Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

Abstract

מיקרוסקופיה קונפוקלית מספק מתודולוגיה נגיש כדי ללכוד אינטראקציות סלולרי תת קריטי אפיון ופיתוח נוסף של ניסויים פרה-קליניים סוכנים המסומנת הגששים פלורסנט. עם הפיתוחים האחרונים בתחום תרופות ציטוטוקסיות נוגדן מבוסס מערכות אספקה, הבנה התיקונים. הנגרמת על ידי סוכנים אלה בגדר של צבירת קולטן, הפנמה יש חשיבות קריטית. פרוטוקול זה ממנף את המתודולוגיה ומבוססת של immunocytochemistry פלורסנט והפצה קוד פתוח פיג'י של ImageJ, עם autocorrelation מובנה, פונקציות מתמטיות תמונה, כדי לבצע קורלציה מרחבית תמונה ספקטרוסקופיה (ICS). פרוטוקול זה quantitates את עוצמת פלורסנט של קולטני שכותרתו כפונקציה של אזור קרן של מיקרוסקופ קונפוקלי. זה מספק מדד כמותי של מצב צבירה מולקולת המטרה על פני התא. מתודולוגיה זו מתמקדת האפיון של תאים סטטי עם פוטנציאל להתרחב חקירות הטמפורלי של קולטן מצבור. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה נגיש לספק כימות של קיבוץ באשכולות אירועים המתרחשים על פני התא, ניצול טוב הוקמה ללא-התמחות מכשיר הדמיה וטכניקות.

Introduction

התפתחות נוגדנים טיפולית הראו הצלחה בטיפול של הגידול במספר סוגים1. הפיתוחים האחרונים של נוגדן תרופתיים conjugates (ADC) כמו מנגנוני מסירה עבור תרכובות ציטוטוקסיות הרחיבה את הדרישות להבנת הדינמיקה של אינטראקציות נוגדן: קולטן בתא פני השטח2. בעקבות מיקוד מוצלחת של נוגדנים לקולטן פני שטח התא, קומפלקסים אלה יכול לגרום דפוסים צבירת דומים לאלה הנהוגות ליגנד: נוגדן אינטראקציות3. שינויים קולטן צבירת יכול לגרום שינויים ממברנה תוצאה ההפנמה של הקולטן והסרה שלו מפני השטח של התא. בהקשר של המספר המשלים נוגדן-סמים, תהליך זה לאחר מכן משחרר את המטען ציטוטוקסיות לתוך endosomes למביטה ובעקבות כך הציטופלסמה, וכתוצאה מכך היעילה תא ההרג.

מיקרוסקופיה קונפוקלית סיפק אמצעי יעיל להמחיש אינטראקציות חשובות אלה של נוגדנים, קולטנים שלהם יעד4. כדי לחקור את השינויים של צבירה של מולקולת המטרה על פני התא פרוטוקול זה מנצל לאחר העיבוד של מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות באמצעות תמונות מרחבי המתאם ספקטרוסקופיה (ICS) טכניקה 5,6,7 .

הקרן של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה היא התצפית כי תנודות עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרחבי לשתף יחסים למצב שבו צפיפות, צבירה של המבנים שכותרתו. מערכת היחסים הזו היא הוקמה בעקבות החישוב של פונקציה autocorrelation המרחבי של התמונה שנתפסו5.

כל הווריאציות של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה דורשים חישוב autocorrelation התמונה. זה ואחריו התאמת פונקציה זו לעקומה גאוסיאנית דו-ממדית על החילוץ של פרמטרים מצב צבירה כמותית הכלול בתוך התמונה. במילים פשוטות החישוב של autocorrelation תמונה כרוך השוואת כל זוגות פיקסל אפשרי בתוך תמונה וחישוב את הסבירות כי שניהם באותה מידה בהיר כמו אחד את השני. זה הוא מדמיין פונקציה של המרחק ואת הכיוונים של פיקסל ההפרדה8.

המסגרת התיאורטית ספקטרוסקופיה המתאם התמונה הוקמה ומוגדר על-ידי פיטרסון, ויסמן ואח. 5 , 6. ב פרוטוקול זה, autocorrelation החישובים מבוצעים פיג ' י/ImageJ, כמו גם יישום גליונות אלקטרוניים, ניתן לתאר את הבסיס עבור הפונקציה autocorrelation המרחבי עוצמת התנודה (Eq 1):

Equation 1     

כאשר F מייצג התמרת פורייה; F− 1 ההופכי פורייה שינוי צורה; F * המרוכב שלה; השהיה המרחבי משתנים חדוה , η. ב- ICS המרחבי, כפי שמתואר פרוטוקול זה, הפונקציה autocorrelation ניתן לחשב באמצעות 2D מהר פורייה המרה אלגוריתם7,9. Autocorrelation-אפס הפרדה מרחבית הידוע גם אפס-בעומר, ג'י11(0, 0), מספק את ההופכי רשע מספר החלקיקים מתנת קרן שטח של המיקרוסקופ. ניתן להשיג על-ידי הזזת את הפונקציה autocorrelation מרחבי פונקציה גאוסיאנית דו-ממדית (Eq 2):

Equation 3     

הפיקסלים שנתפסו בתמונה מוכלים בתוך אזור קבוע, מדידות אלה לא להרחיב עד אינסוף, המונח g∞ משמש היסט להביא בחשבון מתאמים המרחבי לטווח ארוך בתוך התמונה. למצרפי בגודל מולקולרי, ω הפונקציה בנקודה-התפשטות של המיקרוסקופ, שתואר על ידי רוחב המלא מקסימום חצי של הפונקציה autocorrelation המרחבי. השטח הכלול בתוך הפונקציה הליין של המכשיר התפקיד באמצעות חרוזים פלורסנט משנה רזולוציה.

עבור התמונה המתאם ספקטרוסקופיה פרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, autocorrelation ואת פונקציות מתמטיות הדרושים להשלמת ICS מבוצעות באמצעות פלטפורמת עיבוד הדמיה של קוד פתוח, פיג'י10, הפצת ImageJ תוכנית11,12. פיג ' י/ImageJ מנצל את השינוי פורייה מהירה שהותקנו מראש בפונקציה FFT במתמטיקה. פונקציה זו מקצרת את זמן מחשוב נדרש חישוב זה על-ידי הפחתת טווח הנתונים במקדם של שניים בכל ממד13. כמו בפונקציה 2D autocorrelation הוא סימטרי כ x, ציר y, מגרש פרופיל קו בודד על התמונה autocorrelation יכול לשמש כדי למדוד את autocorrelation גלם כפונקציה של השהיה מרחבית. רעש אפס-בעומר מוסר לפני בהמשך חישוב, עם משרעת autocorrelation וכתוצאה מכך (ערך שיא, g(0)T) מתוקנות על רקע עם הביטוי (Eq 3):

Equation 4     

איפה אניb הוא עוצמת רשע אזור רקע למעט התא. צפיפות אשכול, או צפיפות של אובייקטים פלורסנט, מוגדרת על-ידי (Eq 4):

Equation 5    

בפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, אנחנו עוד יותר פשוט חישוב צפיפות אשכול (CD), עם ההנחה בהתאם את התצפית כי פונקציה autocorrelation מנורמל תרקב לערך מתקרב 1.0 עם הגדלת לג מרחבית. עם השהיה המרחבי המרבי, יש עוד שום קורלציה של קרינה פלואורסצנטית ערכי העוצמה ומיחשוב ובכך ללא מתאם החישובים על אזור זה הם הערך של עוצמה מוכפל הזה בעוצמה אשר מחולק לאחר מכן ב- כיכר בעוצמה הזו, אשר מעצם הגדרתו הוא שווה ל- 1.0. לפיכך, אשכול צפיפות של פונקציה autocorrelation מנורמל יכול להיות מחושב על-ידי חיסור 1.0 מהפונקציה autocorrelation מנורמל לפני נטילת כל הדדיים (Eq 5):

Equation 6     

ניתן לבצע כיול נוסף של האזור קרן כדי quantitate את מספר אשכולות בתוך האזור של הפונקציה הליין של המכשיר. כיול זה חייב להתבצע תוך שימוש באותם תנאים אופטי המשמש במהלך ניתוח ספקטרוסקופיה המתאם התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זריעה של שורות תאים חסיד הדמיה ניסוי

  1. זרע 10,000 תאים סרטן epidermoid A431 לכל לילה טוב (O/N) ב- 300 µL של המדיה ששינה נשר בינוני/מזין תערובת F-12 (DMEM/F-12) של Dulbecco המכילה 10% סרום שור עוברית, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 1% GlutaMAX ב 8 תאיים הדמיה שקופית מתאים ברזולוציה גבוהה שמן טבילה המטרה עדשות (למשל, NuncTM מעבדה-TekTM תאיים coverglass).
  2. להמריץ צבירת קולטן על תאים A431 עם תוספת של 100 ננוגרם למ"ל EGF ליגנד בתקשורת 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).

2. ראשי נוגדן דגירה

  1. להסיר מדיה ולשטוף פעמיים תאים עם µL 300 תמיסת פוספט buffered (1 x PBS) בטמפרטורת החדר (RT).
  2. לתקן את התאים עם 200 µL של paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב- RT.
    הערה: על מנת לחקור את השינויים הטמפורלי של מצבור היעד, שלב קיבוע זה חייב להיות מושמט.
  3. הסר PFA ולשטוף פעמיים תאים עם 300 µL של טמפרטורת החדר PBS.
  4. דגירה תאים עם µL 200 ל- PBS המכיל נוגדנים ראשי-ריכוז של µg/mL 10 לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור ICS חישובים תהיה חוקית, כל הקולטנים על פני התא להיות מסומנים באמצעות נוגדן ראשוני. פעולה זו דורשת ניסויים מוקדמים עם סדרה דילול של כל נוגדן ראשוני (1:10, 1:50 מטריים, 1:200, שבערך 1:1, 000, וכו) שיש לבצע. ריכוז אופטימלי נוגדן ראשוני נקבע באמצעות ניתוח של עוצמת קרינה פלואורסצנטית מול דחיסות אשכול. הריכוז העיקרי שנבחרו מתרחש כאשר הצפיפות אשכול מישורים עם הגדלת ריכוז נוגדן ראשוני לפני התייקרות נוספת בצפיפות אשכול כתוצאה נוגדן ספציפי שאינו מחייב. יכול להיות מדולל נוגדן ראשוני בתקשורת חינם סרום אם ביצוע ניסוי הדמיה זמן כמובן.
  5. בעקבות השלמת זמן הדגירה הרצוי, לשטוף פעמיים תאים עם 300 µL ל- RT PBS.
  6. לחסום את הדגימה עם 5% שור אלבומין (BSA) ב- PBS לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: דגימות קבוע חסומים באופן שגרתי בין לילה (O/N) ב 4 º C.

3. משני נוגדן דגירה

  1. להכין מלאי µg/mL 10 של fluorescently עם התווית נוגדנים משניים (למשל עבור חיל הים אלקסה אג 488) ב- PBS. 2 µg/mL של Hoechst 33342 ייכלל באוסף הזה דילול כדי לאפשר גילוי מדגם משופר על המיקרוסקופ.
    הערה: לניסויים זמן לשגות, PBS ניתן להחליף את הנסיוב מדיה פנויה.
  2. להסיר 5% BSA/PBS מתאי דגירה עם הפתרון נוגדנים משניים עבור 2 h-4 ° C, תוך הגנה על הדגימות מפני אור מקיף.
  3. עם סיומו של זמן הדגירה נוגדנים משניים, לשטוף את התאים עם 300 µL ל- PBS (פעמיים) ולאחסן ב 4 ° C, מגן מפני אור מקיף.
  4. כדי למנוע אידוי, לעטוף את הקצוות של השקופית קאמרית עם מצלמות-מיקרוסקופים.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית דגימות

הערה: ההגדרות המשמשות לצורך ניתוח קונאפוקלית ישתנו בהתאם הציוד ואת fluorophores המשמשים את הניסוי בודדים. בכלים מודרניים קונאפוקלית מספקים מנגנונים לשמירת כל הפרמטרים הדמיה המשמשים את הניסוי בתבנית הקובץ של התמונה הטבעית של המכשיר. חשוב כי הגדרות אלה נרשמים כדי לספק עבור שכפול המתאים של תנאי ניסוי על פני תקופות שונות של הנתונים.

  1. במהלך דימות של אותות פלואורסצנט, להימנע רוויית יתר. השתמש מראה התמונה למעלה בטבלה אשר מספק ייצוג הצבע של פיקסלים רוויה ו לצמצם רווח גלאי לייזר כוח בהתאם. ביותר קונאפוקלית מכשירים לכלול להגדרה "טווח מחוון" או אפשרות מקבילה התוכנה רכישת בשביל זה.
  2. למזער את החשיפה של fluorophore עניין לייזר כוח. השימוש של כתם תיוג-DNA כגון Hoechst 33342 מספק מנגנון קל כדי לזהות ולמקם את הדגימה בתוך שדה הראייה לפני אוסף.
  3. לבצע את הבדיקות הראשוניות של המדגם ברזולוציה נמוכה אם התוכנה היתרי מהיר מהירות הסריקה. זה יגביל את photobleaching אפשרי של המדגם.
  4. להגדיל את הרזולוציה לכידת, להאט את מהירות סריקה כשאתה מוכן לאיסוף נתוני תמונה.
  5. אם המכשיר קונאפוקלית מאפשר, לאסוף נתונים באמצעות של פוטון סופר מצב.
    הערה: אם סופר פוטון אינה זמינה על המכשיר: להבטיח רמות האפור הם ליניארי במהלך ייבוא תמונות.
  6. הגדר את חריר עבור כל קו לייזר נהגה 1 יחידה אוורירי (AU).
  7. שימוש בקו או מסגרת בממוצע במהלך ייבוא תמונות (x4) כדי להפחית את גלאי קשורה רעש.
    הערה: גרסה זו של מעגלים משולבים כמו פעם אחת בלבד-נקודת נלכד רכישת זמן אינה ניסיוני גורם מגביל.
  8. עבור בחירת אוסף תמונות בהגדלה גדולה, המטרה מפתח נומרי גבוהה, כגון מטרה תוכנית-עדשה אפוכרומטית, לספק הרזולוציה המרבית ואת תיקון עבור סטיות כדוריות, כרומטית (דוגמאות כוללות תוכנית-עדשה אפוכרומטית 100 X או 63 X /1.40 מטרות שמן).
  9. Oversample הגודל של הפיקסלים שנתפסו בתוך התמונה. מומלץ לכל פיקסל ללכוד אזור 50 x 50 ננומטר. עבור ICS יעיל, גודל הפיקסל חייב להיות פחות מ 0.1 x מיקרומטר 0.12 לפיקסל. זו מושגת ע י שילוב של התקרבות לסרוק שטח קטן יחסית, בחירת פורמט תמונה גדולה יחסית (למשל 1024 x 1024 או 2048 x 2048 פיקסלים).
  10. להתמקד על פני השטח הפסגה או הבסיס של התא על אזור שטוח ככל האפשר. ניתן לאסוף תאים מרובים תמונה אחת והאזורים עניין מעובד בנפרד במהלך ניתוח ICS.
  11. ללכוד אזור ללא רקע התא באמצעות אותן הגדרות מכשיר שישמש עבור מדגם נורמליזציה.

5. חישוב של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

הערה: פלטפורמה עיבוד הדמיה פתוח, פיג'י, התפלגות של התוכנית ImageJ, נדרש לבצע את autocorrelation ואת פונקציות מתמטיות חיוני ל- ICS. הפיזור של ImageJ מומלצת שכן היא כוללת רבים מותקנת מראש plug-in, ארכיטקטורה עדכון קל יותר ניתן לבצע פעולות לאורך מספר ניסויים הדמיה.

  1. להתקין את התוכנית פיג'י (http://fiji.sc/Downloads).
  2. לטעון datasets הנרכש.
  3. זיהוי האזור ממברנה משטח הפסגה או הבזליים של עניין הכפילויות גודל פיקסל 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "תפריט: תמונות > לשכפל..."
  4. לחשב את ממוצע עוצמת האזור שייחתך עניין "תפריט: לנתח > מידות."
  5. לזהות אזור רקע ולשכפל הוא לאותו גודל פיקסל של קרום פני השטח של התא הלכידה (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "תפריט: תמונות > לשכפל..."
  6. חישוב ממוצע עוצמת ברקע שנחתכו תחומי עניין. "תפריט: לנתח > מידות."
  7. להחסיר את עוצמת הרקע מהתמונה המכיל את האזור של ריבית ממוצעת. "תהליך > תמונת מחשבון > להחסיר."
  8. לבצע חישוב Autocorrelation. חישוב זה נכלל בתוך המבנה תפריט: "תהליך > FTT > FD מתמטיקה."
    1. בחר בתיבת הדו-שיח המתמטיקה FD: 1 תמונה: שם התמונה חתוכה, מבצע כמו קורלציה, תמונה 2: שם התמונה חתוכה, טרנספורמציה ההופכית על.
  9. לנרמל את התמונה המתקבלת על-ידי חילוק המספר הכולל של פיקסלים. "תפריט: תהליך > מתמטיקה > לחלק..." (קרי: 64 x 64 פיקסלים = 4096)
  10. לנרמל שוב על-ידי חלוקת מעוצמת הממוצע מנורמל שנחתכו אזור בריבוע. "תפריט: תהליך > מתמטיקה > לחלק..."
    הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת התמונה לפי הערך הממוצע בעוצמה פעמיים.
  11. צייר קו על הפונקציה הליין.
  12. להתוות את הפרופיל של הקו לחישוב הערך שיא. "תפריט: לנתח > מגרש הפרופיל."
  13. לחשב האשכולות קרן שטח על-ידי העברת הערך שיא (תוצאה של 5.12) גיליון אלקטרוני ולבצע את החישוב שלהלן (Eq 6):
    Equation 7

6. עיבוד של ICS datasets אצווה

הערה: הקמת מאקרו פיג ' י/ImageJ מומלץ לשכפל את ההליכים המתוארים בפרוטוקול לעיל. דבר זה מאפשר ניתוח העקבית והמהירה של קבצי תמונות מרובות במהלך ניתוח ספקטרוסקופיה של המתאם תמונות.

  1. צור מאקרו ICS זרימת עבודה על-ידי הקלטת כל פקודת תפריט בפרוטוקול ICS
    "תפריט: תוספים > פקודות מאקרו > שיא...".
  2. בחר 'צור"כדי ליצור מאקרו.
  3. בחר "שפה > מאקרו IJ1."
  4. לשמור את המאקרו.
  5. הוסף תיבות דו-שיח שלבים שונים של המאקרו, מתן תזכורות מפעילי כל פונקציה. תיבות דו-שיח גם לשמש כשיטה כדי להשהות את תהליך ניתוח כדי לאפשר את הבחירות המתאימות להתבצע לפני בעיבוד נוסף (קרי, אזור לחיתוך)
    1. קוד מאקרו בתיבת הדו-שיח
      כותרת = "כותרת תיבת הדו-שיח";
      מונוסודיום גלוטמט = "הדו-שיח תיבת/פרוטוקול צעד ההודעה";
      waitForUser (כותרת, מונוסודיום גלוטמט);
      הערה: יעילות נוספים יכול להתבסס על-ידי הרשמה לאתר העדכונים בר בתוך המעדכן פיג'י (הוראות https://imagej.net/BAR). הדבר מספק פיג'י "אוסף של רוטינות בהרחבה ישים" 14. אחת שגרה כזו היא למצוא פסגות. מבנה התפריט: "בר > ניתוח נתונים > פסגות למצוא." קובץ script זה מספק שמהיר אומר חישוב שהערך שיא בפרופיל של הנקודה להפיץ את הפונקציה.

7. פרוטוקול הרחבות: חישוב קרן בשטח של מיקרוסקופ

הערה: פונקצית תמסורת אופטית של המיקרוסקופ מבטיחה כי אפילו בגודל מולקולרי אובייקטים מופיעים כתמונות עם רדיוס של בערך 200-300 ננומטר במישור x-y. פרוטוקול ICS מאפשרת קביעה של הפונקציה בנקודה-התפשטות על-ידי ביצוע שלבים 4-5 על חרוזים פלורסנט משנה רזולוציה. באופן ספציפי:

  1. הר משנה רזולוציה (קרי < קוטר 100 ננומטר) חרוזים פלורסנט אל 8 קאמרית שקופית הדמיה.
  2. התמונה חרוזים לפי הפרוטוקול המתואר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מנוצלים לניסויים ICS.
  3. לחשב את הפונקציה ICS מתוך התמונה המתקבלת לפי פרוטוקול צעדים 5.1-5.13.
  4. מהפרופיל המותווים, לחשב את רדיוס קרן (r) כמו לכל רוחב בערך חצי המרבי של פונקציית ה-ICS.
  5. לחשב את השטח קרן (BA) כמו (Eq 7):Equation 8

8. פרוטוקול הרחבות: חישוב של אשכולות לכל יחידת שטח

  1. חשב את צפיפות אשכול (CD) לכל יחידת שטח כמו (Eq 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. לחלק האשכולות קרן שטח (תוצאה של 5.13) על-ידי האזור של הקורה (תוצאה של 7.5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניסוי ספקטרוסקופיה של המתאם תמונה מוצלחת תלויה היישום של טיפול פקדים. קבוצות טיפול אלה כוללים הבחינה של זריחה נוגדן ראשוני אין וקבוצות טיפול אין נוגדנים משניים. ברגע ההגדרות של האופטימלית לייזר קונפוקלי מבוססים על ניסוי, תמונות חייב להתפס בקבוצות אלה בקרה כדי לוודא היעדר קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים בתוך המדגם. קווים רבים של תאי סרטן חסיד, זיהוי אזורים מתאימים עבור ICS הוא מוגבל על ידי חוסר של משטחים שטוחים. זה מפצה על ידי היכולת ללכוד תצוגה של שדה גדולה של תאים סרטניים מרובים קונאפוקלית תמונה אחת. פעולה זו מספקת את היכולת להפיק את הדגימה נדרש לבצע השוואות סטטיסטי בין קבוצות הטיפול.

בניסוי זה נציג, תאי סרטן epidermoid חיובי A431 EGFR, היו מגורה עם 100ng/mL של ליגנד EGF 10 דקות בטמפרטורת החדר לזירוז EGFR קיבוץ באשכולות. ניתוח ICS בוצעה בשני EGF מגורה (איור 1 א') ותאים (איור 1D) unstimulated בעקבות הדגירה עם EGFR מיקוד מואנשים חד-שבטיים, ארביטוקס. לאחר מכן, יבול 64 x 64 פיקסלים של אזור (תיבת צהוב) הכלול בתוך קרום התא (איור 1B ו- 1E) עיבדה את ניצול הפונקציה autocorrelation היה הכלול פלטפורמת קוד פתוח עיבוד תמונה, פיג'י. זו התמונה autocorrelation והתוצאה הייתה מנורמל על-ידי חיסור של זריחה רקע לפני חלוקת שני בכיכר בעוצמה ממוצעת של האזור המנורמל של עניין, כמו גם הריבוע של מספר הפיקסלים באזור החתוכה ( איור 1C ו- 1F). הכלי פונקציה קו שימש כדי להתוות את הפרופיל של הפונקציה בנקודה-התפשטות של תמונה זו (איור 1 ג'י ו- 1 H). הערך שיא של פרופילים אלה היו משורבב כדי יישום גליונות אלקטרוניים לעיבוד מידע נוסף. מאקרו פיג'י נוצר כדי לשכפל את השלבים בעיבוד פיג'י לעיבוד מהיר של סדרה של תאים (n = 6) בין שתי קבוצות טיפול בעקבות ארביטוקס immunocytochemistry (איור 1I). בניסוי זה, הקולטן EGFR זוהה 5.84 אשכולות ± 0.85 קרן שטח על פני השטח של A431 תאים מגורה לעומת 14.94 ± 1.62 אשכולות קרן שטח על האוכלוסיות תאים unstimulated. עם ההנחה כי התנאים ניסיוני המשמש תחלופה מהירה קולטן מגבלה זו ניתוח, הצפיפות אשכול EGFR בתאים A431 מגורה ירד 2.56-fold. כאשר התנאים מושווים עבור מצב צבירה של מולקולת המטרה אותה בתנאים כאשר היעד מולקולה להפוך מעל מוגבל, מספר נמוך יותר של אשכולות לכל אזור קרן מציין צבירת יעד מוגברים. בעקבות צבירת EGFR גירוי של ליגנד EGF מגדילה 2.56-fold כצפוי במערכת זו. הדור של מאקרו פיג'י באמצעות השלבים המתוארים בפרק פרוטוקול זה מאפשר השוואה סטטיסטית של טיפולים מגוונים או הבדלים סביבתיים והשפעתם על צבירת קולטן.

Figure 1
איור 1: התמונה ספקטרוסקופיה המתאם כדי לזהות fluorescently שכותרתו אשכולות על פני תאים תאים סרטניים חסיד. מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונה של נציג EGF מגורה (A) או unstimulated (D) A431 epidermoid קרצינומה של תאים חסיד המסומנת ארביטוקס נוגדן ראשוני פילוח תא הקולטן EGFR משטח עם אלכס עבור חיל הים 488 משני נוגדן. תאים מגורה טופלו 100 ננוגרם למ"ל EGF 10 דקות בטמפרטורת החדר לזירוז EGFR קיבוץ באשכולות לפני קיבוע ו- immunocytochemistry. קרום התא המכיל חיתוך אזורים (תיבת צהוב) עם מידות פיקסלים (64 x 64 [2n]) שימשו לביצוע ניתוח ICS (B ו- E). בעקבות נורמליזציה של הפונקציה autocorrelation, פיג ' י/ImageJ, השתמשו בכלי קו (צהוב) כדי למדוד את הפונקציה הליין (C ו- F) לפרופיל של זו פונקצית מותווים כדי לזהות את ערך שיא (G ו- H ). EGF גירוי נצפתה לזירוז ירידה 2.56-fold זוהה EGFR אשכולות לכל קרן אזור 5.84 ±0.85 בהשוואה 5±1.62 14.9 לתאים unstimulated (n = 6) (I). עם ההנחה, התנאים ניסיוני ניתוח זה נשמר מספר קבוע של קרום התא קולטנים, זה מייצג עלייה צבירת EGFR בעקבות גירוי EGF. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A ו- D); 1 מיקרומטר (B-C ו- E-F). תיבת מגרש מוצגים באמצעות סגנון Tukey עם שפם המייצגים ערכים שנצפו מינימלי ומקסימלי. לא יותר מאשר 1.5 × טווח בין רבעוני (IQR). אשכולות לכל קרן אזור ± לשגיאה הסטנדרטית של מתכוון (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה (ICS) שמתארים לנו ב פרוטוקול זה משתמש מיקרוסקופ קונפוקלי רגיל ללא צורך גלאים מיוחדים. ICS בטכניקה המתוארת מנצל immunocytochemistry ומבוססת שיטות כדי לספק עבור דיגום מהיר של תנאים מרובים הטיפול לניתוח סטטיסטי מוגברת. מתודולוגיה זו עושה את זה עם הפחתה קלה של דיוק מוחלט לעומת טכניקות חלופיות מולקולה בודדת בהתבסס על המתאם של קרינה פלואורסצנטית תנודות של מולקולות ניידים לשדר דרך אמצעי אחסון וידאו, כגון קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה (FCS)15. הגישה FCS יותר מיוחדים גם דורש רגישות גבוהה פוטון ספירת גלאי כמו מפולת פוטודיודה (APD) או גלאי חאספ יחד עם תוכנות מיוחדות ייעודי שאינה זמינה באופן שגרתי בכלים קונפוקלי הרגיל. ניתוח מקיף של הדיוק של ICS נחוש טכניקה זו ניתן למדוד במדויק את מספר אשכולות איפה > חלקיק 1 היא מתנה בתוך נקודת מוקד קרן לייזר סורק מיקרוסקופ7.

האוסף של תמונות פלורסנט המתאים יש חשיבות קריטית עבור ניתוח ICS מוצלחת. האזור עניין חייב להכיל אות גבוה ליחס פלורסנט רקע עם לייזר ולהשיג עוצמות מותאם להסרת רוויה בכל אות. חייב להיות חזק מהדגימה האזור הסלולר שנתפסו עם גודל פיקסל של 50 ננומטר. אזור זה חייב להיות הומוגני, עם תשומת לב payed להימנע הקצוות הסלולר או צמתים אשר יכול להגביר חפצים בחישוב autocorrelation. אחד החסרונות העיקריים של גישה ICS הוא הרגישות משטחים הסלולר הטרוגנית. לפיכך, הגבלת האזור שנלכדו אל פני השטח שטוחים המרבי, בלי קשר לצורה תא תשפר את הדיוק של כל ניתוח ICS.

מספר שיטות הדמיה נחקרו ללמוד את המצבור של מתחמי קולטן. מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מספק הערכה המרחבי ברזולוציה גבוהה של חלבון קיבוץ באשכולות אבל פועל תחת ואקום גבוה מאוד, אינה ישימה ללימודים המחייב רזולוציה טמפורלית. EM הוא יותר מוגבל כמו הכנת הדוגמא הקשה שלה הוא אוסרני עבור מגורים רקמות חקירות5. על מנת להתגבר על המגבלות רזולוציה הטבועה של תקן מיקרוסקופיה קונפוקלית, העברת האנרגיה תהודה פורסטר (סריג) ניתן להשתמש כדי לחשב את הארגון המרחבי של מבנים המסומנת חופפים זוגות fluorophores התורם ואת מקבל16 . למרות הרגישות שלה, סריג עם זאת מספקת מידע לגבי הגודל של מצרפי תחת חקירה6. פיתוח שיטות שונות של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות סופר רזולוציה לספק הזדמנויות מרגש לפתרון בלתי אפשרית עם רזולוציה תקנית שיטות קונאפוקלית17,18הסלולר אובייקטים. הוצאות והניסיון הנדרש של טכנולוגיות וכלים כאלה, מגביל את זמינותם שגרתי הנוכחי.

עם העלאות רגישות, צילום-רעילות נמוכה קונאפוקלית אינסטרומנטציה, ניתן להרחיב תמונה המתאם ספקטרוסקופיה לחקור את השינויים הטמפורלי של מצבור הקולטן בתאים חיים בניסויים זמן לשגות. זה יכול להיות juxtaposed עם הגברת את עוצמת הלייזר המשמש לזירוז בכוונה צילום הלבנת דוגמאות בודדות עם ICS עוקבות ההערכה (pbICS) כדי לקנטר לגזרים את המצבור מיומנויות נוכח כמה מתחמי קולטן9. נוספת התאקלמות, תמונת הצלב-המתאם ספקטרוסקופיה (ICCS) מספקת ניתוח של לוקליזציה משותף של שני חלבונים ממברנה המבוסס על דרך הניתוח של זוגות תמונה עבור כל חלבון שכותרתו fluorescently19. הכוח של מתודולוגיה ספקטרוסקופיה קורלציה זו התמונה היא כי הוא ממנף את טכניקות וותיקה בתחום ומספק צינור ניתוח זמינה בחופשיות כדי כמותיים דינמי מאוד האירועים המתרחשים קרום התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אנדרו סקוט מ' יש תמיכה AbbVie פרמצבטיקה, EMD סרונו, תחנת-Sankyo Co במימון מחקר, כולל ייעוץ, מניות הבעלות של תכשירים רפואיים מדעי החיים. המחברים אין אחרים שיוכים רלוונטי או מעורבות פיננסיים עם כל ארגון או גוף עם עניין פיננסי או סכסוך כספי עם הנושא או חומרים שנדונו בכתב היד מלבד אלה מגולה.

Acknowledgments

המחברים לאשר תמיכה NHMRC (מלגת 1084178 ו מענקי 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), במימון סרטן באוסטרליה, לחקר הסרטן לודוויג, ג'ון טי ריד בוטח, קרן סרטן המוח התרופה, La Trobe אוניברסיטת והסוכנות ויקטוריה סרטן. מימון התוכנית תמיכה תשתית תפעולית הניתן על ידי הממשלה ויקטוריאני, אוסטרליה הוא הודה גם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14 (2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7 (2007).

Tags

ביולוגיה גיליון 138 מיקרוסקופיה קונפוקלית התמונה המתאם ספקטרוסקופיה (ICS) נוגדנים: קולטן אינטראקציות נוגדן-סמים-המספר המשלים (ADC) imageJ פיג'י התמונה עיבוד קיבוץ באשכולות צבירת
מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A.,… More

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter