Summary
Farvning DNA molekyler til fluorescens mikroskopi tillader en videnskabsmand til at se dem under et eksperiment. I den metode, der præsenteres her, er DNA molekyler pre farves med fluorescerende farvestoffer og fordøjes med methylering og ikke-methylering følsomme restriktionsenzymer.
Abstract
Visualisering af DNA til fluorescens mikroskopi udnytter en bred vifte af farvestoffer såsom cyanine farvestoffer. Disse farvestoffer er udnyttet på grund af deres høje affinitet og følsomhed for DNA. For at afgøre, om DNA-molekyler er fuld længde efter afslutningen af eksperimentet, kræves en metode til at afgøre, om de farvede molekyler er fuld længde af fordøje DNA med restriktionsenzymer. Men farvede DNA kan hæmme enzymerne, så en metode er nødvendig for at afgøre, hvad man kunne bruge til fluorokrom enzymer farves DNA. I denne metode, er DNA farvet med en cyanine farvestof natten at lade farvestof og DNA til Reagensglasset. Næste, farves DNA er fordøjet med en restriktion enzym, indlæses i en gel og electrophoresed. De eksperimentelle DNA digest bands er i forhold til en i siliciummangan digest til at bestemme restriktion enzymaktiviteten. Hvis der er det samme antal bands som forventet, så er reaktionen færdig. Flere bands end forventet angive delvis fordøjelse og mindre bands angive ufuldstændig fordøjelse. Fordelen ved denne metode er dets enkelhed, og det bruger udstyr, som videnskabsmand vil være nødvendigt for en begrænsning enzym assay og gel elektroforese. En begrænsning af denne metode er, at de enzymer, der er tilgængelige for de fleste forskere er kommercielt tilgængelige enzymer; men enhver restriktionsenzymer kunne bruges.
Introduction
TOTO-serien (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 og BOBO-3; Tabel 1) udnyttes i en lang række eksperimenter hvor visualiseringen af DNA er påkrævet1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine dimer familie er meget udbredt på grund af deres kvanteudbytte, følsomhed og høj affinitet for DNA molekyler18,19,20. Cyanine dimer farvestoffer har stor selektivitet for dobbelt strandede DNA, og når imidlerid har en 100 til 1000 fold stigning af fluorescens21. Pyridinium farvestoffer (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 og TOTO-3) har en kortere emission bølgelængde end deres quinolium farve (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 og POPO-3) modparter (tabel 1)22. Også, kvanteudbytte for cyanine dimerer imidlerid i DNA er høj (0,2 - 0,6)22. Ved hjælp af et enzym til at bestemme profilen methylering af et DNA-molekyle2 eller strække23 en DNA molekyle allerede farves med fluorescerende farvestof kræver imidlertid en metode til at bestemme, hvilke enzymer fordøje farves DNA. Enhver type af farvestof, der intercalates i DNA eller enhver enzym, der giver en mærkbar mønster af DNA substrat kan bruges til denne metode.
Meng et al. bestemmes først fordøjelsen sats af prestained DNA gennem gelelektroforese ved hjælp af en række forskellige farvestoffer24. Maschmann et al. delved i dybere at anskue familien TOTO af farvestoffer. Begge bestemmes fordøjelsen sats af bejdset DNA at se hvis DNA farves med et bestemt farvestof kan fordøjes med en restriktion enzym25. Andre metoder studere bindende virkninger af farvestoffer imidlerid med DNA ved hjælp af optiske tweezers26 eller NMR27. Begge metoder kræver specialiseret udstyr; der henviser til, at denne metode giver mulighed for udstyr, som de fleste Molekylærbiologi labs er nødt til at afgøre, om et farvestof forstyrrer en restriktion enzym fordøjelsen.
Derudover i andre metoder til at måle længden af en given molekyle, har optisk kortlægning aflange unstained DNA molekyler på en overflade og fordøjet DNA for at bestemme den strækning og størrelse af fragmenter. Intercalation af farvestof har vist sig at øge contour længden af fluorescently farvede DNA molekyler og afhængigt af farvestoffet anvendes, de contour længder er forskellige21. Denne metode er blevet udnyttet i en bred vifte af genomer1,3,4,6,13,28,29,30, 31. dog hvis molekyler blev præ farves, afhængigt af farvestof og enzym, enzymet kan ikke kunne skære DNA farves med et bestemt farvestof. Derfor bestemmer denne metode, hvis DNA farves med et bestemt farvestof kan fordøjes med et enzym. Desuden, afhængigt af koncentrationen af farvestoffet og farvestoffet udnyttet, mobilitet af DNA vil bands i en gel overføre mere langsomt end indfødte DNA på grund af den delvis afvikling af DNA-backbone at gøre plads til farvestof at indsætte mellem basepar32 .
Men nogle gange disse farvestoffer kan delvist eller hæmme helt virkningen af visse restriktionsenzymer7,24. Dette menes at være forårsaget af en strukturel ændring i DNA forårsaget af udlæg i de fluorescerende farvestof, som kan forhindre enzymet fra at anerkende dets specifikke sekvens. Forstå, hvordan disse farvestoffer påvirker restriktionsenzymer kan hjælpe i eksperimenter hvor methylering profil eller strækning af bejdset DNA er påkrævet.
I vores metode var DNA farves med en fluorokrom af interesse og fordøjes med en restriktion enzym. Derefter DNA var electrophoresed på en gel, afbildet, og restriktion enzym fordøjelsen sats blev målt. Restriktionsenzymer var udvalgt på baggrund af det snit mønster på en gel. For mange bands forårsaget overlapning af DNA bands og for få bands give ikke et fuldstændigt billede af DNA-molekylet. Der er en sweet spot til at være i stand til at bestemme profilen af fordøjet DNA-molekylet; det vil derfor afhænge DNA anvendes og enzymet. En fordel ved denne metode er dens enkelthed; Det kræver kun udstyr, der anvendes i en restriktion fordøjelse og gel elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af farvestoffer, buffere og agarosegel
-
Forberede følgende løsninger til farvning DNA eller fordøjelsen af bejdset DNA.
- Forberede 1 x TE (Tris-HCl og ethylendiamintetra syre; EDTA) buffer ved hjælp af 10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA i et måleglas eller målekolbe. Opbevares ved stuetemperatur (18-25 ° C).
- Gøre delprøver af hver farvestof: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabel 1). Afpipetteres 4 µL af 1 mM farvestof i en mørk rav eller sort 1,5 mL tube og tilføje 36 µL 1 x TE, bland med pipette; denne koncentration gør en 100 µM farvestof løsning (40 µL samlede). Udføre dette trin for hver farve. Opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Undgå at udsætte farvestof til lys for at forhindre photobleaching eller nedbrydning af farvestoffet. - Forberede buffer 1 ved hjælp af 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2og 100 µg/mL bovint serumalbumin (BSA). Forberede buffer 2 ved hjælp af 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2og 100 µg/mL BSA. Forberede buffer 3 bruger 50 mM kalium acetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesium acetat og 100 µg/mL BSA. Hvert enzym vil kræve en af disse specifikke buffere til at fungere.
-
Forberede følgende løsninger til gelelektroforese.
- Gøre en 6 x lastning farve ved at kombinere 0,25% bromophenol blå, 0,25% xylen cyanol, 15% Ficoll i dH2O. butik ved stuetemperatur.
- For at gøre en 0,7% Agarosen gel, afvejes 0,07 g af høj geldannende temperatur (HGT) Agarosen i en Erlenmeyerkolbe, tilsættes 100 mL af 1 x TAE buffer og placere en inverteret bægerglas oven i kolben.
- Varme løsning på en varmeplade, indtil boblerne begynder at danne på bunden af kolben og flyde til toppen.
- Fjerne løsningen fra varmepladen, lad løsning cool indtil kolbens kan blive rørt med en nøgne hånd, og derefter hælde gel i en 24,5 cm x 21.8 cm gel mug med en gel kam til at oprette brønde.
- Fjerne boblerne nær kam eller på overfladen af gelen ved at poppe dem med en pipette spids og tillade gel til at størkne i mindst 15 minutter. Dette kan opbevares i køleskab (4 ° C) indpakket i plastfolie for 1 uge til at forhindre udtørring af gel eller forurening. For mere information om hvordan du kører en gel henvise til Lee et al. 33 .
Bemærk: Brug en gel kam med 30 individuelle brønde. Hver bør vel være 4,5 mm bred med en dybde af 2 mm. Højden af brønden vil afhænge af mængden af gel hældes i boksen.
- Forberede 1 x TAE (Tris - acetat - EDTA) buffer ved hjælp af 40 mM Tris-HCl, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA. Opbevares ved stuetemperatur (18-25 ° C).
2. forberedelse af bejdset DNA
-
Pletten lambda DNA (300-800 ng) ved hjælp af forskellige delprøver af farvestoffer. Hver farvestof (tabel 1) har seks forskellige koncentrationer afprøvet, for ialt 48 reaktioner pr. begrænsning enzym. Følgende proces skitserer et sæt op til 1 reaktion (figur 1).
- Fortynd lambda DNA ved hjælp af 1 x TE til 100 ng / µL. butik i 4 ° C. Gøre en løsning med samlede volumen af 300 µL.
- Pletten unmethylated lambda DNA. For hver bandet forventet fra digest'en, anslå 75-100 ng/band. Tilføj passende beløb af farvestof til at producere koncentrationer af 1.9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48.3 µM, 63,5 µM / 100 ng af DNA.
- Der inkuberes natten over 15 h - 18 h ved 4 ° C.
- Efterlade en reaktion unstained til at fungere som en kontrol25.
Bemærk: Brug unmethylated DNA for fordøjelsen reaktion. Methylering følsomme enzymer kan ikke skære methylerede regioner i DNA og vil give et udseende af en ufuldstændig fordøjelse.
3. forberedelse af begrænsning enzym analysen
-
Digest farves DNA med en restriktion enzym til at bestemme, hvis dette enzym kan fordøje prestained DNA (figur 1).
- Den følgende dag føje 20 U begrænsning enzym, 3 µL af de relevante buffer (tabel 2), og destilleret, autoklaveres og filtreret vand til i alt 30 µL. For hvert enzym reaktion, skal du vælge bufferen med den højeste skæring effektivitet, som kan findes på producentens hjemmeside.
- Placer reaktionerne i et vandbad ved temperatur på optimal enzymatisk aktivitet, der er anført i tabel 2 for de 6 enzymer, der anvendes i Maschmann mfl., for 2-4 h (tabel 2)25.
- Reaktionen standses ved at tilføje 2 µL af 0,5 M EDTA pH 8,0.
4. Electroeluting farves DNA i en agarosegel
- Fjerne siderne fra 24,5 cm x 21.8 cm gel mug (trin 1.2.2) og placere gel i boksen gel elektroforese. Hæld 2,5 L 1 x TAE buffer i boksen. Fjern forsigtigt gel kam fra gel, så brøndene er tilgængelige33.
- Afpipetteres begrænsning enzym reaktioner på en plastfolie og kombinere hver reaktion med 6 x lastning farvestof. For hver reaktion løsning, tilføje 1 µL af 6 x lastning farvestof pr. 5-6 µL DNA-opløsning (1 x). Derefter afpipetteres på reaktioner (indeholdende lastning farvestof, < 18 µL) i brøndene.
- Bland 1 µL af 1 kb stigen, 9 µL 1 x TE og 2 µL af 6 x lastning farvestof. Indlæse løsning i brøndene, der flankerer de andre løsninger.
- Dække boksen gel med mørk blå eller sort papir eller stof. Tilsluttes en strømforsyning, indstille strømforsyningen til 30 V, og køre det natten over (15-20 h) boksen gel. Slukke lyset, mens gelen kører, for at forhindre photocleavage af det mærkede DNA.
- Næste morgen slå fra strømforsyningen. Tag gelen ud ved hjælp af bakken og overføre det til en container med 45 µL ethidiumbromid og 1 L 1 x TAE buffer. Gemme beholder ved stuetemperatur i mørke eller cover i folie for at forhindre udsættelse for lys. Lad gel pletten for mindst 45 min ved stuetemperatur.
Forsigtig: Brug ethidiumbromid med handsker og bære sikkerhedsbriller. Når rengøring ud beholder indeholdende ethidium bromid løsning og smide gel, konsultere din stater bortskaffelse retningslinjer for at afgøre, hvordan man skal håndtere brugte ethidiumbromid; Derudover kan andre pletter udnyttes i stedet for ethidiumbromid.
5. imaging den agarosegel
- Placer gel på toppen af en blå lys transilluminator, som udsender maksimale lyseffekt mellem 400-500 nm. Tag billeder med kameraet fastgjort til stationen.
Forsigtig: Sørg for at bruge coveret til illuminator og sat på beskyttende briller før dreje på lyskilden.
Bemærk: Dette trin kan også udfyldes ved hjælp af hvilken som helst UV lys kilde eller standard gel scanner. - Se billederne i ImageJ ved at trække filen til ImageJ status bar og billedet vil poppe op.
- Find fordøjelsen sats for forsøget ved at sammenligne bandene på gel til det forventede i siliciummangan gel mønster. For at bestemme fordøjelsen sats, er antallet af eksperimentelle bands divideret med det forventede antal DNA bands24,25. Hvis den eksperimentelle fordøjet DNA band mønster har den forventede mønster, er fordøjelsen sats 1. Hvis mønsteret har flere fragmenter end forventet, er fordøjelsen sats større end 1. Hvis mønsteret har mindre fragmenter end forventet, er fordøjelsen sats mindre end 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme, hvis en intercalating farvestof vil påvirke en restriktion enzym fordøje DNA, den rigtige rækkefølge af trin skal være fulgt (figur 1). Når DNA er farvet og fordøjes med en given enzym, kan blive taget et billede af gelen til at bestemme antallet af fragmenter og deres størrelse (figur 2). Bestemmelse af enzymet effektivitet, det samlede antal forventede synlige bands divideret med antallet af synlige bands. Enzym effektivitet equaled enhed, hvis antallet af bands forventes og set kampen. Hvis der er flere bands på gelen så forventes, værdien er større end 1 og angiver delvist fordøjet reaktioner. Hvis der er mindre bands så forventes, så er værdien mindre end 1, som angiver ufuldstændig fordøjelse. I figur 2a, baner 3 og 4 Vis mobilitet af bandene er faldet, forårsager bands til skift i retning af brøndene. I baner 1 og 2 påvirker beløb af farvestof ikke mobiliteten mærkbart, så bandene svarer til kontrollen. I figur 2aviser baner 5 og 6 flere bands end kontrol, så indikerer det delvis fordøjelsen. Hvilket betyder, farvestofferne påvirket kløvningen af DNA på webstedet anerkendelse for dette enzym. I figur 2bforventes alle bands er set for alle farvestof koncentrationer, så farvestoffet ikke forstyrrer fordøjelsen af DNA. Figur 2 c spor mobilitet skifter med farvede stjerner.
Som farvestof stiger koncentrationen til farvestoffer med -1, mobilitet falder. For at bestemme den omtrentlige størrelse af bandene, er en kontrol forpligtet til at vide, hvor indfødte DNA-molekyler er forventet i forhold til de farvede DNA (figur 2a). For farvestoffer med -3, mobilitet ikke formindske at-1 farvestoffer gjorde, så det var lettere at bestemme Fragmentets størrelse (figur 2b). Mobilitet forskellen skyldes typen af farvestof udnyttet, som set i Maschmann et al. 25. Variansen af disse farvestoffer er set på grund af strukturerne i farvestofferne. Linker mellem de aromatiske gruppe for farvestoffer -3 var længere end -1. Farvestoffer kan intercalate lidt anderledes på grund af forskellen i størrelsen linker, hvilket kan forklare hvorfor mobilitet Skift er mindre for-3 farvestoffer.
Hvis der er ingen DNA, eller DNA bands er meget svag i gelen, er øger koncentrationen af DNA påkrævet. Dog hvis DNA-koncentrationen stiger, øges så mængden af farvestof kræves også for at holde den korrekte koncentration af farvestof til DNA-forholdet.
Figur 1 : En skematisk af trin påkrævet når fordøje fluorokrom mærket DNA molekyler. DNA og YOYO-1 eller en anden farve fra rækken TOTO er føjet til en sort tube og inkuberes natten over (O/N, 15-20 h). En restriktion enzym er føjet til en slange; Det er placeret i en kuvøse på foretrukne temperatur, for 2-4 h (tabel 2). Indlæse prøver i en nedsænket 0,7%-agarosegel lavet med 1 x TAE buffer. Mørkt farvet papir dækker boksen gel og lysene er slukket, mens gelen er løb overnight at forhindre photocleavage af farvestoffet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Begrænsning fordøjelsen af DNA imidlerid med en cyanine dimer farvestof. (en) Lambda DNA er farvet med forskellige koncentrationer af YOYO-1 natten (lane C: fordøjet lambda DNA med ingen farvestof (kontrol), lane 1: 1.9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng af farvestof pr. 100 ng af DNA) og derefter dige sted med EcoRI ved 37 ° C i 2-4 h. Alle reaktioner er electrophoresed (E = 0,85 V/cm) på en 0,7% høj geldannende temperatur (HGT) agarosegel lavet med 1 x TAE buffer (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl, 20 mM eddikesyre, 1 mM EDTA). Geler er plettet med ethidiumbromid og afbildet med en blå lys transilluminator koblet til et kamera. Lane L er et 1 kb stigen (størrelser, kb); Lane λ er fuld længde lambda DNA; Lane E er den forventede band mønster (størrelser, kb). (b) Lambda DNA er farvet med YOYO-3 (lane 1: 1.9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng af farvestof pr. 100 ng af DNA) og fordøjes med HindIII ved 37 ° C. (c) at se, hvordan mobilitet flyttet som YOYO-1 koncentration er øget, farvede stjerner er beliggende ved siden af hvert bånd for hver YOYO-1 koncentration. F.eks har bandet på 3,5 kb en rød stjerne ved siden af hvert bånd i hver YOYO-1 koncentration. De uventede bands i lane 5 og 6 har ikke en stjerne ved siden af bandene. Tallet er ændret fra Maschmann et al. 25. copyright (2017) nucleosider og nucleotider nukleinsyrer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kemisk navn | Forkortet navn | Ex / Em (nm) |
| [(1-1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene) methyl]]-, tetraiodide | TOTO-1 | 514/533 |
| 1, 1 ' - (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2, 2 '-[1,3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-methyl]-, tetraiodide | POPO-1 | 434/456 |
| 2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} | BOBO-1 | 462/481 |
| 2, 2 '-{[4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] bis [hydroxy-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | TOTO-3 | 642/660 |
| 1, 1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | YOYO-3 | 612/631 |
| 2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | POPO-3 | 534/570 |
| 2,2'-{Propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)Propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-IUM) tetraiodide | BOBO-3 | 570/602 |
Tabel 1: Forkortet navne med TOTO familie af farvestoffer IUPAC navne med emission (Em) og magnetisering (Ex) maximima22.
| Enzym | Methylering følsomme | Buffer | Vandtemperaturen bad |
| BamHI | Nej | 2 | 37 ° C |
| EcoRI | Ja | 2 | 37 ° C |
| HindIII | Nej | 2 | 37 ° C |
| PmlI | Ja | 1 | 37 ° C |
| ScaI | Nej | 2 | 37 ° C |
| SmaI | Ja | 3 | 25 ° C |
Tabel 2: Fremgår af tabel er en delmængde af mulige enzymer, der kunne bruges i disse eksperimenter. Tre enzymer er methylering følsomme og tre ikke methylering følsomme. Buffere anvendes til enzymer og inkubation temperaturer er angivet for hvert enzym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at fordøje fluorescently mærket DNA (figur 1), en serie af trin er påkrævet. Først, DNA er farvet med en fluorokrom natten over. DNA kan være inkuberes med cyanine dimerer i en kortere periode; Carlsson et al. fandt imidlertid, at DNA lavet dobbelt bands for hver DNA størrelse på grund af ufuldstændig farvning20. For at afhjælpe dette kan DNA være plettet overnight at forhindre dobbelt bands opstår. Dette er et kritisk skridt i protokollen. Hvis farvestoffet ikke er inkuberes i lang nok tid, dye-DNA kan ikke ved ligevægt og vil give en dobbelt-banding mønster. Hvis dette sker, lad DNA-farvestof blandingen Blandingen henstår i en længere periode.
Næste, en restriktion enzym er tilføjet til DNA-farvestof blandingen og fordøjet i 2-4 timer ved en bestemt temperatur for hvert enzym. DNA skal være unmethylated for methylering følsomme enzymer. Hvis det ikke er, vil methylerede DNA hæmmer begrænsning enzym fra skæring DNA i methylerede regioner. Derudover skal reaktionen være inkuberes i den korrekte buffer og temperatur for enzymet. Hvert enzym har en liste af buffere og enzymaktiviteten i hver buffer. Vælge bufferen med enzymaktivitet på 100%, hvis det er muligt. Med hensyn til temperatur, Sørg for det er inkuberes i den korrekte temperatur. Hvis det ikke er, kan det forårsage enzym til at miste aktivitet eller denaturere hvis temperaturen er for høj. EDTA er udnyttet til at stoppe reaktionen. Det selskab, hvor enzymerne, der blev købt vil have et diagram med optimale temperaturer og buffer betingelser for dette enzym. Hvis kontrolelementet ikke giver det korrekte antal bands på de rigtige Molekylær vægte, Kontroller, hvis enzymet er udløbet, øge inkubationstiden, eller kontrollere for at sikre temperaturen er korrekt for dette enzym.
Når reaktionen er afsluttet, kan prøverne indlæses i en gel. Først, en gel er indlæst i objektbeholderen gel og nedsænket i 1 x TAE buffer. Næste, fordøjet DNA er blandet med indlæsning af farvestof og løsningen er indlæst i wells af gelen. Låget er gled og ledningerne er fastgjort til boksen gel. En mørk papir, der Tapes sammen, er placeret på toppen af låget til at dække låg og drapere over siderne. En anden kritisk trin er, at prøverne er beskyttet mod lyset på alle tidspunkter, især mens gelen kører. Strømforsyningen skal være tændt og slukket lys i rummet. For at forhindre photocleavage af DNA, er prøver beskyttet mod lys hele tiden. Hvis der er intet mørke papir, kan et mørkt stof bruges som godt. Hvis DNA ikke flyttes, Sørg for ledningerne er forbundet til boksen og køre-knappen har været trykket.
Om morgenen, tag gelen ud af boksen gel og indlæse gel i en beholder, der indeholder ethidiumbromid. Ethidiumbromid gør det muligt for os at se DNA bands under den blå lys transilluminator (figur 2). Andre farvestoffer kan bruges i stedet for ethidiumbromid. Et kamera kan være monteret over det blå lys transilluminator at fange billeder af gelen. Afhængigt af konfigurationen, kan en billeddannelse station også udnyttes.
Denne metode kan anvendes til ethvert farvestof, som intercalates eller pletter DNA, ikke bare TOTO serien. Maschmann mfl. modificeret en teknik udviklet af Meng mfl. for at afgøre, om fluorescently farves DNA kan fordøjes med restriktionsenzymer24,25. Dette er den eneste teknik udnyttet til at bestemme, hvis pre farves DNA påvirker restriktionsenzymer. Denne metode er begrænset til restriktionsenzymer kommercielt tilgængelige, medmindre en videnskabsmand har adgang til andre restriktionsenzymer, der ikke er kommercielt. Afhængigt af DNA, enzymet valgt skal have en mærkbar DNA band mønster og nok bands (> 3) til at afgøre, om DNA-molekylet er fuld længde. Også, DNA bør unmethylated hvis methylering følsomme enzymer bruges. Hvis DNA er methylerede, derefter ikke bruge methylering følsomme enzymer.
Denne metode er en brugervenlig måde at bestemme hvis restriktionsenzymer kan skære DNA molekyler på webstedet anerkendelse farves med en intercalating farve uden at behøve at designe primere for en given cut site34. De fremtidige anvendelser af denne metode ville være at afgøre, om fluorescently mærket molekyler fra et eksperiment var fuld længde ved hjælp af en begrænsning enzym og bestemme størrelsen af DNA bands fra digest'en eller at bestemme DNA methylering profiler molekyler. Fremtidige eksperimenter kan også bestemme, hvis nicking enzymer er berørt af cyanine farvestoffer eller andre fluorescerende farvestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af det nationale Institut for almen medicinsk videnskab (NIGMS) (5605100122001), en del af National Institutes of Health (NIH), samt University of Nebraska på Kearney (UNK) sommer studerende Research Program (SSRP) og UNK Undergraduate Research Fellowship (URF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al.
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
