס-פרופאן-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- 100 µg/mL אלבומין שור (BSA). הכנת מאגר 2 באמצעות 50 מ"מ NaCl, 10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- µg 100-מ/ל BSA. להכין מאגר 3 באמצעות 50 מ מ אשלגן אצטט, 20 מ מ טריס-אצטט, אצטט מגנזיום 10 מ מ, 100 של µg מ ל BSA. לכל אנזים ידרוש אחד של מאגרים ספציפיים אלה לתפקד.
-
להכין את הפתרונות הבאים בג'ל.
- להפוך 6 x הטעינה לצבוע על ידי שילוב של 0.25% bromophenol כחול, קסילן cyanol 0.25%, 15% Ficoll ב dH2חנות או בטמפרטורת החדר.
- כדי להפוך את agarose כ- 0.7% ג'ל, שוקל לצאת 0.07 גר' agarose טמפרטורה (HGT) ג'לי גבוהה בתוך הבקבוק Erlenmeyer, להוסיף 100 מ של מאגר x TAE 1 והצב כוס כימית הפוכה על-גבי הבקבוקון.
- מחממים את הפתרון על פלטה חמה עד בועות מתחילים להיווצר על החלק התחתון של הבקבוק, לצוף למעלה.
- הסר את הפתרון הכיריים, ומצננים עצמו את הפתרון נשאר ללא שינוי עד הבקבוקון יכול להיות נגע ביד חשופה, ואז לשפוך את הג'ל לתוך תבנית ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ עם מסרק ג'ל ליצירת בארות.
- להסיר את הבועות ליד המסרק או על פני השטח של הג'ל הבוקעים אותם עם טיפ פיפטה ולאפשר את הג'ל שבמהלכו במשך 15 דקות לפחות. זה ניתן לאחסן במקרר (4 ° C) עטופה בניילון נצמד במשך שבוע למנוע התייבשות של ג'ל או זיהום. לקבלת מידע נוסף על אופן הפעלת ג'ל להפנות לי. et al. 33 .
הערה: השתמש מסרק ג'ל עם 30 וולס בודדים. כל אחד צריך להיות רחב עם עומק של 2 מ מ 4.5 מ מ הגובה של הבאר יהיה תלוי כמות ג'ל שפכו לתוך התיבה.
- להכין מאגר x TAE (טריס - אצטט - EDTA) 1 באמצעות 40 מ מ טריס-HCl, חומצה אצטית 20 מ מ 1 מ"מ EDTA. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).
2. הכנת ויטראז'ים דנ א
-
כתם למדא דנ א (300-800 ng) באמצעות aliquots שונים של צבע. כל צבע (טבלה 1) יש שישה ריכוזים שונים שנבדקו, עבור סכום כולל של 48 תגובות לכל אנזים הגבלה. התהליך הבא מתאר ערכה למעלה עבור התגובה 1 (איור 1).
- לדלל למדא הדנ א באמצעות טה x 1 ל- 100 ng / µL. לאחסן 4 ° C. להפוך את פתרון עם נפח כולל של 300 µL.
- כתם למדא unmethylated DNA. עבור כל הלהקה צפויה מן התקציר, מעריכים 75-100 ng/להקה. להוסיף כמויות מתאימות של צבע כדי לייצר ריכוזים של 1.9 מיקרומטר, 3.8 מיקרומטר, 19.4 מיקרומטר, 32.2 מיקרומטר, מיקרומטר: 48.3, 63.5 מיקרומטר / 100 ננוגרם של ה-DNA.
- דגירה בין לילה (15 h - 18 h) ב 4 º C.
- להשאיר תגובה אחת מוכתם לשמש שליטה25.
הערה: השתמש unmethylated DNA עבור התגובה לעיכול. אנזימים רגיש מתילציה אין אפשרות לגזור מפוגל אזורים ב- DNA, ייתן הופעה של עיכול לא שלם.
3. הכנת וזמינותו אנזים הגבלה
-
תקציר מוכתם DNA באנזים הגבלה כדי לקבוע אם את האנזים יכולה לעכל prestained דנ א (איור 1).
- למחרת, להוסיף 20 U של אנזים הגבלה, 3 µL של המאגר המתאים (טבלה 2), וכן מים מזוקקים, בלוק, מסוננות עבור סכום כולל של 30 µL. עבור כל תגובה אנזימטית, לבחור את המאגר עם חיתוך היעילות הגבוהה ביותר, אשר ניתן למצוא באתר האינטרנט של היצרן.
- מקום לתגובות באמבט מים בטמפרטורה אופטימלית אנזימטי של הפעילות, רשומים בטבלה מס ' 2 אנזימים 6 בשימוש Maschmann et al., עבור 2-4 h (טבלה 2)25.
- לעצור את התגובה על ידי הוספת 2 µL של 0.5 M EDTA pH 8.0.
4. Electroeluting צבעונית-DNA ג'ל Agarose
- הסר את הצדדים כייר ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ (שלב 1.2.2) ומניחים את הג'ל לתוך התיבה ג'ל אלקטרופורזה. שופכים 2.5 L מאגר x TAE 1 לתוך התיבה. בזהירות להסיר את המסרק ג'ל הג'ל, כך הבארות הם נגישים33.
- Pipette את התגובות אנזים הגבלה על גבי סרט פלסטיק ולשלב בכל תגובה עם 6 x טוען לצבוע. עבור כל הפתרונות התגובה, להוסיף 1 µL של 6 x בטעינת צבע לכל 5-6 µL של פתרון ה-DNA (1 x). ואז pipette את התגובות (המכיל את צבען הטעינה, < 18 µL) לתוך הבארות.
- מערבבים 1 µL של הסולם 1 kb, µL 9 של 1 x TE ו 2 µL של 6 x טוען לצבוע. לטעון פתרון לתוך הבארות לאגף את פתרונות אחרים.
- מכסים את תיבת ג'ל עם נייר כחול או שחור כהה או בד. להתחבר תיבת ג'ל ספק כוח, הגדר את אספקת החשמל 30 וולט, ולהפעיל אותו בן לילה (15-20 שעות). לכבות את האורות בזמן פועל הג'ל, כדי למנוע photocleavage של ה-DNA עם תוויות.
- למחרת בבוקר לבטל את אספקת החשמל. בג'ל החוצה באמצעות המגש ולהעביר אותו במיכל עם 45 µL אתידיום ברומיד, 1 ליטר 1 מאגר x TAE. לאחסן את המיכל בטמפרטורת החדר בחושך או לכסות בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. תן ג'ל הכתם למשך לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר.
התראה: שימוש אתידיום ברומיד עם כפפות, בטיחות משקפיים. כאשר מנקים את הגורם המכיל אתידיום ברומיד פתרון ולזרוק את הג'ל, להתייעץ עם ההנחיות לרשות הברית שלך כדי לקבוע כיצד להתמודד עם שימוש אתידיום ברומיד; בנוסף, כתמים אחרים עשויים להיות מנוצל במקום אתידיום ברומיד.
5. הדמיה הג'ל Agarose
- מקם את הג'ל על גבי transilluminator אור כחול, אשר פולט פלט אור מקסימלית בין 400-500 ננומטר. צלם תמונות עם המצלמה מחוברת לתחנה.
התראה: הקפד להשתמש את הכיסוי עבור המאיר ולהניח על משקפי מגן לפני הפעלת מקור האור.
הערה: שלב זה עשוי גם ניתן להשלים באמצעות כל מקור אור UV או סורק ג'ל רגיל. - הצג את התמונות ב- ImageJ על-ידי גרירת הקובץ בשורת המצב ImageJ, התמונה תופיע.
- לקבוע את קצב העיכול עבור הניסוי על-ידי השוואת הלהקות הג'ל לתבנית ג'ל הצפוי סיליקו . כדי לקבוע את שיעור עיכול, מספר להקות ניסיוני מחולק על ידי המספר הצפוי של ה-DNA להקות24,25. אם התבנית ניסיוני DNA מתעכל הלהקה הדפוס הצפוי, שיעור עיכול הוא 1. אם התבנית יש קטעים יותר מהצפוי, שיעור עיכול הוא גדול מ- 1. אם התבנית יש קטעים פחות מהצפוי, שיעור עיכול הוא קטן מ-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לקבוע שאם צבע intercalating ישפיע באנזים הגבלה לעכל את ה-DNA, הסדר הנכון של שלבים בטח בעקבות (איור 1). לאחר ה-DNA היא צבעונית, מתעכל עם אנזים מסוים, ניתן לקחת תמונה של הג'ל כדי לקבוע את מספר קטעים ואת גודלם (איור 2). על מנת לקבוע את יעילות האנזים, המספר הכולל של הצפוי להקות גלוי לחלק למספר להקות גלוי. אנזים היעילות שווה אחדות, אם המספר של להקות צפוי לראות התאמה. אם יש עוד להקות על הג'ל ואז ציפית, הערך הוא גדול מאחד ומציין תגובות מעוכל חלקית. אם ישנם פחות להקות אז צפוי, אז הערך הוא קטן מ-1, המציינת עיכול לא שלם. ב- איור 2a, הצג נתיבי 3 ו- 4 הניידות של הלהקות הצטמצמה, גורם הלהקות לנוע לכיוון הבארות. בנתיבים 1 ו- 2, כמות צבע אינו משפיע על הניידות באופן ניכר, כך הלהקות להתאים את הפקד. ב- איור 2a, מסלולים 5 ו- 6 הצג עוד להקות מאשר הפקד, אז זה מצביע על עיכול חלקי. מה שאומר, הצבעים מושפעות את המחשוף של ה-DNA באתר זיהוי עבור האנזים הזה. ב. איור 2b, הכל צפוי להקות נראים עבור כל ריכוזי צבעים, כדי לצבוע לא התערבו עם העיכול של דנ א איור 2 c רצועות הניידות משמרות עם כוכביות צבעוניים.
כמו צבע ריכוז מגביר עבור צבעי עם-1, הניידות ירידות. על מנת לקבוע את גודל משוער של הלהקות, פקד נדרש לדעת איפה מולקולות DNA יליד צפויים לעומת ה-DNA ויטראז'ים (איור 2 א). עבור צבעי עם-3, הניידות לא פחת כך צבעי-1 עשה, אז זה היה קל יותר לקבוע את גודל פרגמנט (איור 2b). ההבדל ניידות הוא בשל סוג צבע מנוצל, כפי שניתן לראות Maschmann. et al. 25. השונות של צבעים אלה נתפסת בשל המבנים של הצבעים. מקשר בין moiety ארומטי עבור צבעי-3 היה יותר מ-1. הצבעים עשויים intercalate באופן שונה במקצת בשל ההבדל בגודל מקשר, שיכול להסביר למה המשמרת ניידות היא פחות עבור-3 צבעי.
אם אין דנ א, או להקות DNA מאוד חלש הג'ל, להגדיל את ריכוז הדנ א נדרש. עם זאת, אם מגדיל ריכוז הדנ א, ואז כמות צבע נדרש גם יגדל כדי לשמור על הריכוז הנכון של צבע יחס ה-DNA.
איור 1 : תיאור סכמטי של המדרגות הנדרש כאשר עיכול fluorochrome שכותרתו במולקולות דנ א. ה-DNA, YOYO-1, או צבע אחר מתוך הסדרה טוטו, נוספו צינור שחור, מודגרות לילה (O/N; h 15-20). אנזים הגבלה נוספת צינור; מניחים אותה באינקובטור, בטמפרטורה המועדפת, עבור 2-4 h (טבלה 2). לטעון דגימות לתוך 0.7% שקוע agarose ג'ל עם מאגר x TAE 1. נייר צבעוני כהה מכסה שהתיבה ג'ל האורות כבויים, בעוד הג'ל הוא רץ לילה כדי למנוע photocleavage של לצבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עיכול הגבלה של DNA intercalated עם צבע דימר cyanine. () ה-DNA למדא. זה ישאר עם ריכוזים שונים של YOYO-1 בן לילה (ליין c: מתעכל הדנ א למבדה עם אין צבע (בקרה), ליין 1: 1.9 ng, ליין 2: 3.8 ng, ליין 3: 19.4 ng, ליין 4: 32.2 ng, נג 5: 48.3 ליין, ליין 6: 63.5 ng של צבע לכל 100 ננוגרם של ה-DNA), ואז dige sted עם EcoRI ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 h. כל התגובות הן electrophoresed (E = 0.85 V/ס מ) על חום גבוה כ- 0.7% ג'לי (HGT) agarose ג'ל עשה עם מאגר x TAE 1 (1 x TAE; 40 מ מ טריס-HCl, 20 מ מ חומצת חומץ, 1 מ מ EDTA). ג'לים מוכתם אתידיום ברומיד, עם תמונה עם transilluminator האור הכחול מצמידים מצלמה. ליין L הוא סולם 1 kb (מידות, kb); ליין λ הוא אורך מלא למדא DNA; ליין E הוא דפוס הלהקה הצפוי (מידות, kb). (b) למדא DNA הוא מוכתם YOYO-3 (נג 1: 1.9 ליין, ליין 2: 3.8 ng, ליין 3: 19.4 ng, ליין 4: 32.2 ng, נג 5: 48.3 ליין, ליין 6: 63.5 ng של צבע לכל 100 ננוגרם של ה-DNA) מעוכל עם HindIII ב 37 º C. (ג) כדי לראות איך הניידות זז כמו ריכוז YOYO-1 הוא גדל, כוכביות צבעוניים ממוקמות ליד כל הלהקה לריכוז כל YOYO-1. לדוגמה, הלהקה ב 3.5 kb יש כוכבית אדומה ליד כל הלהקה בריכוז כל YOYO-1. הלהקות לא צפוי בנתיב 5 ו- 6 אין כוכבית לצד הלהקות. הדמות משתנה מ-. Maschmann et al. 25. זכויות יוצרים (2017) נוקלאוזידים, נוקלאוטידים ו חומצות גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם כימי | השם המקוצר | Ex / Em (אן אם) |
| [(1 – בתו-[1, 3-propanediylbis bis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] [4-[מתיל (3-מתיל-2(3H)-benzothiazolylidene)]]-, tetraiodide | טוטו-1 | 514/533 |
| 1, בתו - bis (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) [methylidene 4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl)]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2, 2 ′-[1, 3-אביזרים-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 שעות) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-מתיל]-, tetraiodide | פופו-1 | 434/456 |
| 2, 2 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, בתו nolinium-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-} | בובו-1 | 462/481 |
| 2, 2 ′-{bis [4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | טוטו-3 | 642/660 |
| 1, בתו-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | YOYO-3 | 612/631 |
| 2, 2 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 שעות) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | פופו-3 | 534/570 |
| 2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide | בובו-3 | 570/602 |
טבלה 1: מקוצר שמות המשפחה טוטו של צבעים עם שמות סיסטמטי עם פליטה (Em) ו עירור (לשעבר) maximima22-
| אנזים | מתילציה רגיש | מאגר | טמפרטורת המים באמבטיה |
| BamHI | לא | 2 | 37 ° C |
| EcoRI | כן | 2 | 37 ° C |
| HindIII | לא | 2 | 37 ° C |
| PmlI | כן | 1 | 37 ° C |
| ScaI | לא | 2 | 37 ° C |
| מרק פורטנוי | כן | 3 | 25 ° C |
בטבלה 2: המפורטים בטבלה היא תת-קבוצה של אנזימים אפשרי שיכול לשמש בניסויים אלה. שלושה אנזימים הם מתילציה רגישים ואינם שלוש מתילציה רגיש. המאגרים המשמש אנזימים וטמפרטורות הדגירה מפורטים עבור כל אנזים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת לעכל DNA fluorescently שכותרתו (איור 1), סדרה של צעדים נדרשים. ראשית, ה-DNA היא מוכתמת עם fluorochrome בן לילה. דנ א יכול להיות מודגרות עם cyanine הדימרים לתקופה קצרה של זמן; אולם, Carlsson. et al. נמצא כי ה-DNA נוצר להקות כפול עבור כל גודל ה-DNA עקב מכתימים לא שלם20. כדי לתקן זאת, ה-DNA יכול להיות מוכתם לילה כדי למנוע התרחשות להקות כפול. זהו שלב קריטי בפרוטוקול. אם לא לצבוע מודגרת למשך זמן ארוך מספיק, לצבוע-הדנ א לא ייתכן ב"שיווי וייתן דפוס פסים כפול. אם זה קורה, לאפשר את התערובת הדנ א-צבע עד equilibrate לתקופה ארוכה יותר של זמן.
בשלב הבא, באנזים הגבלה מוסיפים את ה-DNA-צבע, מתעכל עבור 2-4 h בטמפרטורה ספציפית עבור כל אנזים. ה-DNA חייב להיות unmethylated עבור אנזימים רגיש מתילציה. אם זה לא, DNA מפוגל לעכב את האנזים הגבלת מ- DNA חיתוך באזורים מפוגל. בנוסף, התגובה חייבת להיות מודגרות מאגר הנכונה ואת הטמפרטורה עבור האנזים. לכל אנזים יש רשימת מאגרים ופעילות האנזים במאגר כל. לבחור את המאגר עם פעילות אנזים 100%, אם הדבר אפשרי. לגבי טמפרטורה, ודא כי זה הוא מתפשט, בטמפרטורה הנכונה. אם זה לא, זה עלול לגרום האנזים להפסיד פעילות או denature אם הטמפרטורה גבוהה מדי. EDTA מנוצל כדי לעצור את התגובה. החברה שבה נרכשו האנזימים יהיה תרשים עם טמפרטורות אופטימלית, מאגר תנאים של אנזים זה. אם הפקד אינו נותן את המספר הנכון של להקות משקלים מולקולרית נכון, לבדוק אם היא שפג תוקף האנזים, להאריך את זמן הדגירה, או בדוק כדי לוודא הטמפרטורה הוא הנכון עבור האנזים הזה.
עם סיום התגובה, ניתן לטעון את הדגימות לתוך ג'ל. ראשית, ג'ל נטען לתוך המיכל ג'ל, שקוע בתוך מאגר x TAE 1. בשלב הבא, ה-DNA מתעכל מעורבב עם טעינת לצבוע, הפתרון הוא נטען לתוך הבארות של הג'ל. המכסה היא החליקה על פני, החוטים מחוברים אל תיבת ג'ל. נייר כהה, מודבקת יחדיו, מונחת על גבי המכסה כדי לכסות את המכסה, לעטוף משני צדדיו. צעד קריטי נוסף הוא כי הדגימות מוגנים מפני האור בכל עת, במיוחד כאשר הג'ל פועל. הזרם צריך להיות מופעל וכיבה האור בחדר. על מנת למנוע photocleavage של ה-DNA, דגימות מוגנים מפני אור כל הזמן. אם אין נייר כהה, ניתן להשתמש גם בד כהה. אם ה-DNA לא זזה, ודא החוטים מחוברים אל תיבת יש בעת לחיצה על לחצן ההפעלה.
בבוקר, בג'ל מהקופסה ג'ל ולטעון את הג'ל לתוך מיכל המכיל אתידיום ברומיד. אתידיום ברומיד מאפשר לנו לראות את הלהקות DNA תחת transilluminator אור כחול (איור 2). צבעים אחרים יכול לשמש במקום אתידיום ברומיד. מצלמה יכול להיות מותקן מעל transilluminator אור כחול כדי ללכוד תמונות של הג'ל. בהתאם ההתקנה, תחנה הדמיה גם יכול להיות מנוצל.
בשיטה זו יכול להיות מנוצל עבור כל צבע intercalates או כתמי דנ א, לא רק הסדרה טוטו. Maschmann et al. ששינה טכניקה שפותחה על ידי מנג ואח. כדי לקבוע אם fluorescently צבעונית דנ א יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה24,25. זוהי השיטה היחידה מנוצל כדי לקבוע אם הדנ א מראש מוכתם משפיע על אנזימי הגבלה. שיטה זו היא מוגבלת אנזימי הגבלה זמינים מסחרית, אלא אם כן מדען יש גישה אל שאר אנזימי הגבלה שאינם מפורטים באופן מסחרי. בהתאם ה-DNA, האנזים שנבחר צריך התלונן על הלהקה DNA ולהקות מספיק (> 3) כדי לקבוע אם ה-dna הוא באורך מלא. כמו כן, ה-DNA צריך להיות unmethylated אם אנזימים רגיש מתילציה משמשים. אם ה-DNA הוא מפוגל, אז אל תשתמש אנזימים רגיש מתילציה.
שיטה זו מהווה דרך קלה לשימוש כדי לקבוע אם אנזימי הגבלה יכול לחתוך במולקולות דנ א באתר זיהוי צבעונית עם צבע intercalating ללא צורך לעצב צבעי יסוד אתר מסוים לחתוך34. יישומים עתידיים של שיטה זו יהיה לקבוע אם fluorescently שכותרתו מולקולות ניסוי היו באורך מלא על-ידי שימוש באנזים הגבלה לקביעת הגודל של הלהקות DNA מן התקציר או כדי לקבוע את הפרופיל מתילציה של הדנ א מולקולות. ניסויים עתידיים יכול גם לקבוע אם חותך אנזימים מושפעות על ידי צבעים cyanine או אחרים צבעי פלורסנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5605100122001), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), כמו גם אוניברסיטת נברסקה קירני (UNK) קיץ תלמיד מחקר התוכנית (SSRP), ו UNK מלגת מחקר לתואר ראשון (URF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al.
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
