Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57148
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1
1Department of Pathology, Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta, 2Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta, 3Department of Physiology & Biochemistry, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta

Summary

חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. כתב יד זה מתאר אופטימיזציה של פאנל של סמנים ביולוגיים שימוש assay חרוז מגנטי מולטיפלקס לסווג סרטן השד.

Abstract

חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. ג'ין הגברה וביטוי אבחון בדיקה באמצעות חומר ארכיוני או חומר הדורש תחבורה כדי מתן שירות מעבדות, צריך מבחן מדויק ועמיד יותר הותאם זרימות העבודה הקלינית הנוכחית. צוות המחקר שלנו ממוטב לשימוש Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo ופישר סיינטיפיק) לכמת RNA בחומר ארכיוני באמצעות טכנולוגיה של הקנים-דנ א (bDNA) על Luminex xMAP® beads מגנטי. ביטוי גנים וזמינותו המתואר בכתב היד הוא הרומן, מהיר, מולטיפלקס שיטה זאת במדויק לסווג סרטן השד לתוך תת מולקולריים שונים, תוך השמטת את הסובייקטיביות של פרשנות הטמונה בטכניקות הדמיה. בנוסף, בשל קלט נמוך של החומר הנדרש, הטרוגניות גידולים יכולים להיות microdissected לייזר באמצעות Hematoxylin, סעיפים מוכתמים אאוזין (H & E). בשיטה זו יש מגוון רחב של יישומים אפשריים כולל סיווג הגידול עם פוטנציאל אבחון ומדידה של סמנים ביולוגיים ביופסיות נוזלי, אשר תאפשר ניהול החולה טוב יותר וניטור מחלות. בנוסף, המדידה כמותית של סמנים חומר ארכיוני שימושית במחקר אונקולוגיה עם גישה לספריות של חומר מבואר קלינית, שבו לימודי רטרוספקטיבי יכול לאמת סמנים ביולוגיים פוטנציאליים והתוצאה הקלינית שלהם המתאם.

Introduction

אופטימיזציה של RNA המבוסס על מבחני באמצעות פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) חומר ארכיוני הוא מאתגר עקב השתנות כירורגית ברקמה, השפלה של RNA הנגרמת על ידי פורמלין משמש לרקמות שלמות שימור1, 2. כדי להתגבר על המגבלה של ביצוע מחקרים ביטוי גנטי מדויק של חומר ארכיוני, הקבוצה שלנו משמש bDNA חרוז מגנטי מולטיפלקס וזמינותו. במקום הגברה אנזימטי של תבנית היעד, הטכנולוגיה bDNA משתמש הכלאה של הגששים ספציפיים, הגברה של האות כתב3. רצפי זיהוי קצר הגששים לכידת וזיהוי נועדו hybridize כדי קצר שברי היעד רנ א4. בנוסף, השימוש של רקמת homogenates החומר המוצא הישיר הזה assay, מתגבר על אובדן בלתי נמנע של RNA הנובעת מבחני דרישה מוקדמת RNA מיצוי וטיהור. הגברה של האות, השימוש של רצפי זיהוי קצר והכללת צעד טיהור, לתרום הקטן בוריאציה טכני של וזמינותו. הטכנולוגיה מספק את האפשרות מגה-פלקס וזמינותו (מטרות RNA עד 80) ולמדוד את הביטוי של פאנל של מטרות מחומר נמוך קלט. פרוטוקול זה מתאר ההכנה מכתים של דגימות רקמה עבור לייזר microdissection. צביעת בשקופיות ממברנה להקל על ההדמיה של הגידול, אדריכלות היסטולוגית לספק בחירה מדויקת, יצירת פרופילים של: (1) הגידול ואת צינורות רגילים ברקמת השד (2) תא ממאיר שיבוטים בתוך גידולים הטרוגנית.

סיווג מולקולרית של סרטן השד הוא תהליך חוקר סמנים מולקולריים לסווג המטופל גידולים לתוך שלוש מחלקות מולקולרית, קרי, luminal, אנושי גורם הגדילה באפידרמיס קולטן 2 (HER2)-סוג של מועשר, ואת הבסיס. המשנה מועשרת HER2 היא מוגדרת היטב, עם ביטוי גבוהה של הקולטן HER2, עקב ERBB2 ג'ין הגברה, בשילוב עם נמוך או נעדר קולטן אסטרוגן (ER), קולטני פרוגסטרון (PgR). המשנה luminal הוא בדרך כלל חיובי עבור מיון המשנה הבזליים הם כללי שלילי עבור שלושה קולטנים (HER2, המיון, PgR) וכן באופן משמעותי חופף עם5,6סוג של אבחון סרטן (TNBC) חזה משולש שלילי. סמנים אחרים משמשים כדי לקבוע מאפייני האפיתל, mesenchymal. Fibronectin (FN1) הוא מרכיב העיקרי של תא mesenchymal של רקמת השד. הביטוי FN1 מוגברת מלווה Ki67 גבוהה מכתים, ואת מראה חתימה עבור7,גידול פולשניים יותר8 והיא קשורה עם גרורות9. מעניין, FN1 נמצאה להיות נוכח שמקורן תאי הגידול, שהביאה הפעלה של אותות mitogenic fibroblasts הנמען10. שלפוחיות זעירות. לפיכך, ונע שלפוחיות זעירות כמו exosomes הם סימן פוטנציאל לגילוי מוקדם או גרורות, נסיגה11.

בחירה באזור הגידול עבור subtyping תעתיק סרטן השד שהדו-שיח בוצע על ידי macrodissection12,13. כדי להתגבר על רקמות הטרוגניות להגביר את רגישות, שילבנו באופן אמין רקמה קלאסית מכתים עם מולטיפלקס שיטות פרופיל מולקולרית. מהווה הוכחה של עיקרון שני שכפולים סרטן השד ברורים שהוגדרו ע י חתימה mesenchymal אפיתל ופוטנציאל גרורתי שלהם. זרימת העבודה של הפרוטוקול המתואר יכול להיות בקלות לתרגם את ההתקנה הקלינית הנוכחית, נהגה באופן סלקטיבי לבודד ולאפיין סוגי רקמות באמצעות פרופיל mRNA יישוב.

Protocol

אתי אישור לשימוש בחומר רקמת השד במחקר זה היה מתקבל מ- אוניברסיטת מחקר אתיקה הוועדה (UREC) של אוניברסיטת מלטה (Ref: 22/2012).

1. רקמות הכנה

  1. שימוש המתאים H & E הליכים14, להכין הפניה מוכתם מקטעי רקמת ולסרוק דיגיטלית השקופיות לעיון במהלך microdissection.
  2. שימוש של מיקרוטום, לחתוך 20 סעיפים רקמות מיקרומטר לתוך אמבט מים נטולי RNAse ב 40 º C. לאסוף את הסעיפים בשקופיות קרום עבור microdissection לייזר באמצעות ציוד נקי, ושוקמו RNase וחומרים.
  3. יבש את השקופיות ממברנה-37 מעלות צלזיוס חממה ייבוש למשך הלילה. הכתם באמצעות ה המתאים H & E נוהל15 עם ביולוגיה מולקולרית כיתה פתרונות והגברת הזמן ההגדלה של Hematoxylin 6 דקות. אם נדרש, מכתים את השקופיות קרום עם ה פרוטוקולים המתאים immunohistochemical16.

2. לייזר Microdissection

  1. להגדיר את הגבולות לשקופיות, לכייל את התנועה הבמה.
    1. להזיז את התצוגה לייזר על גבי אזור ריק של שקופית ממברנה. כיילו את המוקד לייזר על ידי ירי לייזר ירה הגדלת מרווחי המוקד (5%) עד הלייזר מתחיל לחדור הקרום. צייר, microdissect כל צורה, finetune המוקד לייזר כדי למקסם את היעילות לייזר במהלך ניתוח לייזר.
    2. להגדיל את מהירות התנועה של שלב עד לנקודה שבה יעילות ניתוח לייזר לא נפגעת. לכייל את הלייזר בעדשה המטרה שנבחרה, לכייל מחדש אם שינוי מטרות (מהירות לייזר-1 – 15%), ההתמקדות ב 70-75%, ואת כוח על 90-100% בעת השימוש המטרה X 4.
  2. סרוק את השקופיות מוכתם ממברנה בעזרת המטרה X 4.
  3. בחר ולאחר להקיף את אזורי microdissection בשקופית ממברנה. לייזר לנתח שטח מינימלי של 42 מ מ2. הרשומה באזור גזור כדי לקבוע את עוצמת הקול של מאגר homogenizing הדגימה כדי לשמש.
  4. השתמש מנגנון הרמת הכובע כדי לאחזר את המקטע גזור על גבי הפקקים מפזר של שכותרתו צינורות המחוברים את התוספתן המתאים. אם המקטע ביתור לא מאוחזר על הכיפה, חזור על ניתוח לייזר של האזור.

3. רקמות פירוק

הערה: מספר פתרונות וחומרים מסופקים יחד עם ערכות הזכיר את הטבלה של חומרים.

  1. להכין האחסון תערובת homogenizing נדרש פירוק מדגם באמצעות פתרון ו proteinase K homogenizing ביחס 60:1.
  2. פיפטה 2.4 µL של homogenizing פתרון לתוך כל שפופרת עבור כל 1 מ2 אזור הרקמה, מערבולת 10 s מהירות מירבית, ו צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 s ב 2,500 x g.
  3. דגירה בבלוק חימום-65 מעלות צלזיוס במשך 12-18 h ברעידות-600 סל ד.
  4. Centrifuge את lysates על 21,000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. באמצעות פיפטה של, בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע ברורה, לוותר על תוך צינור טריים עם תוויות. הימנע כ רפה בעברית שברי רקמת/קרום כמו זה עשוי להפחית את האיכות של תוצאות.
  6. אחסן את תגובת שיקוע ברור במקפיא-80 ° C.

4. הכלאה מבוססי Assay

  1. לבצע את ההכנות הבאות.
    1. לחמם את התערובת פירוק על ידי הצבת את הבקבוק ריאגנט באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך.
    2. אם homogenates רקמת מוקפאים, להפשיר בטמפרטורת החדר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מערבולת הדגימות במהירות המרבית בעקבות הדגירה.
    3. הגדר החממה חזק ב 54 ° C ולמקם את החללית של ערכת אימות טמפרטורה טוב ריק של צלחת 96-ובכן. לאחר 2 h לבדוק את הטמפרטורה על המדחום הדיגיטלי ולהגדיר את הטמפרטורה דלתא של טלטול חממה לתיקון כל הבדל טמפרטורה.
    4. הפשרה, מערבולת החללית להגדיר וחסימת מגיב 10 s, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 s ב 2500 x g, ולשמור על קרח.
    5. שמור את המבחנה Proteinase K על קרח במהלך השימוש.
    6. Sonicate את החרוזים לכידת ב 46 קילו-הרץ למשך 3 דקות, ואז מערבולת במהירות המרבית עבור עוד 3 דקות.
  2. להכין תערובת חרוז העבודה µL 25 לכל טוב על-ידי אולם שינוי קנה המידה של ריאגנטים הבאים בהתאם: 4.25 µL של נוקלאז ללא מים, µL 16.65 תערובת פירוק, µL 1.00 של חסימת ריאגנט µL 0.10 של Proteinase K, µL 0.50 של לכידת חרוזים, µL 2.50 של ערכת בדיקה.
  3. מערבולת המיקס חרוז העבודה 10 s במהירות המרבית, ואז פיפטה µL 25/טוב המשקולת הפרדה מגנטית.
  4. פיפטה 25 µL רקמות homogenate צלחת הפרדה מגנטית 96-ובכן, 25 µL homogenizing פתרון 3 בארות כמו החסר.
  5. לאטום את הצלחת הפרדה מגנטית באמצעות אטם לחץ פלסטיק שקוף ומניחים את הצלחת בחממה ב 54 ± 1 ° C עבור 18-22 h תוך טלטול-600 סל ד.
  6. להכין 1 X שטיפת בופר עבור 24 בארות על ידי ערבוב 31.5 מיליליטר RNase ללא מים עם 0.1 מ"ל של שטיפת מאגר רכיב 1 ו- 1.67 מ"ל של שטיפת מאגר רכיב 2.
  7. הסר את הלוחית של חממה. הגדר את הטמפרטורה של החממה חזק 50 ± 1 ° C.
  8. לטעון את הצלחת הפרדה מגנטית על כף יד צלחת מגנטית למכונת הכביסה ונעל במקום. להסיר את החותם לחץ והמתן 1 דקות בשביל החרוזים מגנטי להתיישב.
  9. שלב כביסה: היפוך את הצלחת הפרדה מגנטית רכוב על צלחת מעל הכיור ואת כתם בעדינות על נייר טישו כדי להסיר שאריות פתרון. בעזרת פיפטה רב-ערוצי להוסיף 100 µL 1 X שטיפת בופר לבאר כל, חכה 15 ס חזור על שלב זה כדי לשטוף את הצלחת 3 פעמים.
  10. פיפטה µL 50 מהתרכובת קדם מגבר ל מכל קידוח. לאטום את הצלחת בחותם לוחית אלומיניום ומנערים את הצלחת-800 סל ד עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. תקופת דגירה של h 1-50 ± 1 ° C תוך טלטול-600 סל ד.
  11. חזור על שלב 4.9 (שלב כביסה).
  12. פיפטה µL 50 מהתרכובת מגבר ל מכל קידוח. לאטום את הצלחת בחותם לוחית אלומיניום ומנערים את הצלחת כמו שלב 4.10.
  13. חזור על שלב 4.9 (שלב כביסה).
  14. מערבולת החללית תווית עבור 10 s במהירות המרבית. להוסיף 50 µL של המכשיר תווית כל טוב. חותם ומנערים את הצלחת (שלב 4.10).
  15. חזור על שלב 4.9 (שטיפת שלב).
  16. מערבולת phycoerythrin Streptavidin (SAPE) עבור 10 s במהירות המרבית. להוסיף 50 µL של SAPE כל טוב. חותם ומנערים את הצלחת (שלב 4.10).
  17. חזור על שלב 4.9 (שלב כביסה) למעט שימוש המאגר לשטוף SAPE במקום לשטוף בופר.
  18. להוסיף µL 130 SAPE שטיפת מאגר כל צלחת טוב, החותם בחותם לוחית אלומיניום. לנער את הצלחת-800 סל ד בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  19. סטארט-אפ במנתח חרוז מגנטי. בצע את השגרה כיול ואימות לפי הוראות היצרן.
  20. להגדיר את פרוטוקול במנתח חרוז מגנטי באמצעות הפרמטרים הבאים: גודל המדגם: 100 µL; שער DD: 5,000 – 25,000; פסק זמן: 90 s; אזור האירוע/חרוז חרוז: 100; ולחץ על הבא. בחר את המספרים המתאימים חרוז שבלוח ולהגדיר את האזורים חרוז עם הגנים המתאימים המטרה כמצוין על-ידי היצרן.
  21. הוסף ניתוח חדש על-ידי בחירה "ליצור אצווה באמצעות פרוטוקול קיים" מתוך הכרטיסיה קבוצות . צלחת פריסה תייעד הבארות לא ידוע או ריק, בהתאמה, לספק תווית עבור כל דגימה בחלונית ' דוגמיות '.
  22. להסיר את החותם לוחית אלומיניום מהצלחת 96-ובכן התגובה. להוציא את המגש צלחת על ידי לחיצה על לחצן ההוצאה , לטעון את הצלחת לתוך במנתח חרוז מגנטי. לחץ על משכי| הפעלת אצווה כדי ליזום את מנתח. אחרי הקריאה, הוצאה, הסר את לוחית 96-ובכן. נקי, כיבוי במנתח חרוז מגנטי כפי המומלץ על ידי היצרן.

5. ניתוח נתונים

  1. ב אצווה| תוצאות בכרטיסיה, בחר את הקובץ ניתוח המתאימים ולחץ על לחצן ייצוא to.csv . The.csv פתח קובץ באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני.
  2. לצפות את ספירת חרוז ולהשמיט את תוצאות כלשהן עם < 40 חרוזים/אזור.
  3. ממוצעים הערכים הבארות ריק והתאמנו את סטיית התקן (SD) ואת מגבלת זיהוי (לוד) (בלנק ממוצע + (3xSD)) לכל מטרה ג'ין. הגדר את ערכי נמוך יותר לוד בתור מבלי שיבחינו.
    הערה: אם הערכים בביטוי תהליך מבלי שיבחינו, מחשיבים את הנתונים לדוגמה כמו לקוי. שקול ביטוי ערכים מעל 20,000 כמו מעל הגבול העליון רגישות. Lysates הדוגמאות הללו צריכים להיות מדולל וניתח מחדש.
  4. הפחת הממוצע ריק מן הנתונים הגולמיים לכל הגנים.
  5. חשב את הממוצע הגאומטרי של גנים תהליך שנבחר עבור דגימה. לנרמל את הנתונים לדוגמה בודדים כדי הממוצע הגיאומטרי בהתאמה.
  6. לנתח את הנתונים על פלטפורמות המדע נתונים או באמצעות האלגוריתמים מוגדרים.
    1. לייבא את הנתונים לתוך פלטפורמת המדע נתונים על-ידי לחיצה על הוסף נתונים. לגרור את קובץ הנתונים סביבת עבודה התהליך , להתחבר למפעיל [בחר תכונות] , ואז העיקרית ניתוח גורמים (PCA) מרכזיה, אז אל הנמל t תוצאות הבדיקות.
    2. התכונה בחר אופרטור בחר את ערכת המשנה של נתונים מנורמל ג'ין משתנה נומינלי כמו סוג של סרטן השד. הפעל את התהליך על-ידי לחיצה על הפעל. בכרטיסיה תרשימים בחר את "פיזור צבע תלת-ממד" סגנון תרשים ואת המשתנה הנומינלי בשדה הצבע . להעריך את מידת ההשתנות נתונים PCA על מגרש תלת-ממדי.

Representative Results

השיטה המתוארת הוחל עבור המידה בו זמנית של תעתיקים 40 ב H & E צבעונית (איור 1), microdissected (איור 2) מאוד מושפל FFPE חומר. באמצעות שיטה זו, אנו מראים אפיון מדויק של קולטן סטטוס (איור 3 א), סיווג של גידולים לתוך luminal, הבסיס המולקולרי יחוברו17, וביטוי דיפרנציאלית של דה מרקר mesenchymal, FN1, בעת השוואת גידול בקרה מתאימים רקמות (איור 3B), שונים קולטן חיובי ושלילי סוגי המשנה.

Figure 1
איור 1: ביטוי גנים באמצעות H & E צבעונית חומר. מתאם בין פרופיל הביטוי נגזר מקטע הגידול מוכתם לעומת מקטע הגידול מוכתם. [מתאם פירסון p-ערך = 5.34E-26]. מרובה עם הרשאה17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: לייזר microdissection של רקמות FFPE. (א) H & E מוכתם שקופיות; Immunohistochemical (B) צביעת עבור ביטוי מיון; (ג) HER2 נוגדן; (ד) סעיף 20 מיקרומטר מוכתם בשקופיות ממברנה microdissection לייזר. החץ הצהוב מצביע על שטח של גידול פולשני זה הוא לא ברור התחום בשל חוסר מכתים. סעיף 20 מיקרומטר (E) A מוכתם H & E על תיחום טוב יותר של תחומי עניין. החצים הלבנים מציינים שובל ניתוח לייזר בעוד החץ האדום מראה את המוקד לייזר בזמן לנתיחה. כל האיורים נלכדו בהגדלה x 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הביטוי של מצב קולטן (א) ו (ב) mesenchymal סמן FN1, בעוד הגידול השד בהשוואה מתאימים נורמלי. תת-סוגי סרטן השד אבחון קלאסית מוגדרים לפי תוצאות האבחון באמצעות אימונוהיסטוכימיה, קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) עבור HER2 דו-משמעית נוגדן. הביטוי המנורמל של HER2 (A) ו- ER, FN1 (B) נמדדת וזמינותו מבוסס-הכלאה מאויר באיורים HER2 חיובי, ER חיובי ויש מקרים TNBC בהשוואה המטופל מתאימים רקמת השד רגיל. הנתון הסטטיסטי מבחן ווליס Kruskal (K-W χ2) מראה כי הביטוי של HER2 באופן משמעותי (p < 0.05) ברקמת הגידול ולא הרקמות מתאימים במדגם HER2 חיובי ויותר נמוך משמעותית במדגם TNBC. ביטוי מיון לא נמצאה להיות גבוה משמעותית בתוך רקמת הגידול בניגוד רגיל מתאימים ER חיובי, גדודים TNBC. FN1 גבוה משמעותית בתוך רקמת הגידול ב סוגי חיובי המשנה HER2 ו אר ומראה מגמת להיות גבוהות באופן משמעותי ברקמת הגידול גם במדגם TNBC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: חקר מקרה: גידול הטרוגניות. גידולים מורפולוגית נפרדות היו microdissected, כאל דוגמאות שונות. (א) הבסיס סריקה של המקטע H & E. (B, C) 10 x ולא 40 x הגדלה, בהתאמה עבור כל מורפולוגיה הגידול מזוהה. Immunohistochemical (ד) צביעת עבור מיון בהגדלה x 10. Immunohistochemical (E) צביעת עבור Ki67 בהגדלה x 10 מראה באמת גוססת גבוה יותר של הגידול 1. (F) מנורמל רמות הביטוי של הגן ESR1 בתוך כל הגידול מציג ביטוי גבוהה יחסית, שווה בין גידולים כצפוי מן התוצאה immunohistochemical. (G) מנורמל רמות הביטוי של FN1, סמן mesenchymal, שבו הביטוי FN1 מוגברת מלווה Ki67 גבוהה מכתים מראה חתימה של גידול פולשני יותר. ההופכי הוא ציין גידול 2, שנראה גידול איטי proliferating עם פוטנציאל ממאיר נמוך המיוצג על-ידי ביטוי FN1 מופחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Assay המבוסס על חרוז bDNA מולטיפלקס אופטימלי לכמת ביטוי גנים ב- RNA מפורק נגזר FFPE רקמת סרטן השד ו צינוריות השד רגיל. מיטוב וזמינותו, מעורבת בפיתוח אלגוריתם לסיווג גידולים של סרטן השד בתת luminal, הבסיס ניצול סמנים ביולוגיים ידועים 8 ו-5 פוטנציאליים נרמול גנים. נירמול בסיס נתונים נעשה באמצעות צירופים של גנים תהליך. הבחירה של גנים תהליך התבססה על התחזית הכי טובה של קולטן מצב באמצעות הגנים המסווג Luminal/Basal. כדי לסווג תת Luminal/Basal רקמות FFPE, הגנים תהליך שנבחרו היו בטא-אקטין (ACTB), גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH), ו- 1 Phosphoribosyltransferase Hypoxanthine (HPRT1).

השיטה ניתן להתאים לשימוש באבחון אחרים ללא שטחי מחקר בעקבות מבחר סביר של קבוצת גנים תהליך. יישום חשוב אחד של שיטה זו בתחום המחקר הוא המדד של סמנים ביולוגיים חומר ארכיוני מסומן היטב עם התוצאות הקליניות. זה יכול לאמת את סמני חזוי פוטנציאל במחקרים רטרוספקטיבית, במהירות ובדייקנות, ולהימנע מחקרים ארוכי טווח פוטנציאליים ממתין הישרדות ללא מחלה, נתוני ההישרדות הכוללת. כיום הקבוצה שלנו היא חוקרת את השימוש וזמינותו לזהות קולטן חיובי exosomes, אשר דורשת התפתחות באמצעות אלגוריתם חדש חלופי נרמול גנים של נרמול נתונים. השימוש ביופסיות נוזלי מבחני ביטוי גנים חזקים מאפשרות תפוקה גבוהה מבחני מולטיפלקס הותאם לניהול המטופל במהלך הטיפול, לספק אמצעי לעקוב אחר יעילות הטיפול, נסיגה פוטנציאליים בשל התנגדות לטיפול, ו גרורות קיבולת של הגידול.

שיטה זו גם יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באבחון של גידולים ומותאם לזרימת העבודה אבחון הנוכחית. היתרונות העיקריים של שיטה זו בתחום האבחון כוללות: (1) יישום מבחני תפוקה גבוהה, (2) למעט הסובייקטיביות ותוצאות דו-משמעית שמקורם מדידות מבוססת תמונה, (3) איתור מדויק של מטרות מרובות בו זמנית, אשר לשפר את הדיוק ואת לצמצם את השימוש יקר סבלני, ודוגמאות (4) אין דרישה עבור מתקני מאוד מיוחדים ומשאבי אנוש. תהליך דגימה ממוטבת, יחד עם קלט נמוך של החומר הנדרש עבור מבוסס-חרוז מולטיפלקס וזמינותו, מאפשר בהמשך החקירה של הגידול הטרוגניות; באמצעות לייזר microdissection להפרדת במדויק מוקדים מרובים של רקמה ממאירה מתוך המקטע החולה באותו, זה אפשרי להשוות בין מספר גנים ביניהם, כמו גם עם תואם הרקמות (איור 4). קלט גשמי נמוך הוא חיוני עבור יישום אבחון הגידול ביופסיות המספקים רקמת הגידול מוגבל. הקיבולת של וזמינותו למדוד ביטוי גנים מדגימות RNA מפורק מאפשר תחבורה נוחה של דגימות לבדיקה בתוך מוסד או מתן שירות מעבדות. בנוסף, ניתוח שכל האזור היה גם אפשרי באמצעות H & E מוכתם בחומר (איור 1).

על ההצלחה של פרוטוקול זה, זה הכרחי כדי: (1) להבטיח דיגום תקין של הגידול האתר/s הם lysed עבור וזמינותו, (2) לפתח טוב ממוטב ואומת אלגוריתמים של נרמול נתונים, עבור כל לוח ביטוי גנים ו/או prognostic בודדים או סמנים ביולוגיים חזוי. לשעבר תלוי ניסיון טכני של המדען/הטכנאי ביצוע הדגימה. מומלץ לקחת את ליבה נוספים ולהכין microarray של רקמות (TMA) בתבנית זהה לתבנית של וזמינותו מולטיפלקס חרוז מגנטי (96-ובכן תבנית). זה יספק ארכיון של גידול אתרים כמו העתק של דגימות המשמשות עבור וזמינותו מבוססי ה-RNA. ניסית אותו בעבר יכול להידרש גם עם טכניקות טיפול נוספות מחקר מעקב או אימות של תוצאות. פיתוח אלגוריתמים נורמליזציה תלויה החומר נחקר ואת הגנים תהליך שנבחר עבור נרמול. פאנלים שונים של נורמליזציה גנים נבחרה בהתבסס על רמת ההשתנות של ביטוי במדגם ניתח, זה משתנה בין סרטן רקמות מארצות שונות, exosomes פלזמה או מחזורי תאים סרטניים. אימות של וזמינותו כולל מדגם עיבוד מאז תכשירים שונים גם תוצאה של אלגוריתמים שונים נורמליזציה.

לסיכום, השימוש בטכנולוגיה bDNA בשילוב עם טכנולוגיה מגנטית חרוז, הבחירה של הלוח נכונה של היעד גנים, יספק יתרון נוסף של ביטוי גנים ישירות בתוך רקמת lysates נגזר כמויות קטנות של מדידה החולה חומר, כולל exosomes גשמי, microdissected, מחזורי תאים סרטניים. בנוסף זיהוי של הגידול הטרוגניות, השימוש של פאנלים יש את היכולת לזהות גידול נגזר exosomes בשלבו המוקדם, גילוי מוקדם של הישנות. מכיוון שאין צורך צעד הגברה חומצת גרעין, הגברה אות באמצעות הטכנולוגיה bDNA, בשילוב עם תירגע מבוסס-חרוז, אמצעי ביטוי גנים מרובים בחומר ארכיוני מבואר קלינית ולספק משאב עבור סמן אימות.

Disclosures

Invitrogen™ QuantiGene™ Plex וזמינותו היא קניינית של התרמו ופישר סיינטיפיק.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי (1) השד סרטן בפרוייקט מלגה (2014-2016) ממומן על-ידי הפעולה עבור קרן סרטן השד ו 2013 חי באמצעות חדשנות ומחקר, פיתוח אמון (RIDT) של אוניברסיטת מלטה, (2) בפקולטה לרפואה & ניתוח, אוניברסיטת מלטה ופרויקטים (3) ACT הממומן על ידי המועצה מלטה למדע ולטכנולוגיה באמצעות היתוך: ה פ אני 2016 תכנית פיתוח טכנולוגיה. הפרסום של כתב יד זה נתמך באמצעות המענק יופיטר-Luminex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica RM2235
Heamatoxylin Mayer's Sigma MHS16-500mL
Eosin Y Aquaeous solution Sigma HT110216-500mL
Normal Rabbit Serum Monosan MONX10963 Working dilution: 1/40
Biotinylated Rabbit anti-mouse Dako E0354 Working dilution: 1/200
ER antibody (6F11) Vector Laboratories VPE614 Working dilution: 1/45
HER2 antibody (CB11) Novocastra CB11-L-CE Working dilution: 1/325
Ki67 antibody (MIB-1) Dako M7240 Working dilution: 1/500
Avidin Biotin Complex kit Vector Laboratories PK-6100
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope Nikon Ti-E 4x, 10x, 20x and 40x objectives
Laser Microdissection membranes Molecular Machines &Industries S0103
mmi CellCamera 1.4 Molecular Machines &Industries MX4285c-ACK07
mmi Cellcut Plus Molecular Machines &Industries
Diffuser caps Molecular Machines &Industries 50210
mmi Celltools Software v.4.01rcl Molecular Machines &Industries
Eppendorf Thermomixer comfort Eppendorf 5355000038
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer Eppendorf 22670522
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer Eppendorf 22670565
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator Labnet 52056A-220
LX200 100/200 Luminex Magnetic bead analyser
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues ThermoFisher Scientific QS0109
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) ThermoFisher Scientific QP1011
Thermaseal RTS Sealing Film Thermaseal 765246
Hand-Held Magnetic Plate Washer ThermoFisher Scientific QP1011
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit Affymetrix/Panomics QS0517
Proteinase K (50µg/µL) ThermoFisher Scientific 14622
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets ThermoFisher Scientific Various
Multi Speed Vortex Kisker Biotech MSV-3500
Sonicator Silvercrest
RNASEZAP Sigma R2020-250ML
Aluminium 96-well plate seal Sigma Z721549-100EA
Temperature Validation Kit ThermoFisher Scientific QS0517
RapidMiner Studio Community 7.1.001 RapidMiner Data Science Platform
Hybridisation oven Hybaid (Thermo Scientific)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
  2. Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
  3. Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
  4. Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
  5. Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
  6. Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
  7. Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
  8. Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
  9. Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
  10. Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
  11. Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
  12. Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
  13. Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  15. Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
  16. Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
  17. Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 138 סמנים ביולוגיים translational רפואה סרטן השד FFPE אבחון מיון סוגי סרטן HER2 קולטן אסטרוגן טריפל שלילית מולטיפלקס מבוסס-חרוז assay xMAP
אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baldacchino, S., Saliba, C., Scerri, … More

Baldacchino, S., Saliba, C., Scerri, J., Scerri, C., Grech, G. Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material. J. Vis. Exp. (138), e57148, doi:10.3791/57148 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter