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Biology

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Abstract

Konfokale Mikroskopie bietet eine zugängliche Methode zur subzelluläre Interaktionen entscheidend für die Charakterisierung und Weiterentwicklung der präklinischen Agenten beschriftet mit fluoreszierenden Sonden zu erfassen. Mit neuen Zuführungen in Antikörper-basierte zytotoxischen Droge ist Trägersysteme, Verständnis der Veränderungen induziert durch diese Mittel im Bereich der Rezeptor-Aggregation und Internalisierung von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll nutzt die etablierten Verfahren der fluoreszierenden Immunocytochemistry und die open-Source Fidschi Verteilung von ImageJ, mit seinen eingebauten Autokorrelation und Bild mathematische Funktionen, räumliche Bildkorrelation durchführen Spektroskopie (ICS). Dieses Protokoll quantitates die fluoreszente Intensität der beschrifteten Rezeptoren als Funktion des Gebiets Strahl confocal Mikroskop. Dies bietet ein quantitatives Maß für den Zustand der Ziel-Molekül Aggregation auf der Zelloberfläche. Diese Methode konzentriert sich auf die Charakterisierung der statischen Zellen mit Potenzial in zeitlichen Untersuchungen der Rezeptor Aggregation zu expandieren. Dieses Protokoll stellt eine zugänglich Methode zur Quantifizierung der clustering-Ereignisse an der Zelloberfläche gut nutzen Techniken und nicht-spezialisierten bildgebenden Geräte eingerichtet bieten.

Introduction

Die Entwicklung von therapeutischen Antikörpern hat bemerkenswerte Erfolge bei der Behandlung von mehreren Tumor Arten1gezeigt. Die jüngsten Fortschritte der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) Oberfläche als Bereitstellungsmechanismen für Zytotoxische Substanzen erweitert die Anforderungen für das Verständnis der Dynamik der Antikörper: Rezeptor-Wechselwirkungen auf der Zelle2. Im Anschluss an die erfolgreiche Ausrichtung eines Antikörpers an die Zelle Oberfläche Rezeptor können diese komplexe ähnliche Aggregation Muster bei Ligand: Antikörper Interaktionen3induzieren. Veränderungen im Rezeptor Aggregation können Änderungen an der Membran und führen die Internalisierung der Rezeptor und seine Entfernung von der Zelloberfläche induzieren. Im Rahmen einer Antikörper-Wirkstoff-Konjugate löst dabei anschließend die zytotoxische Nutzlast in verinnerlichten Endosomen und anschließend das Zytoplasma, wodurch effektive Zelle Tötung.

Konfokale Mikroskopie hat ein wirksames Mittel zur Visualisierung dieser wichtigen Wechselwirkungen von Antikörpern und ihre Ziel-Rezeptoren4zur Verfügung gestellt. Um die Änderungen der Aggregation des Zielmoleküls an der Zelloberfläche erkunden nutzt dieses Protokoll Nachbearbeitung der konfokalen Mikroskopie Bilder über ein räumliches Bild Korrelation Spektroskopie (ICS) Technik 5,6,7 .

Die Stiftung der Bild Korrelation Spektroskopie ist die Beobachtung, dass räumliche Fluoreszenz intensitätsschwankungen eine Beziehung in der Dichte und Aggregation Zustand der beschrifteten Strukturen teilen. Diese Beziehung wird nach der Berechnung einer räumlichen Autokorrelation Funktion eines aufgenommenen Bildes5hergestellt.

Alle Varianten des Bildes Korrelation Spektroskopie erfordern die Berechnung der Autokorrelation ein Bild. Danach erfolgt durch den Einbau dieser Funktion zu einer zweidimensionalen Gaußschen Kurve für die Extraktion von quantitativen Aggregation Zustandsparameter innerhalb des Abbilds. In einfachen Worten die Berechnung eines Bildes Autokorrelation erfolgt ein Vergleich alle Paare möglich Pixel innerhalb eines Abbilds und Berechnung der Wahrscheinlichkeit, dass beide gleich hell wie jeder andere. Dies wird als eine Funktion des Abstandes und Richtungen der Pixel Trennung8visualisiert.

Der theoretische Rahmen für das Bild Korrelation Spektroskopie gegründet und von Petersen und Wiseman Et al.definiert. 5 , 6. in diesem Protokoll sind die Autokorrelation Berechnungen in Fidschi/ImageJ sowie einem Tabellenkalkulationsprogramm, die Grundlage für die Intensität Fluktuation räumliche Autokorrelationsfunktion kann als (Eq 1)beschrieben werden:

Equation 1     

wobei F die Fourier-Transformation darstellt; F−1 die Inverse Fourier transformieren; F * seine konjugiert Komplex; und die räumlichen Sträfling Variablen ε und η. In räumlichen ICS kann wie in diesem Protokoll beschrieben die Autokorrelationsfunktion berechnet werden mit einer 2D schnelle Fourier-Transformation Algorithmus7,9. Die Autokorrelation bei Null räumliche Trennung bekannt als NULL-Verzögerung, g11(0,0), bietet die inverse mittlere Anzahl von Partikeln pro Strahl Bereich des Mikroskops. Es kann durch den Einbau der räumlichen Autokorrelationsfunktion auf eine zweidimensionale Gaußsche Funktion (Eq 2)bezogen werden:

Equation 3     

Da die Pixel in einem Bild erfasst innerhalb eines festgelegten Bereichs enthalten sind und diese Messungen nicht bis ins Unendliche zu verlängern, wird der Begriff G∞ als Offset verwendet, um Langstrecken räumliche Zusammenhänge innerhalb des Abbilds zu berücksichtigen. Für Molekulare Größe Aggregate ω ist die Point-Spread Funktion des Mikroskops und durch die durchgehenden Hälfte-höchstens der räumlichen Autokorrelationsfunktion beschrieben. Der Bereich innerhalb der Point-spread-Funktion des Gerätes kann durch den Einsatz von Sub-Auflösung fluoreszierenden Perlen kalibriert werden.

Für das Bild Korrelation Spektroskopie Protokoll beschriebenen Autokorrelation und mathematische Funktionen erforderlich, um ICS zu vervollständigen erfolgt über das Open-Source-Imaging-Verarbeitung-Plattform, Fidschi10, eine Verteilung der ImageJ Programm11,12. Fiji/ImageJ nutzt die vorinstallierte schnelle Fourier-Transformation in das FFT mathematische Funktion. Diese Funktion reduziert die Rechenzeit benötigt dieser Berechnung durch die Reduzierung der Datenbereich um einen Faktor von zwei in jeder Dimension13. Wie die 2D Autokorrelationsfunktion ungefähr symmetrisch in X, y-Achse, ist kann ein einzelnes Profil Liniendiagramm durch Autokorrelation Bild verwendet werden, um die rohen Autokorrelation in Abhängigkeit von der räumlichen Lag zu messen. NULL-Verzögerung Lärm wird vor weiteren Berechnung, mit der sich daraus ergebenden Autokorrelation Amplitude (Spitzenwert, g(0)T) korrigiert für den Hintergrund mit dem Ausdruck (Eq 3)entfernt:

Equation 4     

wo ichb ist die mittlere Intensität aus einer Hintergrund-Region mit Ausnahme der Zelle. Die Cluster-Dichte oder Dichte von fluoreszierenden Objekten wird durch (Eq 4)definiert:

Equation 5    

In dem hier beschriebenen Protokoll fördern wir einfach die Berechnung der Dichte Cluster (CD), unter der Annahme, basierend auf der Beobachtung, die einer normierten Autokorrelationsfunktion auf einen Wert nähert sich 1.0 mit zunehmender räumlicher Verzögerung zerfallen wird. Mit maximale räumliche Lag, gibt es nicht mehr eine Korrelation der Fluoreszenz Intensitätswerte und somit ohne eine Korrelation sind die Berechnungen in dieser Region computing den Wert einer Intensität multipliziert mit dieser Intensität, die anschließend durch geteilt wird die Quadrat der, dass die Intensität, die definitionsgemäß 1,0 entspricht. Cluster-Dichte von einem normierten Autokorrelationsfunktion kann so berechnet werden, durch Subtraktion 1.0 von der normierten Autokorrelationsfunktion vor der Einnahme ihren gegenseitigen (Eq-5):

Equation 6     

Weitere Kalibrierung des Bereichs Strahl kann durchgeführt werden, um die Anzahl der Cluster im Bereich der Point-spread-Funktion des Gerätes enthalten quantitate. Diese Kalibrierung muß mit den gleichen optischen Bedingungen während der Bildanalyse Korrelation Spektroskopie verwendet durchgeführt werden.

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Protocol

(1) Aussaat von adhärenten Zelllinien für Imaging-Experiment

  1. Seed 10.000 A431 epidermoid Karzinomzellen pro gut über Nacht (O/N) in 300 µL Dulbeccos Eagle Medium/Nährstoff-Mischung geändert f-12 (DMEM/F-12) Medien mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin 1 % GlutaMAX in 8 Kammern imaging Folie für hochauflösende Öl eintauchen-Objektive geeignet (z.B., NuncTM Labor-TekTM Kammern Deckglas).
  2. Rezeptor-Aggregation auf A431 Zellen mit Zusatz von 100 ng/mL EGF Liganden in Medien für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zu stimulieren.

(2) Primärantikörper Inkubation

  1. Entfernen von Medien und Zellen mit 300 µL der Raumtemperatur (RT) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS) zweimal waschen.
  2. Befestigen Sie die Zellen mit 200 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei RT
    Hinweis: Um die zeitlichen Veränderungen der Ziel-Aggregation zu erkunden, muss dieser Schritt Fixierung verzichtet werden.
  3. Entfernen Sie PFA und waschen Sie Zellen mit 300 µL der Raumtemperatur PBS zweimal.
  4. Inkubieren Sie Zellen mit 200 µL PBS mit primären Antikörper in einer Konzentration von 10 µg/mL für mindestens 2 h bei 4 ° c
    Hinweis: Für ICS Berechnungen gültig sein soll, müssen alle Rezeptoren an der Zelloberfläche mit primären Antikörper beschriftet werden. Dies erfordert Vorversuchen mit einer Verdünnungsreihe von jedem Primärantikörper (01:10, 01:50, 1: 100, 1: 200 000, 1: 1:1, 500 etc.) durchgeführt werden. Optimale primäre antikörperkonzentration wird durch Analyse der Fluoreszenzintensität versus Cluster Dichte bestimmt. Die ausgewählte primäre Konzentration tritt auf, wenn die Cluster-Dichte mit zunehmender Primärantikörper Konzentrationen vor einem weiteren Anstieg in Cluster Dichte aufgrund unspezifischer Antikörperbindung Hochebenen. Der Primärantikörper kann im Serum freie Medien verdünnt werden, wenn eine Zeitverlauf Image Experiment durchführen.
  5. Waschen Sie nach Abschluss der gewünschten Inkubationszeit Zellen mit 300 µL RT PBS zweimal.
  6. Blockieren der Probe mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer für mindestens 2 h bei 4 ° C.
    Hinweis: Feste Proben werden routinemäßig blockiert über Nacht (O/N) bei 4 ° C.

(3) Sekundärantikörper Inkubation

  1. Bereiten Sie einen 10 µg/mL bestand von eindringmittel beschriftet Sekundärantikörper (z.B. Alexa Fluor 488 IgG) mit PBS-Puffer. 2 µg/mL Hoechst 33342 können in dieser Verdünnung ermöglicht verbesserte Probe Entdeckung am Mikroskop aufgenommen werden.
    Hinweis: Für Zeitraffer Experimente kann PBS für Serum freie Medien ausgetauscht werden.
  2. Entfernen von 5 % BSA/PBS aus den Zellen und bei gleichzeitigem Schutz der Proben vom Umgebungslicht mit der Sekundärantikörper Lösung für 2 h bei 4 ° C inkubieren.
  3. Waschen Sie nach Abschluss der Sekundärantikörper Inkubationszeit die Zellen mit 300 µL PBS (zweimal) und Lagerung bei 4 ° C, vor Licht zu schützen.
  4. Um Verdunstung zu vermeiden, wickeln Sie die Ränder der Folie mit Parafilm Kammer.

4. konfokalen Mikroskopie von Proben

Hinweis: Die Einstellungen für die konfokale Analyse variieren je nach Ausstattung und Fluorophore, die in den einzelnen Experiment verwendet. Moderne konfokale Instrumente bieten Mechanismen für die Rettung aller bildgebenden Parameter in das Experiment in die native Bilddateiformat des Instruments verwendet. Es ist wichtig, dass diese Einstellungen erfasst werden, um für die entsprechende Replikation der experimentellen Bedingungen in verschiedenen Perioden der Datenerfassung bieten.

  1. Vermeiden Sie während der Aufnahme von fluoreszierenden Signalen, Übersättigung. Verwenden Sie ein Bild Look-up-Tabelle, die eine Falschfarben-Darstellung der Pixel Sättigung bietet und verringern Detektor und Laserleistung entsprechend. Die konfokale Instrumente umfassen eine "Palette" anzeigestellung oder Analog-Option in der Datenerfassungs-Software dafür.
  2. Minimieren Sie die Belichtung der Fluorophor für laser-Leistung von Interesse. Die Verwendung des Fleckes DNA-Kennzeichnung wie Hoechst 33342 bietet einen einfachen Mechanismus zur Erkennung und positionieren Sie die Probe in das Sichtfeld vor der Abholung.
  3. Führen Sie die ersten Scans der Probe mit einer niedrigen Auflösung und wenn es die Software erlaubt eine schnelle scan-Geschwindigkeit. Dies schränkt die möglichen Immunofluoreszenz der Probe.
  4. Erhöhen Sie die Aufnahmeauflösung und verlangsamen Sie die Scan-Geschwindigkeit, wenn Sie bereit sind, Daten zu sammeln.
  5. Wenn die konfokale Instrument ermöglicht, sammeln Sie Daten mithilfe eines Photons Zählmodus.
    Hinweis: Wenn Photon zählen nicht auf das Gerät verfügbar ist: Graustufen sind während der Bildaufnahme linear zu gewährleisten.
  6. Legen Sie die Lochblende für jeden Laserlinie verwendet, um 1 luftig Einheit (AU).
  7. Verwendung Linie oder Rahmen im Durchschnitt während der Bildaufnahme (x4) Detektor reduzieren Lärm verbunden.
    Hinweis: Bei dieser Variante von ICS wie nur ein Zeit-Punkt gefangen ist Erfassungszeit ist nicht experimentell begrenzender Faktor.
  8. Für Bild Sammlung wählen Sie eine hohe Vergrößerung, hoher numerischer Apertur Ziel wie ein Plan-Apochromat Ziel, maximale Auflösung und Korrektur für sphärische und chromatische Aberrationen (Beispiele hierfür sind Plan-Apochromat 100 X oder 63 X /1.40 Öl-Ziele).
  9. Die Größe der aufgenommenen Pixel innerhalb des Abbilds abgetastet. Es wird empfohlen, jedes Pixel erfassen eine 50 x 50-nm-Region. Für effektive ICS muss Pixelgröße weniger als 0,1 x 0,1 µm2 pro Pixel sein. Dies wird erreicht durch eine Kombination von Zoom einer relativ kleinen Fläche zu scannen und wählen Sie ein relativ großes Bild-Format (z.B. 1024 x 1024 oder 2048 x 2048 Pixel).
  10. Konzentrieren Sie sich auf die apikale oder basalen Fläche der Zelle an einer Region so flach wie möglich. Mehrere Zellen können in einem Bild und Regionen von Interesse, die einzeln verarbeitet, während ICS Analyse gesammelt werden.
  11. Erfassen einer Zelle freien Hintergrund-Region mit den gleichen Instrumenteinstellungen für die Normalisierung der Probe verwendet werden.

5. Berechnung der Bild Korrelation Spektroskopie

Hinweis: Die Open-Source Imaging-Verarbeitung Plattform, Fidschi, eine Verteilung des Programms ImageJ ist erforderlich, zur Durchführung der Autokorrelation und mathematische Funktionen für ICS. Diese Verteilung von ImageJ wird empfohlen, da es enthält zahlreiche vorinstallierte Plug-ins und ein einfacher Update-Architektur, die Operationen über mehrere bildgebende Experimente durchführen kann.

  1. Fidschi-Programm (http://fiji.sc/Downloads) installieren.
  2. Laden Sie die erworbenen Datensätze.
  3. Identifizieren der apikalen oder Basalzellkarzinom Oberfläche Membran Region Interesse und Duplikat Pixelgröße von 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menü: Bild > duplizieren..."
  4. Berechnen Sie die durchschnittliche Intensität des zugeschnittenen Bereichs des Interesses "Menü: analysieren > Messungen."
  5. Eine Hintergrund-Region zu identifizieren und Duplizieren Sie die Pixel Größe der Oberfläche Zellmembran erfassen (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menü: Bild > duplizieren..."
  6. Berechnen Sie die durchschnittliche Intensität des Hintergrunds Interessengebiet zugeschnitten. "Menü: analysieren > Messungen."
  7. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Intensität der Hintergrund aus dem Bild mit der Region von Interesse. "Prozess > Bild Rechner > subtrahieren."
  8. Durchführen Sie Autokorrelation Berechnung. Diese Berechnung ist innerhalb der Menüstruktur enthalten: "Prozess > FTT > FD Mathe."
    1. In der Mathematik FD dialog Box wählen Sie: Bild 1: beschnitten Bildnamen, Betrieb als Korrelation, Bild 2: beschnitten Bildnamen, Inverse Transformation auf.
  9. Das resultierende Bild dividiert durch die Gesamtzahl der Pixel zu normalisieren. "Menü: Prozess > Mathematik > teilen..." (d.h.: 64 x 64 Pixel = 4096)
  10. Normalisieren Sie wieder dividiert durch die durchschnittliche Intensität der normalisierten Bereich Quadrat zugeschnitten. "Menü: Prozess > Mathematik > teilen..."
    Hinweis: Dies kann erreicht werden, indem man das Bild von den durchschnittlichen Intensitätswert zweimal.
  11. Zeichnen Sie eine Linie durch die Point-spread-Funktion.
  12. Zeichnen Sie das Profil dieser Linie, die Peak-Wert zu berechnen. "Menü: analysieren > Plotten Profil."
  13. Berechnen Sie die Cluster pro Strahl Fläche durch die Übertragung des Spitzenwert (Ergebnis 5.12) in eine Tabelle und führen Sie die folgende Berechnung (Eq 6):
    Equation 7

6. Stapelverarbeitung von ICS datasets

Hinweis: Die Einrichtung eines FIJI/ImageJ-Makros wird empfohlen, in den oben genannten Protokoll beschriebenen Verfahren zu replizieren. Dies ermöglicht für die konsequente und schnelle Analyse von mehreren Bilddateien während Korrelation Spektroskopie Bildanalyse.

  1. Einen Makro-ICS-Workflow zu etablieren, indem Sie jedem Menübefehl in der ICS-Protokoll aufzeichnen
    "Menü: Plugins > Makros > Record...".
  2. Wählen Sie "Create" Makro generieren.
  3. Wählen Sie "Sprache > IJ1 Makro."
  4. Makro zu speichern.
  5. Fügen Sie Dialogfelder zu den verschiedenen Schritten des Makros, Bereitstellung von Erinnerungen an die Betreiber der einzelnen Funktionen. Dialogfelder dienen auch als Methode zur Analyse, um entsprechende Auswahl vor der weiteren Verarbeitung (z.B. Region Zuschneiden) erfolgen zu ermöglichen anzuhalten
    1. Dialog-Box-Makro-Code
      Titel = "Titel Dialogfelds";
      msg = "Dialog Box/Protokoll Schritt Nachricht";
      WaitForUser (Titel, msg);
      Hinweis: Zusätzliche Effizienz können festgestellt werden, abonnieren Sie die BAR-Update-Site innerhalb der Fidschi-Updater (Anweisungen https://imagej.net/BAR). Dies bietet Fidschi "eine Sammlung von allgemein geltenden Routinen" 14. Eine solche Routine ist Find Gipfeln. Menü-Struktur: "BAR > Datenanalyse > Find Gipfeln." Dieses Skript bietet bedeutet eine schnelle Berechnung der Spitzenwert im Profil des Punktes Funktion verteilt.

7. Protokoll-Erweiterungen: Berechnung der Strahl Bereich des Mikroskops

Hinweis: Die optische Übertragungsfunktion des Mikroskops sorgt dafür, dass auch Molekulare Größe Objekte als Bilder mit einem Radius von etwa erscheinen 200-300 nm in der X-y-Ebene. Das ICS-Protokoll ermöglicht die Festlegung der Point-Spread Funktion indem die Schritte 4 und 5 auf Sub-Auflösung fluoreszierenden Perlen. Konkret:

  1. Sub-Auflösung zu montieren (d. h. < 100 nm Durchmesser) fluoreszierende Perlen auf eine 8 Kammer bildgebende Dia.
  2. Bild Perlen entsprechend beschriebene Protokoll mit confocal Mikroskop für ICS Experimente genutzt.
  3. Berechnen Sie die ICS-Funktion aus dem daraus resultierenden Bild gemäß Protokoll Schritte 5.1-5.13.
  4. Berechnen Sie aus dem gezeichneten Profil den Strahl Radius (R) als die volle Breite am halben Maximalwert der ICS-Funktion.
  5. Berechnen Sie die Breite Fläche (BA) als (Eq 7):Equation 8

8. Protokoll-Erweiterungen: Berechnung von Clustern pro Flächeneinheit

  1. Berechnen Sie die Cluster-Dichte (CD) pro Flächeneinheit als (Eq 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. Teilen Sie die Cluster pro Strahl Fläche (Ergebnis 5.13) durch den Bereich des Balkens (Ergebnis von 7,5).

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Representative Results

Eine erfolgreiches Image Korrelation Spektroskopie Experiment ist die ordnungsgemäße Anwendung der Behandlung Steuerelemente abhängig. Diese Behandlungsgruppen umfassen die Prüfung der Fluoreszenz in keine primären Antikörper und keine Sekundärantikörper Behandlungsgruppen. Sobald die optimale konfokale Lasereinstellungen für ein Experiment hergestellt sind, müssen Bilder von diesen Kontrollgruppen zu bestätigen, das Fehlen von unspezifischen Fluoreszenz in der Probe erfasst werden. Für viele Anhänger Krebszelllinien ist die Festlegung der Regionen für ICS geeignet durch das Fehlen von Ebenen Flächen begrenzt. Dies wird kompensiert durch die Möglichkeit, ein großes Sichtfeld von mehreren Krebszellen in einem einzigen konfokale Bild zu erfassen. Dies bietet die Möglichkeit, die erforderliche Probenahme um statistische Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen ausführen generieren.

In diesem repräsentativen Experiment wurden A431 EGFR positive epidermoid Karzinomzellen angeregt, mit 100ng/mL EGF Liganden für 10 min bei Raumtemperatur, EGFR clustering zu induzieren. ICS-Analyse wurde durchgeführt über beide EGF stimuliert (Abbildung 1A) und unstimulierte (Abbildung 1) Zellen nach Inkubation mit der EGFR targeting humanisierten monoklonalen Antikörper Cetuximab. Anschließend ein 64 x 64 Pixel Zuschneiden einer Region (gelber Kasten) in die Zellmembran enthalten (Abbildung 1 b und 1E) verarbeitet wurde unter Verwendung der Autokorrelationsfunktion in der Open-Source Bildverarbeitungs-Plattform, Fidschi enthalten war. Das Ergebnisbild Autokorrelation wurde durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz vor der Teilung durch beide das Quadrat der mittleren Intensität der normalisierten Region von Interesse sowie das Quadrat der Anzahl der Pixel in der abgeschnittenen Region ( normalisiert Abbildung 1 und 1F). Mit dem Linienwerkzeug Funktion wurde verwendet, um das Profil der Point-Spread Funktion dieses Bildes zeichnen (Abbildung 1 und 1 H). Der Spitzenwert dieser Profile wurden umgesetzt, ein Tabellenkalkulationsprogramm zur Weiterverarbeitung der Daten. Ein Makro Fidschi wurde generiert, um diese Fidschi Verarbeitungsschritte für schnelle Bearbeitung einer Reihe von Zellen zu replizieren (n = 6) von beiden Behandlungsgruppen nach Cetuximab Immunocytochemistry (Abbildung 1I). In diesem Experiment wurde der EGFR-Rezeptor identifiziert in 5,84 ± 0,85-Cluster pro Strahl-Bereich auf der Oberfläche für den A431 stimulierte Zellen im Vergleich zu 14,94 ± 1,62 Cluster pro Strahl in den unstimulierte Zellen Populationen. Mit der Annahme, dass die experimentellen Bedingungen für diese Analyse Grenze schnelle Rezeptor Umsatz verwendet verringert die EGFR-Cluster-Dichte in stimulierten A431 Zellen 2.56-fold. Wenn Bedingungen für den Aggregatzustand des gleichen Zielmoleküls Bedingungen verglichen werden als Ziel Molekül Turn-Over begrenzt ist, zeigt eine geringere Anzahl von Clustern pro Strahl Bereich erhöhte Ziel Aggregation. EGF-Liganden-Stimulation-EGFR-Aggregation nach 2.56-fold erwartungsgemäß in diesem System erhöht. Die Generierung eines Fidschi-Makros mithilfe der Schritte in diesem Protokoll beschriebenen ermöglicht für den statistischen Vergleich von unterschiedlichen Behandlungen oder ökologische Unterschiede und ihre Auswirkungen auf Rezeptor-Aggregation.

Figure 1
Abbildung 1: Bild Korrelation Spektroskopie eindringmittel erkennen beschriftet Cluster auf der Zelloberfläche von anhaftenden Krebszellen. Konfokale Mikroskopie Bild Vertreter EGF stimuliert (A) oder unstimulierte (D) anhaftenden A431 epidermoid Karzinomzellen beschriftet mit Cetuximab Primärantikörper targeting Zelle Oberfläche EGFR-Rezeptor mit Alex Fluor 488 sekundäre Antikörper. Stimulierte Zellen wurden mit 100 ng/mL EGF für 10 min bei Raumtemperatur induzieren EGFR clustering vor der Fixierung und Immunocytochemistry behandelt. Zellmembran enthaltenden Zuschneidebereiche (gelbe Box) mit Pixelabmessungen (64 x 64 [2n]) wurden verwendet, um ICS Analyse (B und E) durchführen. Nach Normalisierung der Autokorrelationsfunktion in Fidschi/ImageJ, das Linien-Werkzeug (gelb) wurde verwendet, um die Point-spread-Funktion (C und F) messen das Profil dieser Zeile-Funktion wird aufgetragen, um den Spitzenwert (G und H erkennen ). EGF-Stimulation beobachtet induzieren eine 2.56-fold Abnahme der EGFR-Cluster pro Strahl Bereich 5.84 ±0.85 im Vergleich zu 14,9 5±1.62 unstimulierte Zellen erkannt (n = 6) (I). Mit der Annahme, die experimentellen Bedingungen in dieser Analyse beibehalten eine Konstante Anzahl von Zellmembran Rezeptoren verwendeten entspricht dies einer Steigerung im EGFR-Aggregation nach EGF Stimulation. Maßstabsleisten = 10 µm (A und D); 1 µm (B-C und E-F). Box-Plot mit Tukey-Stil mit Backenbart, die maximale und minimale beobachteten Werte nicht mehr als 1,5 × interquartilbereich (IQR) angezeigt. Cluster pro Strahl Bereich ± Standardfehler des bedeuten (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Technik des Bildes Korrelation Spektroskopie (ICS), die wir in diesem Protokoll zu beschreiben verwendet standard konfokale Mikroskope ohne die Notwendigkeit für spezielle Detektoren. Die beschriebene ICS-Technik nutzt etablierte Immunocytochemistry Methoden für schnelle Probenahme von mehreren Behandlungsbedingungen für erhöhte statistische Analysen zu. Diese Methodik tut dies mit einem leichten Rückgang der absoluten Präzision im Vergleich zu alternativen Einzelmolekül-Techniken basierend auf Korrelation der Fluoreszenz Schwankungen der mobilen Moleküle diffundieren durch eine konfokale Volumen, wie Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS)15. Die speziellere FCS Ansatz erfordert auch hohe Empfindlichkeit Photon zählen Detektoren wie Lawine Fotodiode (APD) oder GaAsP Detektoren zusammen mit engagierten spezialisierte Software, der nicht routinemäßig auf konfokalen Standardinstrumente verfügbar ist. Eine umfassende Analyse der Präzision der ICS bestimmt diese Technik kann die Anzahl der Cluster genau messen wo > 1 Partikel innerhalb der Strahl Brennfleck von der Laser-scanning-Mikroskop7vorhanden ist.

Die Auflistung der entsprechenden fluoreszierende Bilder ist von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche ICS-Analyse. Die Region von Interesse muss enthalten ein high-Signal zu Leuchtstofflampen mit Laser und gewinnen Intensitäten angepasst, um alle Signalsättigung zu entfernen. Die zelluläre Region gefangen muss mit einer Pixelgröße von ca. 50 überreferenziert nm. Dieser Region muss homogen, mit großer Sorgfalt zu vermeiden, zelluläre Kanten oder Kreuzungen die Artefakte in der Autokorrelation Berechnung erhöhen können bezahlt werden. Eine der großen Gefahren eines ICS-Ansatzes ist die Empfindlichkeit auf heterogenen zellulären Oberflächen. So wird die Region erfasst, die maximale Fläche begrenzen, unabhängig von der Zellform die Genauigkeit von ICS Analysen verbessern.

Mehrerer bildgebende Verfahren wurden untersucht, um die Aggregation der Rezeptor-komplexe zu studieren. Elektronenmikroskopie (EM) liefert hochauflösende räumliche Einschätzung der clustering-Protein aber betreibt unter extrem hohem Vakuum und gilt nicht für Studien, die zeitlichen Auflösung erfordern. EM ist weiter begrenzt, da seine harten Probenvorbereitung unerschwinglich für lebende ist Gewebe Untersuchungen5. Um die inhärenten Auflösung Einschränkungen der standard konfokalen Mikroskopie, Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) lässt sich berechnen, die räumliche Organisation der Strukturen, beschriftet mit überlappenden Donor und Akzeptor Fluorophore Paare16 . Trotz seiner Empfindlichkeit bietet Bund jedoch Information bezüglich der Größe der Aggregate unter Untersuchung6. Die Entwicklung der verschiedenen Superresolution Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden bieten spannende Möglichkeiten zur zellulären Objekte mit Standardauflösung konfokale Methoden17,18nicht möglich zu beheben. Kosten und Know-how, solche Technologien und Instrumente, begrenzt deren aktuelle alltägliche Verfügbarkeit.

Mit Zunahme der Empfindlichkeit und niedrigen Phototoxizität konfokale Instrumentation kann Bild Korrelation Spektroskopie erweitert werden, um zeitliche Veränderungen der Rezeptor Aggregation in lebenden Zellen im Zeitraffer Experimente zu erkunden. Dies kann mit zunehmender Leistung des Lasers verwendet, um absichtlich induzieren Foto Bleichen von Einzelproben mit nachfolgenden ICS Bewertung (PbICS), die höherer Ordnung Aggregation vorhanden in einigen Rezeptor-komplexe9auseinander zu necken gegenübergestellt werden. Eine weitere Anpassung Bild Kreuzkorrelation Spektroskopie (ICCS) liefert eine Analyse der Co Lokalisierung von zwei basierte Membranproteinen durch die Analyse der Bildpaare für jedes fluoreszent markierten Protein-19. Die Stärke dieser Bild Korrelation Spektroskopie-Methode ist, dass es Techniken im Bereich etabliert nutzt und bietet einer frei verfügbare Analyse Pipeline nach quantitativen hochdynamische Ereignisse an der Zellmembran.

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Disclosures

Andrew M Scott Forschung, die finanzielle Unterstützung von AbbVie Pharmazie, EMD Serono und Daiichi Sankyo Co. hat, und hat ein Beratungs- und Aktienbesitz von Life Science Arzneimitteln. Die Autoren haben keine anderen relevanten Mitgliedschaften oder finanzielle Beteiligung mit einer Organisation oder Person mit ein finanzielles Interesse an oder finanzielle Konflikt mit dem Gegenstand oder Materialien diskutiert in der Handschrift mit Ausnahme derjenigen nicht offengelegt.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen finanzielle Unterstützung von NHMRC (Fellowship 1084178 und Zuschüsse 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), Krebs Australien, Ludwig Cancer Research, John Reid T vertraut, Heilung Brain Cancer Foundation, La Trobe University und der Victoria-Krebs-Agentur. Mitteln aus der operativen Infrastruktur Support-Programm von der Staatsregierung zur Verfügung gestellt, wird Australien auch anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 138 konfokale Mikroskopie Bild Korrelation Spektroskopie (ICS) Antikörper: Rezeptor-Wechselwirkungen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) ImageJ Fidschi Bildverarbeitung clustering Aggregation
Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie
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Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

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