Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक मल्टीप्लेक्स आरएनए-आधारित अभिव्यक्ति परख का अनुकूलन स्तन कैंसर अभिलेखीय सामग्री का उपयोग

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57148
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1
1Department of Pathology, Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta, 2Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta, 3Department of Physiology & Biochemistry, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta

Summary

अभिलेखीय ऊतक, ट्यूमर विविधता, और ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों की कमी में न्यूक्लिक एसिड क्षरण नकारात्मक रूप से दुनिया भर में विकृति प्रयोगशालाओं में कैंसर नैदानिक सेवाओं को प्रभावित कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के एक मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख का उपयोग कर स्तन कैंसर को वर्गीकृत करने के लिए एक पैनल के अनुकूलन का वर्णन ।

Abstract

अभिलेखीय ऊतक, ट्यूमर विविधता, और ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों की कमी में न्यूक्लिक एसिड क्षरण नकारात्मक रूप से दुनिया भर में विकृति प्रयोगशालाओं में कैंसर नैदानिक सेवाओं को प्रभावित कर सकते हैं । जीन प्रवर्धन और अभिव्यक्ति नैदानिक संग्रह सामग्री या सामग्री है कि सेवा प्रयोगशालाओं के लिए परिवहन की आवश्यकता का उपयोग कर परीक्षण, एक और अधिक मजबूत और सटीक वर्तमान नैदानिक कार्यप्रवाह के लिए अनुकूलित परीक्षण की जरूरत है । हमारे अनुसंधान टीम Invitrogen ™ QuantiGene ™ Plex परख (थर्मामीटरों फिशर वैज्ञानिक) का उपयोग करने के लिए अभिलेखीय सामग्री में आरएनए-डीएनए (bDNA) Luminex xMAP® चुंबकीय मोतियों पर प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए अनुकूलित । इस पांडुलिपि में वर्णित जीन अभिव्यक्ति परख एक उपंयास, जल्दी है, और मल्टीप्लेक्स विधि है कि सही ढंग से विभिंन आणविक उपप्रकारों में स्तन कैंसर वर्गीकृत कर सकते हैं, इमेजिंग तकनीक में निहित व्याख्या के मनोवाद लोप । इसके अलावा, आवश्यक सामग्री के कम इनपुट के कारण, विषम ट्यूमर लेजर microdissected Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों का उपयोग कर सकते हैं । इस विधि नैदानिक क्षमता और तरल बायोप्सी में है, जो बेहतर रोगी प्रबंधन और रोग की निगरानी की अनुमति होगी की माप के साथ ट्यूमर वर्गीकरण सहित संभव आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है । इसके अलावा, अभिलेखीय सामग्री में अंकन के मात्रात्मक माप नैदानिक व्याख्या सामग्री के पुस्तकालयों के लिए उपयोग के साथ ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में उपयोगी है, जिसमें पूर्वव्यापी अध्ययन संभावित मार्कर्स और उनके नैदानिक परिणाम को मान्य कर सकते हैं सहसंबंध.

Introduction

आरएनए आधारित परख का अनुकूलन formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) सामग्री का उपयोग शल्य ऊतक प्रसंस्करण और आरएनए के क्षरण में परिवर्तनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण ऊतक अखंडता के संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया formalin की वजह से है1, 2. अभिलेखीय सामग्री से सटीक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन प्रदर्शन की सीमा को दूर करने के लिए, हमारे समूह bDNA मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख का इस्तेमाल किया । एक लक्ष्य टेंपलेट के एंजाइमी प्रवर्धन के बजाय, bDNA प्रौद्योगिकी विशिष्ट जांच और एक रिपोर्टर संकेत3के प्रवर्धन के संकरण का उपयोग करता है । कैप्चर और डिटेक्शन जांच के छोटे पहचान अनुक्रम लक्ष्य आरएनए4के छोटे टुकड़े करने के लिए संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं । इसके अलावा, इस परख में प्रत्यक्ष शुरू सामग्री के रूप में ऊतक homogenates का उपयोग करते हैं, आरएनए के अपरिहार्य नुकसान पर काबू पाती है कि पूर्व आरएनए निष्कर्षण और शुद्धि की आवश्यकता परख से परिणाम. संकेत प्रवर्धन, कम मांयता दृश्यों का उपयोग करें, और एक शुद्धि चरण के बहिष्कार, परख के तकनीकी बदलाव में कमी करने के लिए योगदान । प्रौद्योगिकी मल्टीप्लेक्स को परख (८० आरएनए लक्ष्य तक) और कम सामग्री इनपुट से लक्ष्य के एक पैनल की अभिव्यक्ति को मापने की संभावना प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल की तैयारी और लेजर microdissection के लिए ऊतक के नमूनों के दाग का वर्णन । झिल्ली स्लाइड पर धुंधला ट्यूमर और ऊतकवैज्ञानिक वास्तुकला के सही चयन और रूपरेखा प्रदान करने के लिए इमेजिंग की सुविधा: (1) ट्यूमर और स्तन ऊतक में सामान्य नलिकाओं, और (2) विषम ट्यूमर के भीतर घातक सेल क्लोनों.

स्तन कैंसर के आणविक वर्गीकरण एक प्रक्रिया है कि पूछताछ आणविक मार्करों तीन आणविक वर्गों में रोगी ट्यूमर को वर्गीकृत करने के लिए, यानी, चमकदार, मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2)-समृद्ध, और बेसल उपप्रकार. HER2-समृद्ध उपप्रकार अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, HER2 रिसेप्टर की उच्च अभिव्यक्ति के साथ, ERBB2 जीन प्रवर्धन के कारण, कम या अनुपस्थित एस्ट्रोजन रिसेप्टर (एर) और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीजीआर) के साथ संयुक्त. चमकदार उपप्रकार आम तौर पर एर के लिए सकारात्मक है और बेसल उपप्रकार तीन रिसेप्टर्स (HER2, एर, पीजीआर) के लिए सामान्य नकारात्मक में हैं, और काफी ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC) नैदानिक उपप्रकार5,6के साथ ओवरलैप. अंय मार्करों उपकला और mesenchymal विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है । Fibronectin (FN1) स्तन ऊतक mesenchymal डिब्बे का एक मुख्य घटक है । वृद्धि हुई FN1 अभिव्यक्ति उच्च Ki67 धुंधला के साथ है, और एक और अधिक इनवेसिव ट्यूमर के लिए एक हस्ताक्षर से पता चलता है7,8 और मेटास्टेसिस9के साथ जुड़ा हुआ है । दिलचस्प है, FN1 को ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पंन microvesicles में उपस्थित होना पाया गया था, कि प्राप्तकर्ता fibroblasts10में mitogenic संकेतों के सक्रियण प्रेरित । इसलिए, ऐसे exosomes के रूप में परिसंचारी microvesicles जल्दी पता लगाने या मेटास्टेसिस और11पलटा के संभावित मार्कर हैं ।

स्तन कैंसर के लिए ट्यूमर क्षेत्र चयन transcriptional उपलेखन macrodissection12,13द्वारा किया गया है आवर्तक रूप । ऊतक विविधता पर काबू पाने और संवेदनशीलता में वृद्धि करने के लिए, हम मज़बूती से मल्टीप्लेक्स आणविक रूपरेखा तरीकों के साथ शास्त्रीय ऊतक दाग संयुक्त है । सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, दो अलग स्तन कैंसर क्लोन उनके उपकला mesenchymal हस्ताक्षर और मेटास्टेटिक क्षमता द्वारा परिभाषित किया गया है । वर्णित प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को आसानी से वर्तमान नैदानिक सेटअप करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है और चुनिंदा अलग और लक्षित mRNA रूपरेखा का उपयोग ऊतक उपप्रकार की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया ।

Protocol

इस अध्ययन में स्तन ऊतक सामग्री के उपयोग के लिए नैतिक अनुमोदन (Ref: 22/2012) माल्टा विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय अनुसंधान नैतिकता समिति (UREC) से प्राप्त किया गया था ।

1. टिशू वडा

  1. उपयुक्त H & E कार्यविधियों14का उपयोग करते हुए, दाग संदर्भ ऊतक अनुभागों को तैयार और microdissection के दौरान संदर्भ के लिए स्लाइड डिजिटल रूप से स्कैन करें ।
  2. एक microtome का प्रयोग, ४० डिग्री सेल्सियस पर एक RNAse मुक्त पानी स्नान पर 20 µm ऊतकों वर्गों में कटौती । स्वच्छ, RNase-दूषित उपकरणों और सामग्रियों का उपयोग कर लेजर microdissection के लिए झिल्ली स्लाइड पर वर्गों लीजिए ।
  3. एक सुखाने मशीन में ३७ ° c पर झिल्ली स्लाइड रातोंरात सूखी । उपयुक्त एच और ई आणविक जीवविज्ञान ग्रेड समाधान के साथ15 प्रक्रिया का उपयोग दाग और 6 मिनट के लिए Hematoxylin का धुंधला समय बढ़ रही है । यदि आवश्यक हो, तो उपयुक्त immunohistochemical प्रोटोकॉल16के साथ झिल्ली स्लाइड दाग ।

2. लेजर Microdissection

  1. स्लाइड सीमाएं सेट करें और चरण आंदोलन को जांचें ।
    1. लेज़र दृश्य किसी झिल्ली स्लाइड के किसी रिक्त क्षेत्र पर ले जाएँ । लेजर ध्यान एक लेजर शॉट बढ़ती फोकस अंतराल (5% पर फायरिंग द्वारा जांचना जब तक लेज़र झिल्ली के माध्यम से पियर्स शुरू होता है । ड्रा करें और किसी भी आकार microdissect लेजर विच्छेदन के दौरान लेजर क्षमता को अधिकतम करने के लिए लेजर ध्यान finetune ।
    2. जहां लेजर विच्छेदन दक्षता समझौता नहीं है एक बिंदु पर मंच आंदोलन की गति बढ़ाएं । चयनित उद्देश्य लेंस में लेजर जांचना और फिर से जांचना अगर उद्देश्य (लेजर गति पर 1-15%, पर ध्यान केंद्रित 70-75%, और बिजली पर 90-100% जब 4x उद्देश्य का उपयोग) ।
  2. 4x उद्देश्य का उपयोग कर दाग झिल्ली स्लाइड स्कैन ।
  3. झिल्ली स्लाइड पर microdissection के लिए लक्षित क्षेत्रों का चयन करें और घेरना । लेजर ४२ मिमी2का एक ंयूनतम क्षेत्र काटना । रिकॉर्ड उपयोग किए जाने वाले नमूना अनुमन्य बफ़र की मात्रा निर्धारित करने के लिए विदारक क्षेत्र ।
  4. कैप लिफ्ट तंत्र का प्रयोग करें लेबल के लिए उपयुक्त संलग्न ट्यूबों के विसारक टोपियां पर विच्छेदित अनुभाग पुनः प्राप्त । यदि विच्छेदित खंड टोपी पर प्राप्त नहीं है, क्षेत्र के लेजर विच्छेदन दोहराने ।

3. टिशू Lysis

नोट: कई समाधान और सामग्री सामग्री की तालिकामें वर्णित किट के साथ आपूर्ति की जाती है ।

  1. 60:1 अनुपात में अनुमन्य समाधान एवं proteinase K का उपयोग करते हुए नमूना lysis हेतु आवश्यक अनुमन्य मिश्रण मात्रा तैयार करें ।
  2. पिपेट २.४ के प्रत्येक ट्यूब में अनुमन्य समाधान के µ l ऊतक क्षेत्र के प्रत्येक 1 मिमी2 , अधिकतम गति पर 10 एस के लिए भंवर, और कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए २,५०० x g पर केंद्रापसारक
  3. 12 के लिए ६५ ° c में एक हीटिंग ब्लॉक में मशीन-६०० rpm पर मिलाते के साथ 18 एच ।
  4. केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २१,००० x जी में lysates ।
  5. एक पिपेट का प्रयोग, ध्यान से स्पष्ट supernatant महाप्राण और एक लेबल ताजा ट्यूब में बांटना । ऊतक/झिल्ली टुकड़े aspirating से बचने के रूप में यह परिणाम की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं ।
  6. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्पष्ट supernatant स्टोर ।

4. संकरण आधारित परख

  1. निंन तैयारियां करते हैं ।
    1. पूर्व 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एजेंट की बोतल रखकर lysis मिश्रण गर्म और धीरे से उलटा करके मिश्रण ।
    2. यदि ऊतक homogenates जमे हुए, कमरे के तापमान पर गल रहे है और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी में गर्मी के बाद अधिकतम गति से नमूनों की ।
    3. ५४ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए मशीन सेट और एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट की एक खाली कुआं में तापमान सत्यापन किट की जांच जगह है । 2 एच के बाद डिजिटल थर्मामीटर पर तापमान की जांच करें और किसी भी तापमान अंतर के लिए सही करने के लिए मिलाते हुए मशीन के डेल्टा तापमान निर्धारित किया है ।
    4. गल और भंवर जांच सेट और 10 एस के लिए एजेंट को अवरुद्ध, 5 एस के लिए कमरे के तापमान पर २,५०० x जी में केंद्रापसारक, और बर्फ पर रखो ।
    5. उपयोग के दौरान बर्फ पर Proteinase K शीशी रखें ।
    6. 3 मिनट के लिए ४६ KHz पर कब्जा मोतियों Sonicate, तो एक और 3 मिनट के लिए अधिकतम गति से भंवर.
  2. तदनुसार निंनलिखित एजेंट को स्केलिंग द्वारा प्रति अच्छी तरह से एक 25 µ एल काम मनका मिश्रण तैयार: ४.२५ µ l के Nuclease-मुक्त जल, १६.६५ µ l के lysis मिश्रण, १.०० µ के l को ब्लॉकिंग रिएजेंट, ०.१० µ l के Proteinase K, ०.५० µ l की कैद मोतियों की, २.५० µ l की जांच सेट.
  3. भंवर काम मनका मिश्रण अधिकतम गति पर 10 एस के लिए, तो पिपेट 25 µ एल/अच्छी तरह से चुंबकीय जुदाई थाली में ।
  4. पिपेट 25 µ l टिशू homogenate एक चुंबकीय पृथक्करण के लिए ९६-well थाली और 25 µ l रिक्तियां के रूप में 3 कुओं के समाधान अनुमन्य ।
  5. चुंबकीय जुदाई प्लेट एक स्पष्ट प्लास्टिक दबाव सील का उपयोग कर सील और ५४ ± 1 डिग्री सेल्सियस पर मशीन में प्लेट जगह 18 के लिए-22 एच जबकि ६०० rpm पर मिलाते हुए ।
  6. 24 कुओं के लिए एक 1x धोने बफर समाधान तैयार RNase के ३१.५ मिलीलीटर-मुक्त पानी के साथ धो बफर घटक 1 और १.६७ एमएल के धो बफर घटक 2 के ०.१ मिलीलीटर के साथ मिश्रण ।
  7. मशीन से थाली निकालें । ५० ± 1 डिग्री सेल्सियस के लिए मिलाते हुए मशीन के तापमान सेट करें ।
  8. हाथ से आयोजित चुंबकीय प्लेट वॉशर और जगह में ताला पर चुंबकीय जुदाई थाली माउंट । दबाव सील निकालें और व्यवस्थित करने के लिए चुंबकीय मोतियों के लिए 1 मिनट रुको ।
  9. धुलाई कदम: चुंबकीय जुदाई प्लेट पलटना सिंक पर प्लेट पर घुड़सवार और एक ऊतक कागज पर धीरे दाग अवशिष्ट समाधान को दूर करने के लिए । का उपयोग कर एक मल्टीचैनल पिपेट एक अच्छी तरह से में 1x धो बफर समाधान के १०० µ एल जोड़ें और इंतजार 15 एस । प्लेट धोने के लिए 3 बार इस स्टेप को दोहराएं ।
  10. पिपेट ५० µ एल के पूर्व एम्पलीफायर रिएजेंट प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए । एक एल्यूमीनियम प्लेट सील के साथ प्लेट सील और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ८०० rpm पर प्लेट हिला । ५० ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन जबकि ६०० rpm पर मिलाते हुए ।
  11. दोहराएँ चरण ४.९ (धुलाई चरण).
  12. पिपेट ५० µ एल एम्पलीफायर एजेंट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए. एक एल्यूमीनियम प्लेट सील के साथ प्लेट सील और ४.१० कदम में के रूप में प्लेट हिला ।
  13. दोहराएँ चरण ४.९ (धुलाई चरण).
  14. भंवर अधिकतम गति पर 10 एस के लिए लेबल जांच । प्रत्येक अच्छी तरह से लेबल जांच के ५० µ एल जोड़ें । सील और प्लेट शेक (४.१० कदम) ।
  15. दोहराएँ चरण ४.९ (धुलाई चरण).
  16. भंवर Streptavidin phycoerythrin (SAPE) अधिकतम गति पर 10 एस के लिए । SAPE के ५० µ l को हर कुआं पर जोड़ें । सील और प्लेट शेक (४.१० कदम) ।
  17. दोहराएँ चरण ४.९ (धुलाई चरण) को छोड़कर SAPE वॉश बफ़र के बजाय वाश बफ़र समाधान का उपयोग करें ।
  18. एक एल्यूमीनियम प्लेट सील के साथ एक अच्छी तरह से और सील प्लेट के लिए SAPE धोने बफर के १३० µ एल जोड़ें । 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ८०० rpm पर थाली शेक ।
  19. स्टार्ट-अप चुंबकीय मनका विश्लेषक । निर्माता के निर्देशों का पालन करके अंशांकन और सत्यापन दिनचर्या करते हैं ।
  20. निंनलिखित मापदंडों का उपयोग चुंबकीय मनका विश्लेषक पर एक प्रोटोकॉल सेट करें: नमूना आकार: १०० µ l; डीडी गेट: 5000 – 25000; समयबाह्य: ९० s; मनका घटना/क्षेत्र: १००; और अगला क्लिक करें । पैनल में संबंधित मनका संख्या का चयन करें और निर्माता द्वारा संकेत के रूप में संबंधित लक्ष्य जीन के साथ मनका क्षेत्रों को परिभाषित ।
  21. बैचेस टैब से "मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग कर बैच बनाएँ" काचयन करके एक नया विश्लेषण जोड़ें । प्लेट लेआउट में कुओं को अज्ञात या रिक्तके रूप में नामित, क्रमशः और नमूने पैनल में प्रत्येक नमूने के लिए एक लेबल प्रदान करते हैं ।
  22. ९६-well reaction प्लेट से एल्यूमीनियम प्लेट सील निकालें । प्लेट ट्रे बाहर निकालें बटन पर क्लिक करके , चुंबकीय मनका विश्लेषक में प्लेट लोड । वापस लेनाक्लिक करें | विश्लेषक प्रारंभ करने के लिए बैच चलाएँ । पढ़ने के बाद, बाहर निकालें और ९६-well थाली हटा दें । स्वच्छ और निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में चुंबकीय मनका विश्लेषक नीचे बंद ।

5. डेटा विश्लेषण

  1. बैचमें । परिणाम टैब, संबंधित विश्लेषण फ़ाइल का चयन करें और . csv में निर्यात करें बटन क्लिक करते हैं । स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके. csv फ़ाइल खोलें ।
  2. मनका गिनती पर गौर करें और < ४० मोतियों/क्षेत्र के साथ किसी भी परिणाम को छोड़ दें ।
  3. बाहर औसत खाली कुओं के मूल्यों और मानक विचलन (एसडी) और पता लगाने की सीमा (लोद) (खाली औसत + (3xSD)) लक्ष्य जीन प्रति काम करते हैं । मान लोद के रूप में नहीं पाई गई से कम सेट करें ।
    नोट: यदि कोई भी सामान्य अभिव्यक्ति मान नहीं पाए जाते हैं, तो नमूना डेटा अपर्याप्त के रूप में संबंध है । ऊपरी संवेदनशीलता सीमा से अधिक के रूप में २०,००० से अधिक अभिव्यक्ति मूल्यों पर विचार करें । इन नमूनों के lysates का पतला होना और पुन: विश्लेषण करना चाहिए ।
  4. प्रति जीन कच्चे डेटा से खाली औसत घटाना.
  5. नमूने के अनुसार चयनित सामान्य जीन की ज्यामितीय माध्य गणना. संबंधित ज्यामितीय माध्य करने के लिए व्यक्तिगत नमूना डेटा को सामान्य करें ।
  6. डेटा विज्ञान प्लेटफार्मों पर डेटा का विश्लेषण या परिभाषित एल्गोरिदम का उपयोग कर ।
    1. डेटा जोड़ेंक्लिक करके डेटा को डेटा विज्ञान प्लेटफ़ॉर्म में आयात करें । डेटा फ़ाइल को प्रक्रिया कार्यस्थान में खींचें और एक [विशेषताओं का चयन करें] ऑपरेटर, फिर एक मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) ऑपरेटर, और फिर रेसुलt पोर्ट से कनेक्ट करें ।
    2. में चुनें विशेषता ऑपरेटर सामान्यीकृत जीन डेटा के सबसेट और स्तन कैंसर उपप्रकार के रूप में एक नाममात्र चर का चयन करें । चलाएं क्लिक करके प्रक्रिया चलाएँ । चार्ट्स टैब में, चार्ट शैली में "स्कैटर 3d रंग" और रंग फ़ील्ड में नाममात्र चर का चयन करें. एक 3-आयामी भूखंड पर पीसीए डेटा परिवर्तनशीलता का आकलन करें ।

Representative Results

वर्णित विधि एच एंड ई में ४० टेप के एक साथ माप के लिए आवेदन किया गया है सना हुआ (चित्रा 1), microdissected (चित्रा 2) अत्यधिक नीचा FFPE सामग्री । इस विधि का उपयोग करना, हम रिसेप्टर स्थिति (3ए), चमकदार और बेसल आणविक उपप्रकार17में ट्यूमर का वर्गीकरण, और mesenchymal मार्कर, FN1, जब ट्यूमर की तुलना के अंतर अभिव्यक्ति का सही लक्षण वर्णन दिखा और मिलान नियंत्रण ऊतक (चित्र बी), विभिन्न रिसेप्टर सकारात्मक और नकारात्मक उपप्रकार में.

Figure 1
चित्रा 1: जीन एच एंड ई सना हुआ सामग्री का उपयोग कर अभिव्यक्ति । एक दाग ट्यूमर अनुभाग की तुलना में एक दाग ट्यूमर अनुभाग से व्युत्पंन एक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के बीच सहसंबंध । [पियरसन सहसंबंध p-value = 5.34 e-26]. 17अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: FFPE ऊतकों के लेजर microdissection । (क) H र E सना slide; (ख) ईर की अभिव्यक्ति के लिए Immunohistochemical दाग; (ग) HER2 immunohistochemical दाग; (घ) लेजर microdissection झिल्ली स्लाइड पर दाग 20 µm अनुभाग । पीले तीर आक्रामक ट्यूमर के एक क्षेत्र है कि स्पष्ट रूप से धुंधला की कमी के कारण demarcated नहीं है इंगित करता है । (ङ) ब्याज के क्षेत्रों के बेहतर विच्छेदन के लिए एच एंड ई के साथ एक 20 µm अनुभाग दाग । लाल तीर विच्छेदन के दौरान लेजर ध्यान से पता चलता है, जबकि सफेद तीर लेजर विच्छेदन ट्रेल संकेत मिलता है । सभी चित्र 10x आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: की अभिव्यक्ति (क) रिसेप्टर स्थिति और (ख) mesenchymal मार्कर FN1, स्तन ट्यूमर में सामान्य मिलान की तुलना में. शास्त्रीय नैदानिक स्तन कैंसर उपप्रकार नैदानिक परिणाम के अनुसार immunohistochemistry और प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली) का उपयोग HER2 गोलमोल immunohistochemical धुंधला के लिए परिभाषित कर रहे हैं । की सामान्यीकृत अभिव्यक्ति (क) HER2 और एर, (ख) FN1 संकरण आधारित परख द्वारा मापा HER2 सकारात्मक, एर सकारात्मक, और TNBC मामलों में रोगी की तुलना में सचित्र है सामांय स्तन ऊतक मिलान । Kruskal वालिस परीक्षण सांख्यिकीय (K-W χ2) दिखाता है कि HER2 की अभिव्यक्ति उल्लेखनीयतया है (p < ०.०५) ट्यूमर ऊतक में उच्च HER2 सकारात्मक पलटन में मिलान सामांय ऊतक के खिलाफ और TNBC पलटन में काफी कम है । ईआर अभिव्यक्ति में ट्यूमर के ऊतकों में काफी अधिक नहीं पाया गया था के रूप में ईआर सकारात्मक और TNBC साथियों में मिलान सामांय का विरोध किया । FN1 HER2 और एर सकारात्मक उपप्रकार में ट्यूमर ऊतक में काफी अधिक है और TNBC पलटन में भी ट्यूमर के ऊतकों में काफी ऊंचा होने की दिशा में एक प्रवृत्ति से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: केस स्टडी: ट्यूमर विविधता. आकृति विज्ञान विशिष्ट ट्यूमर microdissected और अलग नमूनों के रूप में इलाज किया गया । (क) एच एंड ई सेक्शन का मास्टर स्कैन. (ख, ग) एक 10x और 40x इज़ाफ़ा, प्रत्येक ट्यूमर की पहचान के लिए क्रमशः । (घ) 10x आवर्धन पर एर के लिए धुंधला Immunohistochemical । (ङ) Immunohistochemical 1 ट्यूमर में एक उच्च mitotic गतिविधि दिखा 10x आवर्धन पर Ki67 के लिए धुंधला । (च) immunohistochemical परिणाम से उम्मीद के रूप में ट्यूमर के बीच अपेक्षाकृत उच्च और समान अभिव्यक्ति दिखा ट्यूमर में ESR1 जीन के लिए सामान्यीकृत अभिव्यक्ति स्तर. (छ) FN1, एक mesenchymal मार्कर, जहां वृद्धि हुई FN1 अभिव्यक्ति उच्च Ki67 एक अधिक इनवेसिव ट्यूमर के लिए एक हस्ताक्षर दिखा दाग के साथ है की सामान्यीकृत अभिव्यक्ति स्तर । व्युत्क्रम ट्यूमर 2 में मनाया जाता है, जो एक कम घातक क्षमता कम FN1 अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिनिधित्व के साथ एक धीमी proliferating ट्यूमर प्रतीत होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्स bDNA परख को नीचा दिखाया FFPE स्तन कैंसर के ऊतकों और सामांय स्तन नलिकाओं से व्युत्पंन आरएनए पर जीन अभिव्यक्ति मात्रा को अनुकूलित किया गया । परख अनुकूलन, शामिल एक एल्गोरिथ्म विकसित करने के लिए चमकदार और बेसल उपप्रकार में स्तन कैंसर के ट्यूमर वर्गीकृत 8 अच्छी तरह से ज्ञात मार्क्स और 5 संभावित जीन सामांय उपयोग । डेटा सामांयीकरण सामान्य जीन का परिवर्तन का उपयोग किया गया था. सामांय जीन का चयन रिसेप्टर स्थिति की सबसे अच्छी भविष्यवाणी के आधार पर किया गया था चमकदार/बेसल वर्गीकारक जीन का उपयोग कर । FFPE ऊतकों से चमकीले/बेसल उपप्रकार वर्गीकृत करने के लिए, सामान्य जीन का चयन किया गया बीटा-actin (ACTB), Glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH), और Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

विधि सामांय जीन सेट के पर्याप्त चयन के बाद अंय नैदानिक और अनुसंधान क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अनुसंधान के क्षेत्र में इस पद्धति के एक महत्वपूर्ण आवेदन है कि अच्छी तरह से नैदानिक परिणामों के साथ व्याख्या है अभिलेखीय सामग्री में है । यह पूर्वव्यापी अध्ययन में संभावित पूर्वानुमान मार्करों को मान्य कर सकता है, जल्दी और सही, और रोग मुक्त जीवन रक्षा और समग्र जीवन रक्षा डेटा का इंतजार दीर्घकालिक भावी अध्ययनों से बचें । वर्तमान में हमारे समूह परख के उपयोग की जांच कर रहा है रिसेप्टर पॉजिटिव exosomes, जो एक नए डेटा सामान्यीकरण के लिए वैकल्पिक सामान्य जीन का उपयोग कर एल्गोरिथ्म के विकास की आवश्यकता का पता लगाने के लिए. तरल बायोप्सी और मजबूत जीन अभिव्यक्ति परख का उपयोग उच्च प्रवाह मल्टीप्लेक्स परख उपचार के दौरान रोगी प्रबंधन के लिए अनुकूलित की अनुमति देगा, और एक उपचार प्रभावकारिता का पालन करें, संभावित पतन चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के कारण प्रदान करते हैं, और ट्यूमर की मेटास्टेटिक क्षमता ।

इस विधि भी ट्यूमर के निदान में संभव आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है और वर्तमान नैदानिक कार्यप्रवाह के लिए अनुकूलित है । नैदानिक क्षेत्र में इस विधि के मुख्य लाभ में शामिल हैं: (1) उच्च प्रवाह परख के कार्यांवयन, (2) मनोवाद और गोलमोल छवि से उत्पंन परिणामों को छोड़कर-माप आधारित है, (3) कई लक्ष्यों का सही पता लगाने इसके साथ ही, जो सटीकता बढ़ाने और कीमती मरीज के नमूनों के उपयोग को कम करने, और (4) अत्यधिक विशिष्ट सुविधाओं और मानव संसाधनों के लिए कोई आवश्यकता नहीं है । अनुकूलित नमूना प्रक्रिया, एक साथ मनका के लिए आवश्यक सामग्री के कम इनपुट के साथ-मल्टीप्लेक्स परख आधारित, ट्यूमर विविधता की आगे की जांच की अनुमति देता है; लेजर microdissection का उपयोग करके सही एक ही रोगी अनुभाग से घातक ऊतक के कई घावों को अलग करने के लिए, यह उन दोनों के बीच के रूप में अच्छी तरह से मिलान सामान्य ऊतक (चित्रा 4) के साथ के बीच कई जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए संभव है. कम सामग्री इनपुट ट्यूमर बायोप्सी पर नैदानिक आवेदन है कि सीमित ट्यूमर ऊतक प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । अपमानित आरएनए नमूनों से जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए परख की क्षमता एक संस्था के भीतर विश्लेषण के लिए नमूनों की आसान परिवहन या प्रयोगशालाओं को चलाने की अनुमति देता है । इसके अलावा, पूरे अनुभाग विश्लेषण भी संभव एच एंड ई सना हुआ सामग्री का उपयोग कर रहा था (1 चित्रा) ।

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए, यह करने के लिए आवश्यक है: (1) ट्यूमर साइट का उचित नमूना सुनिश्चित/एस कि परख के लिए लीजड ड है और (2) अच्छी तरह से अनुकूलित और सत्यापित डेटा सामांयीकरण एल्गोरिदम विकसित, प्रत्येक जीन अभिव्यक्ति पैनल के लिए और/ या भविष्यवाणी की है कि मार्क्स । पूर्व तकनीशियन के तकनीकी अनुभव पर निर्भर करता है और नमूना प्रदर्शन वैज्ञानिक । यह एक अतिरिक्त कोर लेने के लिए और मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख (९६ अच्छी तरह से प्रारूप) के एक ही प्रारूप में एक ऊतक microarray (TMA) तैयार करने की सिफारिश की है । यह आरएनए-आधारित परख के लिए इस्तेमाल नमूनों की एक प्रतिकृति के रूप में ट्यूमर साइटों की एक संग्रह प्रदान करेगा । TMAs भी अनुवर्ती अनुसंधान या परिणामों के सत्यापन के लिए अंय तकनीकों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । सामांय एल्गोरिदम के विकास की जांच की जा रही सामग्री पर निर्भर है और सामान्य जीन सामान्य के लिए चयनित. सामान्य जीन के विभिन्न पैनलों के स्तर और नमूना विश्लेषण में अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता के आधार पर चयनित कर रहे हैं और यह विभिन्न मूल से कैंसर के ऊतकों के बीच बदलता है, प्लाज्मा से exosomes, या ट्यूमर कोशिकाओं घूम. परख के सत्यापन के बाद से विभिंन तैयारी भी विभिंन सामांय एल्गोरिदम में परिणाम होगा नमूना प्रसंस्करण शामिल हैं ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी और लक्ष्य जीन के उचित पैनल के चयन के साथ संयोजन में bDNA प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए, सीधे ऊतक lysates की छोटी मात्रा से व्युत्पंन में जीन अभिव्यक्ति को मापने का जोड़ा लाभ प्रदान करेगा रोगी सामग्री, microdissected सामग्री सहित, exosomes, और परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं. ट्यूमर विविधता का पता लगाने के अलावा, पैनलों के समुचित उपयोग जल्दी निदान और पलटा के जल्दी पता लगाने के लिए ट्यूमर व्युत्पंन exosomes का पता लगाने की क्षमता है । के बाद से वहां एक न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन कदम के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, संकेत प्रवर्धन bDNA प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, मनका आधारित मल्टीप्लेक्स के साथ संयुक्त, नैदानिक व्याख्या अभिलेखीय सामग्री में कई जीन अभिव्यक्ति के उपाय और के लिए एक संसाधन प्रदान की पुष्टि ।

Disclosures

Invitrogen ™ QuantiGene ™ Plex परख थर्मामीटरों फिशर वैज्ञानिक के स्वामित्व है ।

Acknowledgments

काम के द्वारा समर्थित किया गया था (1) एक स्तन कैंसर परियोजना छात्रवृत्ति (2014-2016) स्तन कैंसर फाउंडेशन और जिंदा २०१३ के लिए कार्रवाई द्वारा वित्त पोषित अनुसंधान, नवाचार और विकास ट्रस्ट (RIDT) के माध्यम से माल्टा विश्वविद्यालय के, (2) चिकित्सा के संकाय और सर्जरी, माल्टा विश्वविद्यालय और (3) परियोजना के माध्यम से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए माल्टा परिषद द्वारा वित्तपोषित अधिनियम फ्यूजन: आर एंड आई प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम २०१६ । इस पांडुलिपि के प्रकाशन को जौव-Luminex अनुदान के माध्यम से समर्थन प्राप्त है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica RM2235
Heamatoxylin Mayer's Sigma MHS16-500mL
Eosin Y Aquaeous solution Sigma HT110216-500mL
Normal Rabbit Serum Monosan MONX10963 Working dilution: 1/40
Biotinylated Rabbit anti-mouse Dako E0354 Working dilution: 1/200
ER antibody (6F11) Vector Laboratories VPE614 Working dilution: 1/45
HER2 antibody (CB11) Novocastra CB11-L-CE Working dilution: 1/325
Ki67 antibody (MIB-1) Dako M7240 Working dilution: 1/500
Avidin Biotin Complex kit Vector Laboratories PK-6100
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope Nikon Ti-E 4x, 10x, 20x and 40x objectives
Laser Microdissection membranes Molecular Machines &Industries S0103
mmi CellCamera 1.4 Molecular Machines &Industries MX4285c-ACK07
mmi Cellcut Plus Molecular Machines &Industries
Diffuser caps Molecular Machines &Industries 50210
mmi Celltools Software v.4.01rcl Molecular Machines &Industries
Eppendorf Thermomixer comfort Eppendorf 5355000038
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer Eppendorf 22670522
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer Eppendorf 22670565
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator Labnet 52056A-220
LX200 100/200 Luminex Magnetic bead analyser
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues ThermoFisher Scientific QS0109
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) ThermoFisher Scientific QP1011
Thermaseal RTS Sealing Film Thermaseal 765246
Hand-Held Magnetic Plate Washer ThermoFisher Scientific QP1011
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit Affymetrix/Panomics QS0517
Proteinase K (50µg/µL) ThermoFisher Scientific 14622
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets ThermoFisher Scientific Various
Multi Speed Vortex Kisker Biotech MSV-3500
Sonicator Silvercrest
RNASEZAP Sigma R2020-250ML
Aluminium 96-well plate seal Sigma Z721549-100EA
Temperature Validation Kit ThermoFisher Scientific QS0517
RapidMiner Studio Community 7.1.001 RapidMiner Data Science Platform
Hybridisation oven Hybaid (Thermo Scientific)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
  2. Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
  3. Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
  4. Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
  5. Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
  6. Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
  7. Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
  8. Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
  9. Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
  10. Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
  11. Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
  12. Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
  13. Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  15. Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
  16. Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
  17. Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).

Tags

-अभियांत्रिकी अंक १३८ मार्क्स शोधों की चिकित्सा स्तन कैंसर FFPE निदान वर्गीकरण कैंसर उपप्रकार HER2 एस्ट्रोजन रिसेप्टर ट्रिपल निगेटिव मल्टीप्लेक्स मनका-परख आधारित xMAP
एक मल्टीप्लेक्स आरएनए-आधारित अभिव्यक्ति परख का अनुकूलन स्तन कैंसर अभिलेखीय सामग्री का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baldacchino, S., Saliba, C., Scerri, … More

Baldacchino, S., Saliba, C., Scerri, J., Scerri, C., Grech, G. Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material. J. Vis. Exp. (138), e57148, doi:10.3791/57148 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter