Confocale microscopie onthult cel oppervlakte Receptor aggregatie via afbeelding correlatie spectroscopie

Summary

Antilichamen die zich aan target receptoren van het celoppervlak binden kunnen verlenen bevleesdheid en clustering wijzigingen. Deze dynamische veranderingen hebben gevolgen voor het karakteriseren van Geneesmiddelenontwikkeling in de doelcellen. Dit protocol maakt gebruik van de confocal microscopie en afbeelding correlatie spectroscopie via ImageJ/FIJI te kwantificeren van de omvang van de receptor clustering op het celoppervlak.

Abstract

Confocale microscopie biedt een toegankelijke methode om vast te leggen van cruciaal belang voor de karakterisering en de verdere ontwikkeling van pre-klinische agenten gelabeld met de fluorescerende sondes sub cellulaire interacties. Met de recente vooruitgang in antilichaam gebaseerd cytotoxische drug is levering systemen, inzicht in de wijzigingen veroorzaakt door deze agenten binnen het domein van de receptor aggregatie en internalisering van cruciaal belang. Dit protocol borduurt voort op de gevestigde methodologie van fluorescerende immunocytochemie en de verdeling van de opensource-FIJI voor ImageJ, met zijn ingebouwde autocorrelatie en de afbeelding wiskundige functies, voor het uitvoeren van ruimtelijke beeld correlatie spectroscopie (ICS). Dit protocol kwantificeert de fluorescerende intensiteit van gelabelde receptoren als een functie van de ruimte van de lichtbundel van de confocal microscoop. Dit biedt een kwantitatieve meting van de Braziliaanse deelstaat doel molecuul aggregatie op het celoppervlak. Deze methode is gericht op de karakterisatie van statische cellen met potentieel uit te breiden in temporele onderzoeken van receptor aggregatie. Dit protocol biedt een toegankelijk methodologie om een kwantificering van clustering van gebeurtenissen die plaatsvinden op het celoppervlak, technieken en niet-gespecialiseerde beeldvormende apparatuur met behulp van goed gevestigd.

Introduction

De ontwikkeling van therapeutische antistoffen heeft aangetoond opmerkelijke succes in de behandeling van meerdere tumor type¹. De recente ontwikkelingen op het gebied van geconjugeerde (ADC) van de antilichaam-drug oppervlakte zoals uitvoeringsmechanismen voor cytotoxische stoffen heeft de eisen voor het begrip van de dynamiek van antilichaam: receptor interakties bij de cel uitgebreid². Na de succesvolle targeting op van een antilichaam aan de cel-oppervlakte receptor, kunnen deze complexen veroorzaken vergelijkbare aggregatie patronen die waargenomen in ligand: antilichaam interacties³. Wijzigingen in de receptor aggregatie kunnen leiden tot wijzigingen in het membraan en het resultaat in de internalisering van de receptor en de verwijdering van het celoppervlak. In het kader van een geconjugeerde antilichaam-drug vrij dit proces vervolgens de cytotoxische nettolading in verinnerlijkte Endosomen en vervolgens het cytoplasma, resulterend in effectieve cel doden.

Confocale microscopie heeft een doeltreffend middel voor het visualiseren van deze belangrijke interacties van antilichamen en hun doel receptoren⁴verstrekt. Voor het verkennen van de veranderingen van de samenvoeging van de doelmolecule op het celoppervlak dit protocol maakt gebruik van nabewerking van confocale microscopie beelden via een ruimtelijk beeld correlatie spectroscopie (ICS) techniek ^5,6,7 .

De Stichting voor beeld correlatie spectroscopie is de waarneming dat schommelingen van de intensiteit van de ruimtelijke fluorescentie een relatie met de dichtheid en de aggregatie-staat van de gelabelde structuren delen. Deze relatie komt tot stand na de berekening van de autocorrelatiefunctie van een ruimtelijke van een opname-⁵.

