Summary
染色 DNA 分子荧光显微镜允许科学家在实验中看到他们。在这里提出的方法, DNA 分子是前染色的荧光染料和消化的甲基化和非甲基化的敏感限制酶。
Abstract
荧光显微镜的 DNA 可视化利用了各种染料, 如菁染料。这些染料因其对 DNA 的亲和力和敏感性而被利用。为了确定在实验完成后 dna 分子是否全长, 需要用限制性酶消化 dna 来确定染色分子是否全长。然而, 染色的 dna 可能会抑制酶, 因此需要一种方法来确定什么酶可以用于荧光染色 dna。在这种方法中, dna 在一夜之间被染有菁染料, 使染料和 dna 平衡。接下来, 染色 DNA 被一种限制性的酶消化, 装入凝胶和电泳。将实验的 DNA 消化带与在硅片中的文摘进行比较, 以确定限制性酶活性。如果有相同数量的波段如预期, 那么反应是完整的。超过预期的波段表明部分消化和较少的带表示不完全消化。这种方法的优点是它的简单性, 它使用的设备, 科学家将需要一个限制酶检测和凝胶电泳。这种方法的一个局限性是, 大多数科学家可用的酶是商业上可用的酶;但是, 任何限制酶都可以使用。
Introduction
托托系列 (TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3 和 BOBO-3;表 1)用于多种实验, 其中 DNA 的可视化是 必需的1,234568,9,10,11,12,13,14,15,16,17. 由于其量子产率、灵敏度和对 DNA 分子的高亲和性, 使菁二聚体被广泛应用于18、19、20。菁二聚体染料对双链 DNA 有很大的选择性, 当插层有100到1000倍的荧光21。吡啶染料 (YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3 和 TOTO-3) 的发射波长较其 quinolium 染料 (BOBO-1、POPO-1、BOBO-3 和 POPO-3) 相对较短 (表 1)22。此外, 菁聚插入 DNA 的量子产率高 (0.2-0.6)22。然而, 使用一种酶来确定 dna 分子的甲基化分布,2或在已经沾有荧光染料的 dna 分子的拉伸23中需要一种方法来确定什么酶能消化染色的 dna。任何类型的染料, intercalates 成 dna 或任何酶, 提供了一个可辨认的 dna 基质的模式可以用于这种方法。
孟et al.首先通过使用各种不同染料的凝胶电泳测定 prestained DNA 的消化率24。Maschmann 的et al.深入研究了染料的托托系列。两者都确定了染色 dna 的消化率, 看看是否可以用限制性酶25来消化带有特定染料染色的 dna。其他方法研究染料插层与 DNA 的结合效应使用光学镊子26或核磁共振27。任何一种方法都需要专用设备;然而, 这种方法允许大多数分子生物学实验室确定染料是否干扰限制性酶消化的设备。
此外, 在其他测量给定分子长度的方法中, 光学制图在表面上拉长了不 dna 分子, 并消化了 dna, 以确定片段的拉伸和大小。染料的插层显示增加了荧光染色 DNA 分子的轮廓长度, 并根据所使用的染料, 其轮廓长度是不同的21。该方法已在各种基因组中得到了应用 1,3461328293031. 然而, 如果分子是前染色的, 根据染料和酶, 该酶可能无法切割 DNA 染色与给定的染料。因此, 这种方法确定是否 DNA 染色的特定染料可以消化的酶。此外, 根据染料的浓度和染料的使用, 在凝胶中的 dna 带的迁移速度会比原生 dna 的移动慢得多, 因为 dna 骨架部分解除, 使染料空间插入基对32.
然而, 有时这些染料可以部分或完全抑制某些限制性酶的作用7,24。这被认为是由于荧光染料的附着导致 DNA 结构的改变, 这可能会阻止酶识别其特定的序列。了解这些染料如何影响限制性酶可以帮助在实验中的甲基化剖面或染色 DNA 的延伸是必需的。
在我们的方法, DNA 被染色的荧光的兴趣和消化的限制酶。然后在凝胶上电泳 DNA, 对其进行了成像, 并测定了限制性酶消化率。根据凝胶上的切口形态选择限制性酶。太多的波段导致 dna 带的重叠, 而太少的波段没有给出完整的 dna 分子的图像。有一个甜美的斑点, 能够确定的轮廓的消化 DNA 分子;因此, 它将取决于所使用的 DNA 和酶。这种方法的优点是它的简单性;它只需要在限制消化和凝胶电泳中使用的设备。
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Protocol
1. 染料、缓冲剂和琼脂糖凝胶的制备
-
为染色 dna 或对染色 dna 的消化准备下列溶液。
- 制备 1x TE (三盐酸和乙酸酸;edta) 缓冲使用10毫米三盐酸和1毫米 edta 在一个毕业的圆筒或容量烧瓶。室温贮存 (18-25 ° c)。
- 制作每种染料的等分: TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3、BOBO-3 (表 1)。吸管4µL 1 毫米染料到深琥珀色或黑色1.5 毫升管和添加36µL 的 1x TE, 混合使用吸管;这种浓度使100µM 染料溶液 (40 µL 总)。为每种染料完成此步骤。贮存在4° c。
注意: 避免将染料暴露在光中以防止染料漂白或降解。 - 使用10毫米双三丙烷-HCl、10 mm 氯化镁2和100µg/毫升牛血清白蛋白 (BSA) 制备缓冲1。准备2使用50毫米氯化钠, 10 毫米三盐酸, 10 毫米氯化镁2, 和100µg/毫升 BSA。使用50毫米醋酸钾、20毫米三乙酸、10毫米醋酸镁和100µg/毫升 BSA 制备缓冲3。每个酶都需要这些特定的缓冲器来起作用。
-
准备以下溶液凝胶电泳。
- 将0.25% 溴蓝色、0.25% 二甲苯蓝、15% 聚在 dH2o 中存储在室温下, 制作一个6x 加载染料。
- 为了使0.7% 琼脂糖凝胶, 称0.07 克的高凝胶温度 (HGT) 琼脂糖在一个锥形瓶, 增加100毫升的1x 泰缓冲区, 并放置一个倒置烧杯的顶部的烧瓶。
- 在热板上加热溶液, 直到气泡开始在烧瓶底部形成并浮到顶端。
- 从热板中取出溶液, 让溶液冷却, 直到烧瓶可以徒手触碰, 然后将凝胶倒入 24.5 cm x 21.8 厘米的凝胶模中, 用凝胶梳来制造水井。
- 在梳子或凝胶的表面上取出气泡, 用吸管顶端弹出, 让凝胶凝固至少15分钟。这可以储存在一个冰箱 (4 ° c) 包裹在塑料包装1周, 以防止干燥的凝胶或污染。有关如何运行凝胶的详细信息, 请参阅 Lee et al.33.
注: 使用30个单独的井的凝胶梳子。每井应该是4.5 毫米宽与深度2毫米。井的高度将取决于倒入盒子的凝胶量。
- 用40毫米三盐酸、20毫米醋酸和1毫米 edta 制备1x 泰 (三乙酸-edta) 缓冲液。室温贮存 (18-25 ° c)。
2. 染色 DNA 的制备
-
使用不同的染料等分染色的λ DNA (300-800 ng)。每个染料 (表 1) 将有六不同浓度的测试, 为48的反应, 每限制酶。以下过程概述了1反应的设置 (图 1)。
- 在4° c 下, 用 1x TE 稀释 100 ng/µL 的λ DNA。用300µL 的总体积来解决。
- 染色化λ DNA对于每个预期从文摘, 估计 75-100 ng/波段。添加适量的染料, 以产生浓度1.9 µM, 3.8 µM, 19.4 µM, 32.2 µM, 48.3 µM, 63.5 µM/100 ng 的 DNA。
- 在4° c 的夜间孵育 (15 小时-18 小时)。
- 让一个反应不作为控件25。
注: 使用化 DNA 进行消化反应。甲基化敏感的酶不能在 DNA 中切割细胞化区域, 并且会出现不完全消化的现象。
3. 限制性酶法的制备
-
用限制性酶消化染色 dna, 以确定该酶是否能消化 prestained dna (图 1)。
- 次日, 增加 20 U 限制性酵素, 3 µL 适当的缓冲 (表 2) 和蒸馏, 蒸压和过滤的水共计30µL。对于每种酶反应, 选择具有最高切削效率的缓冲器, 可在制造商的网站上找到。
- 将反应放在水浴中, 在最佳酶活性的温度下, 表2列出了 Maschmann et al中使用的6种酶, 用于 2-4 h (表 2)25。
- 停止反应, 增加2µL 0.5 米 EDTA pH 8.0。
4. 琼脂糖凝胶 Electroeluting 染色 DNA
- 去除侧面从 24.5 cm x 21.8 cm 胶凝体模子 (步 1.2.2) 和安置胶凝体入胶凝体电泳箱。倒入2.5 升的1x 泰缓冲器到盒子里。小心地从凝胶中取出凝胶梳, 使井可访问33。
- 将限制酶反应移到塑料薄膜上, 并将每个反应与6x 加载染料结合起来。对于每个反应溶液, 添加1µL 6x 负载染料每 5-6 µL 的 DNA 溶液 (1x)。然后吸管的反应 (载入染料, < 18 µL) 入井。
- 混合1µL 1 kb 阶梯, 9 µL 1x TE, 2 µL 6x 负载染料。加载解决方案的井侧翼的其他解决方案。
- 用深蓝色或黑色的纸或织物覆盖凝胶盒。将凝胶盒连接到电源, 将电源设置为30伏, 并在夜间运行 (15-20 小时)。在凝胶运行时关灯, 以防止 photocleavage 标记的 DNA。
- 第二天早上关掉电源。采取的凝胶使用托盘和转移到一个容器与45µL 溴溴和1升的1x 泰缓冲区。在室温下将容器存放在黑暗中或用箔盖住, 以防暴露在光线下。让凝胶染色至少45分钟室温。
注意: 使用溴溴化物和手套, 戴上安全眼镜。在清理含有溴溴溶液的容器并扔掉凝胶时, 请参考您的状态处置指南, 以确定如何处理使用过的溴溴化物;此外, 还可以使用其他污渍代替溴溴化物。
5. 琼脂糖凝胶的成像
- 将凝胶放在蓝色光 transilluminator 上, 在400-500 纳米之间发出最大的光输出。与连接到车站的摄像头拍照。
注意: 请务必使用照明灯的盖子, 在打开光源之前戴上防护眼镜。
注: 此步骤也可使用任何 UV 光源或标准的凝胶扫描仪完成。 - 通过将文件拖到 ImageJ 状态栏中查看 ImageJ 中的图片, 图像会弹出。
- 通过比较凝胶的带与预期的在硅中凝胶模式, 确定实验的消化率。为了确定消化率, 实验波段的数量除以预期的 DNA 带数24,25。如果实验消化的 DNA 带模式有预期的模式, 消化率为1。如果图案的碎片比预期的多, 则消化率大于1。如果模式的碎片少于预期, 则消化率小于1。
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Representative Results
为了确定插染料是否会影响消化 DNA 的限制性酶, 必须遵循正确的步骤顺序 (图 1)。一旦 DNA 被一种特定的酶染色和消化, 可以采取凝胶的图片来确定碎片的数量及其大小 (图 2)。为了确定酶的效率, 预期可见带的总数除以可见带数。酶的效率等同于统一, 如果数量的波段预期和看到匹配。如果在凝胶上有更多的带, 然后预期, 该值大于 1, 并表明部分消化反应。如果有较少的波段, 然后预期, 那么该值小于 1, 这表明不完全消化。在图 2a中, 车道3和4显示了频带的移动性下降, 导致带向井的方向移动。在车道1和 2, 染料的数量不影响机动性引人注目地, 因此乐队匹配控制。在图 2a中, 车道5和6显示的频带比控件多, 因此它表示部分消化。这意味着, 染料影响了 DNA 在该酶的识别点的裂解。在图 2b中, 所有染料浓度都能看到所有预期波段, 因此染料不会干扰 DNA 的消化。图 2c使用彩色星号跟踪移动性转移。
随着染料浓度的增加, 染料与-1, 流动性下降。为了确定带的近似大小, 需要一个控制来知道与染色 dna (图 2a) 相比, 本机 dna 分子的预期位置。对于-3 的染料来说, 移动性并没有减少到-1 染料的作用范围, 因此更容易确定片段的大小 (图 2b)。移动性差异是由于染料的使用类型, 如 Maschmann et al.中所示25。由于染料的结构, 这些染料的方差是可见的。染料-3 的芳香基团之间的连接器长于-1。染料可能1583年略有不同, 由于不同的连接器的大小, 这可能解释为什么移动转移的-3 染料较少。
如果没有 dna, 或者 dna 带在凝胶中非常微弱, 那么就需要增加 dna 的浓度。然而, 如果 dna 浓度增加, 那么所需染料的数量也将增加, 以保持正确的染料浓度的 dna 比。
图 1:在消化荧光标记的 DNA 分子时所需步骤的示意图。DNA 和 YOYO-1, 或另一种染料从托托系列, 被添加到一个黑色管和孵化过夜 (O/N; 15-20 小时)。在管中加入限制酶;它被放置在恒温箱中, 温度为 2-4 h (表 2)。将样品装入浸入式0.7% 琼脂糖凝胶中, 用1x 泰式缓冲器制成。深色的纸覆盖了凝胶盒, 灯被关闭, 而凝胶是通宵运行, 以防止 photocleavage 的染料。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:限制消化的 DNA 插层的菁二聚体染料。(a) Lambda DNA 在一夜之间用不同浓度的 YOYO-1 染色 (车道 C: 被消化的 Lambda 脱氧核糖核酸没有染料 (控制), 车道 1: 1.9 ng, 车道 2: 3.8 ng, 车道 3: 19.4 ng, 车道 4: 32.2 ng, 车道 5: 48.3 ng, 车道 6: 63.5 ng 染料每 100 ng 脱氧核糖核酸) 然后帝sted 与 EcoRI 在37° c 为 2-4 h。所有反应都是电泳 (E = 0.85 伏/厘米) 在0.7% 高胶凝温度 (HGT) 琼脂糖凝胶制成的1x 泰式缓冲 (1x 泰; 40 毫米三盐酸, 20 毫米醋酸, 1 毫米 EDTA)。凝胶用溴溴化物染色, 用蓝光 transilluminator 与照相机耦合成像。L 车道是一个 1 kb 梯子 (大小, kb);车道λ是全长的λ DNA;车道 E 是预期的波段模式 (大小, kb)。(b) Lambda DNA 沾有 YOYO-3 (车道 1: 1.9 ng, 车道 2: 3.8 ng, 车道 3: 19.4 ng, 车道 4: 32.2 ng, 车道 5: 48.3 ng, 车道 6: 63.5 ng 染料每 100 ng) 并且在37° c 消化与酶。(c) 要查看移动性如何随着 YOYO-1 浓度的增加而转移, 彩色星号位于每个 YOYO-1 集中的每个波段的旁边。例如, 3.5 kb 的频带在每个 YOYO-1 集中的每个波段旁边都有一个红色星号。5和6条中的意外频带在带旁边没有星号。该图从 Maschmann et al.中修改25. 版权所有 (2017) 苷、核苷酸和核酸。请单击此处查看此图的较大版本.
| 化学名称 | 缩写名称 | 前/Em (nm) |
| [(1–1′-[13-propanediylbis [(dimethyliminio)-31-propanediyl] 双 [4-[(3-甲基-2 (3 h)-benzothiazolylidene) 甲基]]-, 铱 | TOTO-1 | 514/533 |
| 1,1′-(44, 88-四甲基-48-diazaundecamethylene) 之二 [4-[(3-甲基-13-恶-2-基) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] 铱} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2,2-[13-支柱-anediylbis [(dimethyliminio)-31-propanediyl-1 (4 h)-吡啶-4-ylidenemethylid-yne]] 双 [3-甲基]-, 铱 | POPO-1 | 434/456 |
| 2,2-[13-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-31-propanediyl-1 (4 h)-吡啶-4–1,1′-[48-双 (dimethyliminio) 十一-111-酚] 双 {4-[3-(3-甲基-13-噻唑-2 (3 h)-ylidene) 支柱-1-en 1-基] 奎-nolinium} | BOBO-1 | 462/481 |
| 2,2-{[48 双 (dimethyliminio) 十一-111-酚] 之二 [喹啉-1-基-4-ylideneprop-1-en-1-基-3-ylidene]} 双 (3-甲基-13-噻唑-3-ium) tetraio-得 | TOTO-3 | 642/660 |
| 1,1′-[13-propanediylbis [(dimethyliminio)-31-propanediyl]]] 双 [4-[3-(3-甲基-2 (3 h)-benzoxazolylidene)-1-丙烯]]-, 铱 | YOYO-3 | 612/631 |
| 2,2-[13-propanediylbis [(dimethyliminio)-31-propanediyl-1 (4 h)-吡啶-4-ylidene-1-pr-打开-1-基-3-ylidene]] 双 [3-甲基]-, 铱 | POPO-3 | 534/570 |
| 22 '-{丙烷-13-diylbis [(dimethylazaniumdiyl) 丙烷-31-diylpyridin-1-基-4-ylideneprop-1-en-1-基-3-ylidene]} 双 (3-甲基-13-噻唑-3-ium) 铱 | BOBO-3 | 570/602 |
表 1:托托系列染料的缩写名称与 IUPAC 名称与发射 (Em) 和励磁 (Ex) maximima22.
| 酶 | 甲基化敏感 | 缓冲区 | 水浴温度 |
| BamHI | 不 | 2 | 37° c |
| EcoRI | 是的 | 2 | 37° c |
| 酶 | 不 | 2 | 37° c |
| PmlI | 是的 | 1 | 37° c |
| 计算机应用 | 不 | 2 | 37° c |
| SmaI | 是的 | 3 | 25° c |
表 2:表中列出的是可能在这些实验中使用的酶的子集.三酵素是甲基化敏感和三不是甲基化敏感。用于酵素和孵化温度的缓冲被列出为每个酵素。
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Discussion
为了消化荧光标记的 DNA (图 1), 需要一系列步骤。首先, DNA 在一夜之间被荧光染色。DNA 可以用青菁聚孵育一段较短的时间;但是, 卡尔松et al.发现, 由于不完整的染色20, dna 为每个 dna 大小创建了双波段。为了纠正这种现象, DNA 可以在一夜之间被染色以防止双波段的发生。这是协议中的关键步骤。如果染料没有孵育足够长的时间, 染料-DNA 可能不会处于平衡状态, 并会给出一个双带状的模式。如果发生这种情况, 允许 DNA 染料混合物平衡一段较长的时间。
接下来, 在 DNA 染料混合物中加入限制性酶, 并在每种酶的特定温度下消化 2-4 h。DNA 必须化甲基化敏感酶。如果不是这样, 甲基化 dna 将抑制限制性酶的切割 dna 在甲基的区域。此外, 反应必须在正确的缓冲和温度下孵化酶。每个酶都有一个缓冲列表和每个缓冲区中的酶活性。如果可能的话, 选择100% 酶活性的缓冲液。至于温度, 确保它是在正确的温度下孵化。如果它不是, 它可能导致酵素丢失活动或变性, 如果温度太高。EDTA 用于停止反应。所购买的酶的公司将有一个图表与最佳的温度和缓冲条件的酶。如果控制不给正确的分子量的波段, 检查是否酶过期, 增加孵化时间, 或检查, 以确保该酶的温度是正确的。
一旦反应完成, 样品可以被装入胶凝体。首先, 将凝胶装入凝胶容器中, 浸入1x 泰式缓冲液中。然后, 将所消化的 DNA 与加载染料混合, 并将溶液加载到凝胶的井中。盖子滑过, 电线连接到凝胶盒。一张黑色的纸, 被绑在一起, 放在盖子的盖子上, 盖在两边。另一个关键的步骤是, 样品在任何时候都受到光照的保护, 特别是在凝胶运行的时候。电源应该打开, 房间的灯关了。为了防止 DNA 的 photocleavage, 样品从光一直被保护。如果没有深色纸张, 也可以使用深色的布。如果 DNA 不移动, 请确保电线连接到盒子上, 并按下 "运行" 按钮。
早上, 从凝胶盒中取出凝胶, 将凝胶装入含有溴溴化物的容器中。溴溴化物允许我们看到蓝光 transilluminator 下的 DNA 带 (图 2)。其他染料可用于取代溴溴。摄像头可以安装在蓝光 transilluminator 上, 以捕捉凝胶的图片。根据设置, 还可以使用成像工作站。
这种方法可以用于任何染料, intercalates 或染色的 DNA, 而不仅仅是托托系列。Maschmann et al。修改了由孟et al开发的技术。为了确定荧光染色的 DNA 是否可以用限制性酶来消化24,25。这是唯一的技术, 以确定是否前染色 DNA 影响限制酶。这种方法仅限于商业上可用的限制性酶, 除非科学家有机会获得其他未在商业上上市的限制性酶。根据 dna, 所选择的酶应该有一个可辨别的 dna 带模式和足够的波段 (> 3) 来确定 dna 分子是否全长。此外, 如果使用甲基化敏感酶, DNA 应该是化的。如果 DNA 是甲基化的, 那么就不要使用甲基敏感酶。
这种方法是一种易于使用的方法, 以确定是否限制酶可以削减 DNA 分子在识别网站染色的插染料不需要设计底漆为给定的切割网站34。这个方法的未来应用将是确定是否荧光标记的分子从实验是全长通过使用限制酵素和确定脱氧核糖核酸带的大小从文摘或确定甲基化外形脱氧核糖核酸分子.未来的实验还可以确定偷酶是否受到菁染料或其他荧光染料的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由国家普通医学科学研究所 (研究院) (5605100122001)、国立卫生研究院 (NIH) 的一个组成部分以及内布拉斯加州大学科尔尼 (UNK) 暑期学生研究计划 (SSRP) 和 UNK本科研究奖学金 (报告)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
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