Alle varianten van afbeelding correlatie spectroscopie vereisen de berekening van de autocorrelatie van een afbeelding. Dit wordt gevolgd door het aanbrengen van deze functie een tweedimensionale Gauss-curve voor de extractie van kwantitatieve aggregatie-staat parameters opgenomen binnen het besturingselement image. In eenvoudige termen de berekening van de autocorrelatie van een afbeelding gaat vergelijken alle de mogelijke pixel paren deel uitmaakt van een afbeelding en het berekenen van de kans dat beide even zo helder als elkaar. Dit is als een functie van de afstand en richting van pixel scheiding⁸gevisualiseerd.

Het theoretisch kader voor de afbeelding correlatie spectroscopie werd vastgesteld en gedefinieerd door Petersen en Wiseman et al. ^{5 , 6}. in dit protocol, de autocorrelatie berekeningen worden uitgevoerd in Fiji/ImageJ evenals een spreadsheetprogramma, de basis voor de intensiteit schommelingen ruimtelijke autocorrelatiefunctie kan worden omschreven als (Eq 1):

     

waar F vertegenwoordigt de Fourier-transformatie; F⁻¹ de inverse Fourier transform; F * de complex geconjugeerde; en de ruimtelijke lag variabelen ε en η. In ruimtelijke ICS, zoals beschreven in dit protocol, kan de autocorrelatiefunctie worden berekend met behulp van een 2D snelle Fourier transform algoritme^7,9. De autocorrelatiefunctie op nul ruimtelijke scheiding ook wel bekend als nul-lag, g₁₁(0,0), biedt het omgekeerde gemiddelde aantal deeltjes per oppervlakte-straal van de Microscoop aanwezig. Het kan worden verkregen door het aanbrengen van de ruimtelijke autocorrelatiefunctie naar een tweedimensionale Gauss functie (Eq 2):

     

Als de pixels gevangen binnen een afbeelding binnen een set gebied zijn opgenomen en deze metingen niet uit te tot in het oneindige breiden doen, wordt de term g∞ gebruikt als een compensatie voor lange-afstands ruimtelijke correlaties die deel uitmaakt van de afbeelding. Voor moleculaire en middelgrote aggregaten, ω is de functie van de punt-spread van de Microscoop en beschreven door de volle breedte op half-maximale van de ruimtelijk autocorrelatiefunctie. Het gebied dat deel uitmaakt van het punt verspreiden-functie van het instrument kan worden gekalibreerd met behulp van sub resolutie fluorescerende kralen.

Voor de afbeelding correlatie spectroscopie protocol hierin beschreven, worden de autocorrelatie en wiskundige functies vereist voor het voltooien van de Internet-verbinding delen uitgevoerd met behulp van de open-sourceplatform imaging-verwerking, Fiji¹⁰, een verdeling van de ImageJ programma^11,12. Fiji/ImageJ maakt gebruik van de vooraf geïnstalleerde snelle Fourier-transformatie in de FFT Math-functie. Deze functie vermindert de compute tijd die nodig is voor deze berekening door vermindering van het gegevensbereik met een factor twee in elke dimensie¹³. Zoals de 2D autocorrelatiefunctie ongeveer symmetrisch in x, y-as is kan een enkellijns profiel perceel door het beeld van de autocorrelatie worden gebruikt voor het meten van de ruwe autocorrelatie als een functie van de ruimtelijke lag. Geen nul-lag-geluid wordt verwijderd voorafgaand aan verdere berekening, met de daaruit voortvloeiende autocorrelatie amplitude (piekwaarde, g(0)_T) gecorrigeerd voor de achtergrond met de expressie (Eq-3):

     

waar ik_b is de gemiddelde intensiteit van een gebied op de achtergrond met uitzondering van de cel. De cluster densiteit of dichtheid van fluorescente voorwerpen, wordt gedefinieerd door (Eq 4):

    

In het protocol hierin beschreven, verder we gewoon de berekening van de dichtheid van het cluster (CD), met de veronderstelling gebaseerd op de observatie dat een genormaliseerde autocorrelatiefunctie zal vergaan op een waarde 1.0 met toenemende ruimtelijke lag naderen. Met maximale ruimtelijke vertraging, er is niet langer een correlatie van fluorescentie intensiteitswaarden en dus zonder een correlatie zijn de berekeningen op deze regio computing de waarde van een intensiteit vermenigvuldigd met deze intensiteit die wordt vervolgens gedeeld door de kwadraat van die intensiteit, die per definitie gelijk is aan 1,0. Dus, kan de cluster dichtheid van een genormaliseerde autocorrelatiefunctie door af te trekken 1.0 van de genormaliseerde autocorrelatiefunctie alvorens de wederkerige (Eq 5)worden berekend:

     

Verdere kalibratie van de lichtbundel gebied kan worden uitgevoerd om het kwantificeren van het aantal clusters deel uitmaakt van het gebied van het punt verspreiden-functie van het instrument. Dit moet worden gekalibreerd met behulp van dezelfde optische voorwaarden gebruikt tijdens de beeldanalyse correlatie spectroscopie.

Protocol

1. het zaaien van aanhangend cellijnen voor Imaging-Experiment

1. Zaad van 10.000 A431 epidermoïde carcinoom cellen per goed overnachting (O/N) in 300 µL van Dulbecco van bewerkt Eagle Medium/nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12) media bevattende 10 gewichtspercenten foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% GlutaMAX in een 8 chambered imaging dia geschikt voor hoge resolutie olie-immersie-objectieven (bijvoorbeeld NuncTM Lab-TekTM chambered dekglaasje).
2. Stimuleren de receptor aggregatie op A431 cellen met toevoeging van 100 ng/mL EGF ligand in de media gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).

2. primair antilichaam-incubatie

1. Verwijder media en cellen met 300 µL kamertemperatuur (RT) fosfaatgebufferde zoutoplossing (1 x PBS) twee keer wassen.
2. Herstellen van de cellen met de 200 µL van 4% paraformaldehyde in PBS voor 10 min op RT.
   Opmerking: Om te verkennen de temporele veranderingen van doel aggregatie, deze stap fixatie moet worden weggelaten.
3. Verwijder PFA en cellen met 300 µL van kamertemperatuur PBS tweemaal wassen.
4. Incubeer de cellen met 200 µL van PBS met primair antilichaam bij een concentratie van 10 µg/mL gedurende ten minste 2 uur bij 4 ° C.
   Opmerking: Voor de berekeningen van de ICS te gelden, alle receptoren aanwezig op het celoppervlak moeten worden aangeduid met primair antilichaam. Dit vereist voorbereidende experimenten met een verdunningsreeks van elk primair antilichaam (1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 1:1, 000, enz.) moet worden uitgevoerd. Optimale primair antilichaam concentratie wordt bepaald door analyse van de intensiteit van de fluorescentie versus cluster dichtheid. De geselecteerde primaire concentratie treedt op wanneer de cluster dichtheid randplateau met toenemende primair antilichaam concentraties voorafgaand aan een verdere verhoging in cluster dichtheid als gevolg van niet-specifieke antilichaam binding. Het primaire antilichaam kan worden verdund in serum vrije media als een tijdsverloop imaging experiment uitvoert.
5. Na voltooiing van gewenste incubatietijd, cellen met 300 µL van RT PBS tweemaal te wassen.
6. Blokkeren van het monster met 5% bovien serumalbumine (BSA) in PBS voor ten minste 2 uur bij 4 ° C.
   Opmerking: Vaste monsters worden routinematig geblokkeerd overnachting (O/N) bij 4 ° C.

3. secundair antilichaam-incubatie

1. Bereiden een 10 µg/mL voorraad van fluorescently gelabeld secundair antilichaam (b.v. Alexa Fluor 488 IgG) in PBS. 2 µg/mL Hoechst 33342 kunnen worden opgenomen in deze verdunning te voorzien in verbeterde monster ontdekking op de Microscoop.
   Opmerking: Voor time-lapse experimenten, PBS kan worden ingewisseld voor serum vrije media.
2. Verwijderen van 5% BSA/PBS uit de cellen en incubeer met de secundair antilichaam oplossing gedurende 2 uur bij 4 ° C, terwijl de bescherming van de monsters van omgevingslicht.
3. Na voltooiing van secundair antilichaam-incubatietijd, wassen van de cellen met 300 µL van PBS (tweemaal) en bewaren bij 4 ° C, beschermen tegen omgevingslicht.
4. Om te voorkomen dat verdamping, wikkel de randen van de kamer-dia met parafilm.

4. confocale microscopie van monsters

Opmerking: De instellingen die worden gebruikt voor analyse van de confocal zal verschillen afhankelijk van de apparatuur en fluorophores gebruikt in de individuele experiment. Moderne confocal instrumenten bieden mechanismen voor het opslaan van alle imaging parameters die worden gebruikt in het experiment in de bestandsindeling van de native beeld van het instrument. Het is belangrijk dat deze instellingen worden vastgelegd om te voorzien in passende replicatie van experimentele omstandigheden over verschillende periodes van data-acquisitie.

1. Tijdens de beeldvorming van fluorescerende signalen, Vermijd overmatige verzadiging. Gebruik van een opzoeken met afbeelding van de tabel die een kleurenweergave van de valse van pixel verzadiging biedt en verminderen detector winst en laser macht dienovereenkomstig. Meest confocal middelen omvatten met name een "bereik indicator" instelling of soortgelijke optie in de acquisitie software hiervoor.
2. Het minimaliseren van de blootstelling van fluorophore van belang zijn voor laser power. Het gebruik van een DNA-labeling vlek zoals Hoechst 33342 biedt een eenvoudig mechanisme om te detecteren en plaatsen van het monster in het gezichtsveld voor de collectie.
3. De eerste scans van het monster met een lage resolutie uitvoeren en als software een snelle laat scansnelheid. Hiermee beperkt u de mogelijke photobleaching van het monster.
4. Verhoog de resolutie vastleggen en verlaag de snelheid van de scan als u klaar bent voor het verzamelen van afbeeldingsgegevens.
5. Als de confocal instrument dat toelaat, verzamelen van gegevens met behulp van een foton tellen modus.
   Opmerking: Als het foton tellen is niet beschikbaar op het instrument: zorgen grijze niveaus zijn lineaire tijdens Beeldacquisitie.
6. Stel het gaatje voor elke regel van de laser gebruikt om 1 luchtige eenheid (AU).
7. Gebruik lijn of frame gemiddeld tijdens Beeldacquisitie (x4) om de detector verbonden lawaai.
   Opmerking: In deze variant van ICS als slechts één tijdstip is vastgelegd Acquisitietijd is niet experimentele factor te beperken.
8. Voor foto collectie selecteren een hoge vergroting, hoog numerieke diafragma doelstelling, zoals een doelstelling van het Plan-Apochromat, zodat de maximale resolutie en correctie voor sferische en chromatische aberraties (voorbeelden zijn Plan-Apochromat 100 X of 63 X /1.40 Olie doelstellingen).
9. Oversample de grootte van de gevangen pixels in de afbeelding. Het is aangeraden elke pixel vangen een 50 x 50 nm regio. Voor effectieve ICS moet pixelformaat minder dan 0.1 x 0.1 µm² per pixel. Dit wordt bereikt door een combinatie van inzoomen om het scannen van een relatief klein gebied en een relatief grote beeldformaat (bijvoorbeeld 1024 x 1024 of 2048 x 2048 pixels) selecteren.
10. Focus op het apicale of basale oppervlak van de cel aan een regio zo plat mogelijk. Meerdere cellen kunnen worden verzameld in één beeld en regio's van belang afzonderlijk verwerkt tijdens de ICS-analyse.
11. Vastleggen van een cel gratis achtergrond regio met dezelfde instellingen instrument moet worden gebruikt voor de normalisatie van de steekproef.

5. berekening van de afbeelding correlatie spectroscopie

Opmerking: De open-source imaging-processing platform, Fiji, een verdeling van de ImageJ program, is vereist voor het uitvoeren van de autocorrelatie en wiskundige functies essentieel voor ICS. Deze distributie voor ImageJ wordt aanbevolen omdat hierin talrijke vooraf geïnstalleerde plug-ins en een gemakkelijker bijwerken architectuur die bewerkingen op meerdere beeldvorming experimenten uitvoeren kunt.

1. Het programmainstalleren Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Laden van de verworven datasets.
3. Identificeer de apicale of basale cel oppervlakte membraan regio van belang en duplicaat pixelgrootte van 2ⁿ (128 x 128, 256 x 256, 64 x 64). "Menu: afbeelding > dupliceren..."
4. Berekenen van de gemiddelde intensiteit van de bijgesneden gebied van belang "Menu: Analyse > metingen."
5. Identificeren van een gebied op de achtergrond en dupliceren naar de dezelfde pixelgrootte van de celmembraan oppervlakte vangen (2ⁿ: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menu: afbeelding > dupliceren..."
6. Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond bijgesneden gebied van belang. "Menu: Analyse > metingen."
7. Aftrekken van de gemiddelde intensiteit van de achtergrond van de afbeelding met de regio van belang. "Proces > beeld Calculator > aftrekken."
8. Berekening van de autocorrelatiefunctie. Deze berekening is vervat in de menustructuur: "proces > FTT > FD Math."
   1. In de wiskunde FD dialoogvenster Selecteer: afbeelding 1: bijgesneden afbeelding naam, werking als correlatie, afbeelding 2: de naam van de afbeelding bijgesneden, Inverse transformatie op.
9. Normaliseren het resulterende beeld door te delen door het totale aantal pixels. "Menu: proces > wiskunde > verdelen..." (dat wil zeggen: 64 x 64 pixels = 4096)
10. Normaliseren opnieuw door te delen door de gemiddelde intensiteit van de genormaliseerde bijgesneden gebied kwadraat. "Menu: proces > wiskunde > verdelen..."
    Opmerking: Dit kan worden bereikt door het delen van de afbeelding door de intensiteitswaarde van de gemiddelde tweemaal.
11. Teken een lijn via de functie van het punt verspreiden.
12. Het profiel van deze regel voor de berekening van de piekwaarde worden uitgezet. "Menu: analyseren > Plot profiel."
13. De clusters per bundel oppervlakte berekenen door de overdracht van de piekwaarde (resultaat van 5.12) naar een werkblad en voer de volgende berekening (Eq 6):
    

6. batch-verwerking van ICS datasets

Opmerking: De oprichting van een FIJI/ImageJ macro wordt aanbevolen voor het repliceren van de procedures die zijn beschreven in het bovenstaande protocol. Dit zorgt voor de consistente en snelle analyse van meerdere afbeeldingsbestanden tijdens beeldanalyse correlatie spectroscopie.

1. Een macro ICS workflow stellen door het opnemen van elke menuopdracht in het ICS-protocol
   "Menu: Plugins > macro's > Record...".
2. Selecteer "Create" voor het genereren van de Macro.
3. Selecteer "Language > IJ1 Macro."
4. Sla de Macro.
5. Dialoogvensters toevoegen aan verschillende stappen van de macro, verstrekken van herinneringen aan exploitanten van elke functie. Dialoogvensters ook dienen als een methode om te pauzeren het analyseproces te voorzien in passende selecties worden gemaakt vóór verdere verwerking (dat wil zeggen, de regio om te snijden)
   1. Code voor het dialoogvenster Macro
      titel = "Dialoogvenster vak titel";
      msg = "Dialog Box/Protocol stap bericht";
      waitForUser (titel, msg);
      Opmerking: Extra efficiëntie kunnen worden vastgesteld door een abonnement op de site update BAR binnen de FIJI Updater (instructies https://imagej.net/BAR). Dit biedt FIJI "een verzameling van breed toepasbare Routines" ¹⁴. Één dergelijke routine is zoeken pieken. Menustructuur: "BAR > gegevensanalyse > zoeken pieken." Dit script is dat een snelle hulpmiddel voor de berekening van dat de piekwaarde in het profiel van het punt verspreiden functie.

7. protocol-extensies: Berekening van Beam gebied van Microscoop

Opmerking: De optische overdrachtsfunctie van de Microscoop zorgt ervoor dat zelfs moleculaire middelgrote objecten worden weergegeven als afbeeldingen met een straal van ongeveer 200-300 nm in de x-y-vlak. Het ICS-protocol kunt bepalen van het punt-spread-functie door het uitvoeren van stap 4 en 5 op sub resolutie fluorescerende kralen. Met name:

1. Mount sub resolutie (d.w.z. < 100 nm diameter) TL kralen op een 8 kamer imaging dia.
2. Afbeelding kralen per beschreven protocol met behulp van de confocal microscoop gebruikt voor ICS-experimenten.
3. Bereken de ICS-functie van de resulterende afbeelding per protocol stappen 5.1-5.13.
4. Bereken de straal van de straal (r) als de volle breedte op de helft van de maximale waarde van de functie Internet-verbinding delen uit het uitgezette profiel.
5. Het berekenen van de oppervlakte van de lichtbundel (BA) (Eq 7):

8. protocol-extensies: Berekening van Clusters Per oppervlakte-eenheid

1. Bereken de dichtheid van het cluster (CD) per oppervlakte-eenheid als (Eq 8):
   
   
2. Verdeel de clusters per bundel gebied (resultaat van 5.13) door het gebied van de lichtbundel (resultaat van 7.5).

Representative Results

Een succesvolle afbeelding correlatie spectroscopie experiment is afhankelijk van de juiste toepassing van controles van de behandeling. Deze behandeling-groepen zijn het onderzoek van de fluorescentie in geen primair antilichaam en geen secundair antilichaam behandelgroepen. Zodra de optimale confocale laser-instellingen zijn opgegeven voor een experiment, moeten van deze controlegroepen te bevestigen van het gebrek aan niet-specifieke fluorescentie binnen het monster beelden vastleggen. Voor vele aanhangend kanker cellijnen, wordt de identificatie van de regio's geschikt voor Internet-verbinding delen beperkt door het ontbreken van vlakke oppervlakken. Dit wordt gecompenseerd door de mogelijkheid om een groot gezichtsveld van meerdere kankercellen in een enkel confocal beeld te vangen. Dit biedt de mogelijkheid voor het genereren van de vereiste bemonstering voor het uitvoeren van statistische vergelijkingen tussen behandelgroepen.

In dit representatieve experiment, werden A431 EGFR positieve epidermoïde carcinoom cellen, gestimuleerd met 100ng/mL EGF ligand gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ertoe EGFR clustering. ICS-analyse werd uitgevoerd op beide EGF gestimuleerd (figuur 1A) en ongestimuleerde (Figuur 1 d) cellen na incubatie met de EGFR targeting gehumaniseerd monoklonaal antilichaam, cetuximab. Vervolgens een gewas van 64 x 64 pixel van een regio (gele box) dat deel uitmaakt van de celmembraan (figuur 1B en 1E) werd verwerkt met behulp van de autocorrelatiefunctie was vervat in de open-source-beeldverwerking platform, FIJI. Dit resultaat van de autocorrelatie was genormaliseerd door af te trekken van de fluorescentie achtergrond voorafgaand aan delen door zowel het kwadraat van de gemiddelde intensiteit van de genormaliseerde regio van belang, evenals het plein van het aantal pixels in de bijgesneden regio ( Figuur 1 c en 1F). Het hulpmiddel lijn functie werd gebruikt om het uitzetten van het profiel van de functie van de punt-spread van dit beeld (figuur 1G en 1 H). De piekwaarde van deze profielen werden omgezet naar een spreadsheetprogramma voor verdere verwerking van de gegevens. Een macro van FIJI is gegenereerd voor het repliceren van deze FIJI verwerking stappen voor snelle verwerking van een aantal cellen (n = 6) van beide groepen van de behandeling na cetuximab immunocytochemie (figuur 1I). In dit experiment, was de EGFR-receptor op 5,84 ± 0,85 clusters per oppervlakte-balk op het oppervlak van de A431 gestimuleerd cellen ten opzichte van 14.94 ± 1.62 clusters per bundel gebied in de populaties van ongestimuleerde cellen geïdentificeerd. Met de aanname dat de experimentele omstandigheden voor deze analyse limiet snelle receptor omzet gebruikt, daalde de EGFR cluster dichtheid in gestimuleerd A431 cellen 2.56-fold. Wanneer voorwaarden worden vergeleken voor de toestand van de aggregatie van de dezelfde doelmolecule in omstandigheden als doel molecuul verloop beperkt is, geeft een lager aantal clusters per bundel gebied toegenomen doel aggregatie. 2.56-fold zoals verwacht in dit systeem verhoogt na EGF ligand stimulatie EGFR aggregatie. De generatie van een FIJI-macro met behulp van de stappen die worden beschreven in dit protocol voorziet in de statistische vergelijking van uiteenlopende behandelingen of milieu verschillen en hun effecten op de receptor aggregatie.

Figuur 1: Image correlatie spectroscopie te detecteren fluorescently label clusters op het celoppervlak van aanhangend kankercellen. Confocale microscopie beeld van vertegenwoordiger EFG gestimuleerd (A) of ongestimuleerde (D) aanhangend A431 epidermoïde carcinoom cellen aangeduid met cetuximab primair antilichaam gericht op cel oppervlakte EGFR receptor met Alex Fluor 488 secundaire antilichaam. Gestimuleerd cellen werden behandeld met 100 ng/mL EGF gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor het opwekken van clusters voorafgaand aan de fixatie en immunocytochemie EGFR. Cell membrane met gewas regio's (gele box) met pixelafmetingen (64 x 64 [2ⁿ]) werden gebruikt om de ICS-analyses (B en E) uit te voeren. Na normalisatie van de autocorrelatiefunctie in FIJI/ImageJ, het hulpmiddel lijn (geel) werd gebruikt voor het meten van de functie van het punt verspreiden (C en F) het profiel van de functie van deze regel wordt uitgezet om te ontdekken de piekwaarde (G en H ). EGF stimulatie werd waargenomen voor het opwekken van een daling van de 2.56-fold gedetecteerd EGFR clusters per bundel gebied 5.84 ±0.85 t.o.v. 14.9 5±1.62 naar ongestimuleerde cellen (n = 6) (I). Met de aanname, de experimentele omstandigheden gebruikt in deze analyse een constant aantal celmembraan receptoren, betekent dit een toename EGFR aggregatie na EGF stimulatie. Schaal Bars = 10 µm (A en D); 1 µm (B-C en E-F). Boxplot weergegeven met behulp van Tukey stijl met snorharen vertegenwoordigen maximum en minimum waargenomen waarden niet meer dan 1,5 × interkwartielafstand (IQR). Clusters per bundel gebied ± standaardafwijking van het betekenen (SEM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De techniek van de afbeelding correlatie spectroscopie (ICS) die we in dit protocol beschrijven maakt gebruik van standaard confocal microscopen zonder de behoefte aan gespecialiseerde detectoren. De techniek van de Internet-verbinding delen beschreven maakt gebruik van gevestigde immunocytochemie methoden te voorzien van snelle bemonstering van meerdere behandeling voorwaarden voor verhoogde statistische analyse. Deze methode doet dat met een lichte daling in absolute precisie in vergelijking met alternatieve enkel molecuul technieken op basis van de correlatie van de schommelingen van de fluorescentie van mobiele moleculen verspreiden via een confocal volume weer, zoals fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)¹⁵. De meer gespecialiseerde FCS benadering vereist ook hoge gevoeligheid foton detectoren zoals lawine fotodiode (APD) of GaAsP detectoren samen met specifieke gespecialiseerde software die niet routinematig beschikbaar op confocal standaardinstrumenten tellen. Een uitgebreide analyse van de precisie van ICS bepaald deze techniek kan het aantal clusters nauwkeurig meten waar > 1 deeltje is aanwezig binnen de focal plek van de straal van de laser scanning microscoop⁷.

De collectie van passende fluorescerende beelden is van cruciaal belang voor een succesvolle ICS-analyse. De regio van belang moet bevatten een hoog signaal achtergrond TL / met laser en intensiteiten aangepast om te verwijderen van de verzadiging van een signaal krijgen. De cellulaire regio gevangen moet worden overgesampeld met een pixelgrootte van ongeveer 50 nm. Deze regio moet homogeen, met zorgvuldige aandacht betaald ter voorkoming van cellulaire randen of kruispunten die artefacten in de berekening van de autocorrelatiefunctie kunnen verhogen. Een van de valkuilen van een ICS-aanpak is de gevoeligheid voor heterogene cellulaire oppervlakken. Zo zal beperken de regio vastgelegd in de maximale vlakke ondergrond, ongeacht de vorm van de cel verbeteren de nauwkeurigheid van elke ICS-analyse.

Meerdere beeldvormende modaliteiten werden onderzocht om te bestuderen van de samenvoeging van receptor complexen. Elektronenmicroscopie (EM) biedt hoge resolutie ruimtelijke beoordeling van clustering van eiwit maar opereert onder extreem hoog vacuüm en geldt niet voor studies die temporele resolutie. EM is verder beperkt aangezien haar harde monstervoorbereiding onbetaalbaar voor levend is weefsel onderzoek⁵. Om te overwinnen van de beperkingen die inherent zijn aan resolutie van standaard confocale microscopie, Förster resonance energy transfer kan (FRET) worden gebruikt voor het berekenen van de ruimtelijke organisatie van de structuren die zijn gelabeld met overlappende donor en acceptor fluorophores paren¹⁶ . Ondanks de gevoeligheid levert FRET echter geen informatie met betrekking tot de grootte van de aggregaten onder onderzoek⁶. De ontwikkeling van verschillende super resolutie fluorescentie Microscopie methodes bieden spannende mogelijkheden te lossen cellulaire objecten niet mogelijk zijn met standaard resolutie confocal methoden^17,18. De kosten en expertise die nodig is voor dergelijke technologieën en instrumenten, beperkt hun huidige alledaags beschikbaarheid.

Met de toename van de gevoeligheid en lage foto-toxiciteit in confocale instrumentatie, kan afbeelding correlatie spectroscopie worden uitgebreid om te verkennen van de temporele veranderingen van aggregatie van de receptor in levende cellen in time-lapse experimenten. Heb dit met het vergroten van de kracht van de laser ertoe opzettelijk foto bleken van afzonderlijke monsters met latere ICS beoordeling (pbICS) gebruikt om pesten elkaar de hogere-orde aggregatie aanwezig in sommige receptor complexen⁹kan worden geplaatst. Een verdere aanpassing, afbeelding cross-correlatie spectroscopie (ICCS) geeft een analyse van de co lokalisatie van twee gebaseerd membraaneiwitten door de analyse van combinaties van de afbeelding voor elke fluorescently geëtiketteerde eiwit¹⁹. De kracht van deze afbeelding correlatie spectroscopie methodologie is dat het maakt gebruik van technieken die goed ingeburgerd in het veld en biedt een vrij beschikbare analyse pijpleiding naar kwantitatieve de hoogdynamische gebeurtenissen op de celmembraan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG