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Biology

Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

Gli anticorpi che si legano ai recettori bersaglio sulla superficie delle cellule possono conferire conformazione e alterazioni clustering. Questi cambiamenti dinamici hanno implicazioni per caratterizzare lo sviluppo di farmaci nelle cellule bersaglio. Questo protocollo utilizza la microscopia confocale e spettroscopia di correlazione di immagine attraverso ImageJ/FIJI per quantificare l'entità del recettore sulla superficie cellulare di clustering.

Abstract

Microscopia confocale fornisce una metodologia accessibile per catturare subcellulare interazioni critiche per la caratterizzazione e l'ulteriore sviluppo di pre-clinici agenti etichettati con sonde fluorescenti. Con gli avanzamenti recenti nella droga citotossica anticorpo basato su sistemi di consegna, comprendere le alterazioni indotte da questi agenti all'interno del Regno di aggregazione del recettore e di interiorizzazione è di importanza critica. Questo protocollo sfrutta la metodologia consolidata di immunocytochemistry fluorescente e la distribuzione di FIJI di open source di ImageJ, con la sua autocorrelazione integrato e funzioni matematiche di immagine, per eseguire la correlazione di immagine spaziale spettroscopia (ICS). Questo protocollo quantitates l'intensità di fluorescenza dei recettori con etichettati in funzione della zona di fascio del microscopio confocale. Questo fornisce una misura quantitativa dello stato di aggregazione della molecola bersaglio sulla superficie delle cellule. Questa metodologia è focalizzata sulla caratterizzazione di celle statiche con potenziale di espandersi in indagini temporale dell'aggregazione del recettore. Questo protocollo presenta una metodologia accessibile per fornire quantificazione degli eventi che si verificano alla superficie delle cellule, utilizzando ben stabilito non specializzati imaging apparato e tecniche di clustering.

Introduction

Lo sviluppo di anticorpi terapeutici ha dimostrato notevole successo nel trattamento del tumore più tipi1. I recenti progressi dei coniugati di anticorpo-farmaco (ADC) come meccanismi di consegna per composti citotossici ha ampliato i requisiti per comprendere le dinamiche delle interazioni anticorpo: recettore dalla cella di superficie2. Dopo il successo di targeting di un anticorpo per il recettore di superficie delle cellule, questi complessi possono indurre modelli di aggregazione simili a quelle osservate nel ligando: anticorpo interazioni3. Alterazioni nell'aggregazione del recettore possono indurre cambiamenti alla membrana e risultato nell'internalizzazione del recettore e la sua rimozione dalla superficie delle cellule. Nel contesto di un anticorpo-farmaco coniugato, questo processo rilascia successivamente il payload citotossico in endosomi interiorizzati e, successivamente, il citoplasma, con conseguente uccisione efficace delle cellule.

Microscopia confocale ha fornito un mezzo efficace di visualizzare queste interazioni importanti degli anticorpi e la loro destinazione recettori4. Per esplorare i cambiamenti di aggregazione delle molecole alla superficie delle cellule questo protocollo utilizza la post-elaborazione di immagini di microscopia confocale via un immagine spaziale correlazione spettroscopia (ICS) tecnica 5,6,7 .

La Fondazione di spettroscopia di correlazione di immagine è l'osservazione che le fluttuazioni di intensità di fluorescenza spaziale condividano un rapporto con lo stato di densità e aggregazione delle strutture con etichettate. Questa relazione è stabilita dopo il calcolo di una funzione di autocorrelazione spaziale di un immagine catturata5.

Tutte le varianti di spettroscopia di correlazione di immagine richiedono il calcolo di un'immagine di autocorrelazione. Questo è seguito inserendo questa funzione ad una curva gaussiana bidimensionale per l'estrazione dei parametri di stato di aggregazione quantitativi contenuti nell'immagine. In termini semplici il calcolo di un'immagine di autocorrelazione implica il confronto tutte le coppie possibili pixel contenuti all'interno di un'immagine e calcolare la probabilità che sia altrettanto brillante come l'altro. Questo viene visualizzato come una funzione della distanza e direzioni di pixel separazione8.

Il quadro teorico per la spettroscopia di correlazione di immagine è stato stabilito e definito da Petersen e Wiseman et al. 5 , 6. nel presente protocollo, vengono eseguiti i calcoli di autocorrelazione in Fiji/ImageJ, nonché un'applicazione di foglio di calcolo, la base per la funzione di autocorrelazione spaziale di intensità fluttuazione può essere descritto come (Eq. 1):

Equation 1     

dove F rappresenta la trasformata di Fourier; F− 1 la trasformata di Fourier trasformazione inversa; F * suo complesso coniugato; e il ritardo spaziale variabili ε e η. In ICS spaziale, come descritto in questo protocollo, la funzione di autocorrelazione può essere calcolata usando un 2D fast Fourier transform algoritmo7,9. L'autocorrelazione a zero separazione spaziale, altrimenti noto come zero-lag, g11(0,0), fornisce l'inverso numero medio di particelle presenti per area di larghezza del microscopio. Può essere ottenuto inserendo la funzione di autocorrelazione spaziale a una funzione gaussiana bidimensionale (Eq. 2):

Equation 3     

Come i pixel acquisiti all'interno di un'immagine sono contenuti all'interno di una area set e queste misurazioni non si estendono all'infinito, il g∞ di termine è utilizzato come un offset per tenere conto delle correlazioni spaziali a lungo raggio contenute all'interno dell'immagine. Per gli aggregati di dimensioni molecolari, ω è la funzione di punto di diffusione del microscopio e descritto dalla larghezza piena a metà-al massimo la funzione di autocorrelazione spaziale. L'area contenuta all'interno della funzione di diffusione del punto dello strumento può essere calibrato attraverso l'uso di perline fluorescenti Sub-resolution.

Per protocollo di spettroscopia di correlazione di immagine descritto nel presente documento, l'autocorrelazione e funzioni matematiche necessarie per completare ICS vengono effettuate mediante la piattaforma di imaging-elaborazione di open-source, Fiji10, una distribuzione del ImageJ programma11,12. Fiji/ImageJ utilizza la trasformazione di Fourier veloce preinstallata nella funzione FFT matematica. Questa funzione riduce il tempo di calcolo necessario di questo calcolo, riducendo l'intervallo di dati da un fattore di due in ogni dimensione13. Come la funzione di autocorrelazione 2D è approssimativamente simmetrica in x, asse y, una singola linea profilo trama attraverso l'immagine di autocorrelazione può essere utilizzata per misurare l'autocorrelazione crudo come una funzione del GAL spaziale. Qualsiasi rumore zero-lag è rimosso prima dell'ulteriore calcolo, con l'ampiezza risultante di autocorrelazione (valore di picco, g(0)T) corretto per lo sfondo con l'espressione (Eq 3):

Equation 4     

dove hob è l'intensità media da una regione di sfondo esclusa la cella. La densità di cluster, o la densità di oggetti fluorescenti, è definito dal (Eq. 4):

Equation 5    

Nel protocollo descritto nel presente documento, inoltre semplicemente il calcolo della densità di cluster (CD), con il presupposto basato sull'osservazione che una funzione di autocorrelazione normalizzato decadrà su un valore che si avvicina 1.0 con ritardo spaziale crescente. Con massimo ritardo spaziale, non c'è più alcuna correlazione di fluorescenza i valori di intensità e così senza una correlazione i calcoli in questa regione sono calcolo del valore di intensità moltiplicato questa intensità che viene successivamente diviso per la Piazza di tale intensità, che per definizione è uguale a 1.0. Così, densità di cluster da una funzione di autocorrelazione normalizzato può essere calcolata sottraendo 1.0 dalla funzione di autocorrelazione normalizzato prima della presa del suo reciproco (Eq 5):

Equation 6     

Ulteriore calibrazione della zona fascio può essere effettuata per quantificare il numero di cluster contenute all'interno dell'area della funzione punto diffusione dello strumento. Questa taratura deve essere eseguita utilizzando le stesse condizioni ottiche utilizzate durante l'analisi di spettroscopia di correlazione immagine.

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Protocol

1. semina delle varietà di cellula aderenti per esperimento di Imaging

  1. Seme 10.000 cellule di carcinoma epidermoide A431 per ben pernottamento (O/N) a 300 µ l di media per volta Eagle Medium/nutriente miscela F-12 (DMEM/F-12) di Dulbecco contenente 10% di siero fetale bovino, 1% penicillina-streptomicina e l'1% GlutaMAX in un 8 camerato imaging diapositiva adatto per alta risoluzione olio immersione lenti dell'obiettivo (ad es., NuncTM Lab-TekTM camerato coprioggetto).
  2. Stimolare l'aggregazione del recettore sulle cellule A431 con aggiunta di legante di EGF 100 ng/mL in media per 10 min a temperatura ambiente (TA).

2. primaria dell'anticorpo incubazione

  1. Rimuovere i supporti e lavare le cellule con 300 µ l di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di temperatura ambiente (TA) (1x PBS) due volte.
  2. Fissare le cellule con 200 µ l di paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a TA.
    Nota: Per esplorare i cambiamenti temporali dell'aggregazione di destinazione, questo passaggio di fissazione deve essere omesso.
  3. PFA di rimuovere e lavare le cellule con 300 µ l di PBS di temperatura due volte.
  4. Incubare le cellule con 200 µ l di PBS contenente l'anticorpo primario ad una concentrazione di 10 µ g/mL per almeno 2 ore a 4 ° C.
    Nota: Per il calcolo di ICS per essere valido, tutti i recettori presenti sulla superficie cellulare devono essere etichettati con l'anticorpo primario. Ciò richiede esperimenti preliminari con una serie di diluizioni di ogni anticorpo primario (01:10, 01:50, 1: 100, 1: 200, 1:1, 1: 500 000, ecc.) deve essere eseguita. Anticorpo primario ottimale concentrazione viene determinata attraverso analisi di intensità di fluorescenza contro densità di cluster. La concentrazione di primaria selezionata si verifica quando la densità di cluster altipiani con aumento delle concentrazioni di anticorpi primari prima di un ulteriore aumento nella densità di cluster a causa di anticorpi non specifici. L'anticorpo primario può essere diluito in media liberi del siero se eseguendo un esperimento di formazione immagine di corso di tempo.
  5. Al termine del tempo di incubazione desiderato, lavare le cellule con 300 µ l di PBS RT due volte.
  6. Bloccare il campione con 5% albumina di siero bovino (BSA) in PBS per almeno 2 ore a 4 ° C.
    Nota: Campioni fissati ordinariamente sono bloccati durante la notte (O/N) a 4 ° C.

3. incubazione dell'anticorpo secondario

  1. Preparare un brodo di µ g/mL 10 di fluorescente etichettati anticorpo secondario (per esempio Alexa Fluor 488 IgG) in PBS. 2 µ g/mL di Hoechst 33342 possono essere inclusi in questa diluizione per consentire l'individuazione del campione migliorato sul microscopio.
    Nota: Per gli esperimenti di time-lapse, PBS possono essere scambiati per supporti liberi del siero.
  2. Rimuovere 5% BSA/PBS dalle cellule e incubare con la soluzione di anticorpo secondario per 2 ore a 4 ° C, proteggendo i campioni dalla luce ambientale.
  3. Al termine del tempo di incubazione anticorpo secondario, lavare le cellule con 300 µ l di PBS (due volte) e conservare a 4 ° C, proteggere dalla luce ambientale.
  4. Per evitare l'evaporazione, avvolgere i bordi della diapositiva camera con parafilm.

4. microscopio confocale di campioni

Nota: Le impostazioni utilizzate per l'analisi confocale saranno diverso a seconda dell'attrezzatura e fluorofori utilizzati nell'esperimento individuo. Strumenti moderni confocale forniscono meccanismi per il salvataggio di tutti i parametri di imaging utilizzati nell'esperimento nel formato di file immagine nativa dello strumento. È importante che queste impostazioni sono registrate per fornire per la replica appropriata delle condizioni sperimentali attraverso diversi periodi di acquisizione dati.

  1. Durante la formazione immagine dei segnali fluorescenti, evitare sovra-saturazione. Utilizzare un'immagine cercare tabella che fornisce una rappresentazione di falsi colori di saturazione pixel e ridurre il guadagno di rivelatore e potere del laser di conseguenza. Più confocale strumenti includono un'opzione analoga o "gamma indicatore" impostazione del software di acquisizione per questo.
  2. Ridurre al minimo l'esposizione del fluoroforo di interesse per potere del laser. L'uso di una macchia di DNA-etichettatura come Hoechst 33342 fornisce un meccanismo semplice per rilevare e posizionare il campione nel campo visivo prima collezione.
  3. Eseguire le scansioni iniziale del campione a bassa risoluzione e se il software permette una veloce velocità di scansione. Ciò limiterà il photobleaching possibile del campione.
  4. Aumentare la risoluzione di cattura e rallentare la velocità di scansione quando si è pronti per raccogliere i dati di immagine.
  5. Se lo strumento confocale permette, raccogliere i dati utilizzando una modalità di conteggio di fotoni.
    Nota: Se non è disponibile sullo strumento conteggio del fotone: garantire livelli di grigio sono lineari durante l'acquisizione di immagini.
  6. Impostare il foro stenopeico per ogni linea di laser utilizzato per 1 unità arioso (AU).
  7. Uso linea o telaio in media durante l'acquisizione di immagini (x4) per ridurre il rivelatore associato rumore.
    Nota: In questa variante di ICS come solo un tempo-punto è stato catturato il tempo di acquisizione non è sperimentale fattore di limitazione.
  8. Per selezionare delle collezione immagine un alto ingrandimento, obiettivo di apertura numerica elevata, ad esempio un obiettivo piano-Apochromat, per fornire la massima risoluzione e la correzione per le aberrazioni cromatiche e sferiche (esempi includono piano-Apochromat 100x o 63 X /1.40 Obiettivi di olio).
  9. Sovracampionamento la dimensione dei pixel acquisito contenuti all'interno dell'immagine. Si raccomanda che ogni pixel cattura una regione di nm 50 x 50. Per efficace ICS, dimensione pixel deve essere inferiore a 0,1 x 0,1 µm2 al pixel. Ciò si ottiene tramite una combinazione di ingrandimento di eseguire la scansione di un'area relativamente piccola e selezionando un formato relativamente grande immagine (ad esempio 1024 x 1024 o 2048 x 2048 pixel).
  10. Concentrarsi sulla superficie apicale o basale della cellula ad una regione più piatta possibile. Più celle possono essere raccolti nelle regioni di interesse elaborato individualmente durante l'analisi di circuiti integrati e una sola immagine.
  11. Catturare una regione di sfondo gratis cellulare utilizzando le stesse impostazioni di strumento da utilizzare per la normalizzazione del campione.

5. calcolo di spettroscopia di correlazione di immagine

Nota: La piattaforma open-source imaging-elaborazione, Fiji, una distribuzione del programma ImageJ, è necessaria per eseguire l'autocorrelazione e funzioni matematiche essenziali a ICS. Questa distribuzione di ImageJ è raccomandata in quanto include numerosi plug-in pre-installati e un'architettura di aggiornamento più facile che può eseguire operazioni attraverso esperimenti di imaging multipli.

  1. Installare il programma di Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Caricare il set di dati acquisiti.
  3. Identificare l'area di superficie della membrana delle cellule basali o apicale di interesse e duplicato alle dimensioni in pixel di 2n (256x256, 128x128, 64 x 64). "Menù: immagine > Duplica..."
  4. Calcolare l'intensità media dell'area ritagliata di interesse "Menu: analizzare > misure."
  5. Identificare un'area di sfondo e duplicare alle stesse dimensioni in pixel della membrana di superficie delle cellule cattura (2n: 256x256, 128x128, 64 x 64). "Menù: immagine > Duplica..."
  6. Calcolare l'intensità media dello sfondo ritagliato l'area di interesse. "Menu: analizzare > misure."
  7. Sottrarre l'intensità media dello sfondo dell'immagine che contengono la regione di interesse. "Processo > calcolatore di immagine > sottrarre."
  8. Eseguire il calcolo di autocorrelazione. Questo calcolo è contenuto all'interno della struttura di Menu: "processo > ITF > FD matematica."
    1. Nella matematica FD di dialogo casella Selezionare: 1 immagine: nome immagine ritagliata, operazione come correlazione, immagine 2: nome immagine ritagliata, trasformazione inversa su.
  9. Normalizzare l'immagine risultante dividendo per il numero totale di pixel. "Menu: processo > Matematica > dividere..." (cioè: 64 x 64 pixel = 4096)
  10. Normalizzare nuovamente dividendo per l'intensità media del normalizzato al quadrato di superficie coltivata. "Menu: processo > Matematica > dividere..."
    Nota: Questo può essere raggiunto dividendo l'immagine per il valore di intensità media, due volte.
  11. Tracciare una linea attraverso la funzione di diffusione del punto.
  12. Tracciare il profilo di questa linea per calcolare il valore di picco. "Menu: analizzare > tracciare il profilo."
  13. Calcolare i grappoli per zona fascio trasferendo il valore di picco (risultato di 5.12) in un foglio di calcolo ed eseguire il seguente calcolo (Eq 6):
    Equation 7

6. elaborazione di DataSet ICS

Nota: La creazione di una macro di FIJI/ImageJ è consigliabile replicare le procedure descritte nel protocollo di cui sopra. Questo permette l'analisi rapida e coerenza di più file immagine durante l'analisi di spettroscopia di correlazione immagini.

  1. Stabilire un flusso di lavoro ICS macro mediante la registrazione di ogni comando di menu nel protocollo di condivisione connessione Internet
    "Menu: Plugins > macro > Record...".
  2. Selezionare "Crea" per generare Macro.
  3. Selezionare "lingua > IJ1 Macro."
  4. Salvare la Macro.
  5. Aggiungere finestre di dialogo ai vari passaggi della macro, fornendo i promemoria per gli operatori di ciascuna funzione. Finestre di dialogo anche servono come un metodo per mettere in pausa il processo di analisi per consentire selezioni appropriate da effettuarsi prima dell'ulteriore elaborazione (vale a dire, la regione di ritagliare)
    1. Finestra di dialogo casella Macro codice
      titolo = "Titolo finestra di dialogo";
      msg = "Messaggio di dialogo casella/protocollo passo";
      waitForUser (titolo, msg);
      Nota: Ulteriori efficienze possono essere stabilite mediante la sottoscrizione al sito di aggiornamento di BAR all'interno dell'Updater di Figi (istruzioni https://imagej.net/BAR). Ciò fornisce FIJI "una collezione di routine ampiamente applicabili" 14. Una tale routine è trovare picchi. Struttura del menu: "BAR > analisi dei dati > trovare vette." Questo script fornisce che un mezzo rapido di calcolo che il valore di picco nel profilo del punto di diffusa la funzione.

7. protocollo estensioni: Calcolo dell'Area del fascio del microscopio

Nota: La funzione di trasferimento ottico del microscopio assicura che gli oggetti anche di dimensioni molecolari vengono visualizzati come immagini con un raggio di circa 200-300 nm nel piano x-y. Il protocollo di condivisione connessione Internet permette di determinare la funzione di punto di diffusione eseguendo i passaggi 4-5 perline fluorescenti Sub-resolution. In particolare:

  1. Montare Sub-resolution (cioè < 100 nm di diametro) perline fluorescenti su un 8 camera imaging diapositiva.
  2. Perline di immagine secondo il protocollo descritto mediante microscopio confocale utilizzato per esperimenti di ICS.
  3. Calcolare la funzione Condivisione connessione Internet dall'immagine risultante secondo passaggi protocollo 5.1-5.13.
  4. Dal profilo tracciato, è possibile calcolare il raggio di raggio (r) come la larghezza piena a metà del valore massima della funzione Condivisione connessione Internet.
  5. Calcolare l'area di fascio (BA) come (Eq 7):Equation 8

8. protocollo estensioni: Calcolo dei cluster Per unità di superficie

  1. Calcolare la densità di cluster (CD) per unità di superficie come (Eq 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. Dividere i grappoli per zona fascio (risultato di 5.13) per l'area del fascio (risultato di 7,5).

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Representative Results

Un esperimento di spettroscopia di correlazione immagine di successo dipende dalla corretta applicazione dei controlli di trattamento. Questi gruppi di trattamento comprendono l'esame della fluorescenza in nessun anticorpo primario e i gruppi del trattamento nessun anticorpo secondario. Una volta che le impostazioni ottimali laser confocale sono stabilite per un esperimento, è necessario acquisire immagini di questi gruppi di controllo per confermare l'assenza di fluorescenza non specifici all'interno del campione. Per molte linee cellulari di cancro aderente, l'identificazione delle regioni adatte per condivisione connessione Internet è limitata dalla mancanza di superfici piane. Questo è compensato dalla capacità di catturare un ampio campo visivo delle cellule tumorali multiple in una singola immagine confocale. Questo fornisce la capacità di generare la campionatura necessaria per eseguire i confronti statistici tra gruppi di trattamento.

In questo esperimento rappresentativo, cellule di carcinoma epidermoide positivo A431 EGFR sono stati stimolati con 100ng/mL del ligando EGF per 10 min a temperatura ambiente per indurre EGFR clustering. Analisi ICS è stata eseguita su entrambi EGF stimolata (Figura 1A) e cellule non stimolate (Figura 1) dopo incubazione con l'EGFR targeting anticorpo monoclonale umanizzato, cetuximab. Successivamente, un raccolto di 64x64 pixel di una regione (riquadro giallo) contenuta all'interno della membrana delle cellule (Figura 1B e 1E) è stato elaborato utilizzando la funzione di autocorrelazione è stato contenuto nella piattaforma di elaborazione di immagini open source, FIJI. Questa immagine di autocorrelazione risultante è stata normalizzata sottraendo alla fluorescenza di fondo prima del dividendo per entrambi il quadrato dell'intensità media della regione normalizzata di interesse così come il quadrato del numero di pixel nell'area ritagliata ( Figura 1 e 1F). Lo strumento di riga di funzione è stato utilizzato per tracciare il profilo della funzione punto di diffusione di questa immagine (Figura 1 e 1 H). Il valore di picco di questi profili sono state recepite a un'applicazione di foglio di calcolo per ulteriore elaborazione dei dati. Una macro di FIJI è stata generata per replicare queste fasi di lavorazione di FIJI per un'elaborazione rapida di una serie di celle (n = 6) da entrambi i gruppi di trattamento seguito cetuximab immunocitochimica (Figura 1I). In questo esperimento, è stato identificato il recettore EGFR in 5,84 grappoli ± 0.85 per zona fascio sulla superficie di A431 cluster di cellule stimolate contro 14.94 ± 1,62 per superficie fascio nelle popolazioni di cellule non stimolate. Con il presupposto che le condizioni sperimentali utilizzate per questa analisi limite rapida del ricevitore di fatturato, la densità di cluster EGFR in cellule stimolate A431 diminuito 2.56-fold. Condizioni sono rispetto per lo stato di aggregazione della stessa molecola bersaglio in condizioni quando turn over molecola target è limitato, un minor numero di grappoli per zona fascio indica maggiore destinazione aggregazione. Seguito di aggregazione di EGFR di EGF ligando stimolazione aumenta 2.56-fold come previsto in questo sistema. La generazione di una macro di FIJI attenendosi alla procedura descritta in questo protocollo consente il confronto statistico di vari trattamenti o differenze ambientali e loro effetti sull'aggregazione del recettore.

Figure 1
Figura 1: spettroscopia di correlazione di immagine per rilevare fluorescente etichettati cluster sulla superficie delle cellule delle cellule tumorali aderente. Immagine di microscopia confocal di rappresentante EGF stimolata (A) o cellule non stimolate (D) aderente A431 carcinoma epidermoide etichettati con l'anticorpo primario di cetuximab recettore EGFR con Alex Fluor 488 secondario di targeting dell'anticorpo. Cellule stimolate sono state trattate con EGF di 100 ng/mL per 10 min a temperatura ambiente per indurre EGFR clustering prima della fissazione e immunocitochimica. Regioni di taglio contenente della membrana cellulare (riquadro giallo) con dimensioni di pixel (64 x 64 [2n]) sono state utilizzate per effettuare analisi ICS (B ed E). Dopo la normalizzazione della funzione di autocorrelazione nel FIJI/ImageJ, lo strumento linea (giallo) fu utilizzato per misurare la funzione di diffusione del punto (C e F) il profilo di questa funzione di linea viene tracciato per rilevare il valore di picco (G e H ). Stimolazione di EGF è stata osservata per indurre una 2.56-fold diminuzione rilevato EGFR grappoli per fascio zona 5,84 ±0.85 rispetto al 14,9 5±1.62 alle cellule non stimolate (n = 6) (I). Con il presupposto, le condizioni sperimentali utilizzate in questa analisi mantenuta un costante numero di recettori di membrana, ciò rappresenta un aumento nell'aggregazione di EGFR dopo stimolazione con EGF. Barre della scala = 10 µm (A e D); 1 µm (B-C ed E-F). Box Plot visualizzate utilizzando Tukey stile con i baffi che non più di 1,5 × intervallo interquartile (IQR) rappresentano valori massimi e minimi osservati. Grappoli per fascio zona ± errore Standard di dire (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La tecnica di spettroscopia di correlazione di immagine (ICS) che descriviamo in questo protocollo utilizza microscopi confocali standard senza la necessità di rilevatori specializzati. La tecnica ICS descritta utilizza metodi di immunocitochimica consolidata per fornire per il campionamento rapido di più condizioni di trattamento per l'analisi statistica aumentata. Questa metodologia fa con una leggera riduzione della precisione assoluta rispetto alle tecniche di singola molecola alternativo basato sulla correlazione delle fluttuazioni di fluorescenza di molecole mobile attraverso un volume confocale, quali la fluorescenza correlazione di spettroscopia (FCS)15. Il più sofisticato approccio FCS richiede anche fotoni di alta sensibilità conteggio GaAsP rivelatori insieme con software specializzato dedicato che non è normalmente disponibile su strumenti confocale standard o rivelatori come fotodiodo a valanga (APD). Un'analisi completa della precisione della ICS determinato questa tecnica possa misurare con precisione il numero di cluster dove > 1 particella è presente all'interno della macchia focale del fascio del laser scansione microscopio7.

La raccolta di immagini fluorescenti appropriate è di fondamentale importanza per una riuscita analisi ICS. La regione di interesse deve contenere un elevato rapporto segnale-sfondo fluorescenti con laser e ottenere l'intensità regolata per rimuovere qualsiasi saturazione del segnale. La regione cellulare catturata deve essere oversampling con una dimensione di pixel di circa 50 nm. Questa regione deve essere omogenea, con particolare attenzione pagato per evitare bordi cellulari o giunzioni che possono aumentare gli artefatti nel calcolo autocorrelazione. Una delle pecche principali di un approccio ICS è la sensibilità alle superfici cellulari eterogenee. Così, limitando la regione catturata per la massima superficie piatta, indipendentemente dalla forma di cella migliorerà la precisione di qualsiasi analisi ICS.

Multiple modalità di formazione immagine sono state esplorate per studiare l'aggregazione dei complessi recettoriali. Microscopia elettronica (EM) fornisce valutazione ad alta risoluzione spaziale di proteina clustering ma opera sotto vuoto estremamente elevata e non è applicabile agli studi che richiedono la risoluzione temporale. EM è ulteriormente limitato come la preparazione del campione duro è proibitivo per la vita del tessuto indagini5. Per superare le limitazioni inerenti ad alta risoluzione di microscopia confocale standard, trasferimento di energia per risonanza (FRET) può essere utilizzato per calcolare l'organizzazione spaziale delle strutture etichettati con sovrapposizione di coppie di fluorofori donatore e accettore16 . Nonostante la sua sensibilità, FRET non fornisce tuttavia informazioni per quanto riguarda le dimensioni degli aggregati sotto indagine6. Lo sviluppo di vari metodi di microscopia di fluorescenza super risoluzione offrono interessanti opportunità di risolvere oggetti cellulari non è possibili con risoluzione standard metodi confocale17,18. Le spese e le competenze necessarie di tali tecnologie e strumenti, limita la loro attuale disponibilità banale.

Con aumenti nella sensibilità e bassa foto-tossicità nella strumentazione confocale, spettroscopia di correlazione di immagine può essere espansa per esplorare i cambiamenti temporali di aggregazione del recettore in cellule viventi negli esperimenti di time-lapse. Questo può essere giustapposti con l'aumento della potenza laser usata per indurre deliberatamente foto imbianchimento dei singoli campioni con conseguente valutazione di ICS (pbICS) di prendere in giro a parte l'aggregazione di ordine superiore presente in alcuni recettori complessi9. Un ulteriore adattamento, spettroscopia di correlazione di immagine (ICCS) fornisce un'analisi della co-localizzazione di due proteine di membrana basata attraverso l'analisi di coppie di immagini per ogni proteina fluorescente contrassegnati19. La forza di questa metodologia di spettroscopia di correlazione immagine è che si avvale di tecniche ben consolidate nel settore e fornisce una pipeline di analisi liberamente disponibile per quantitativi gli eventi altamente dinamici che si verificano alla membrana delle cellule.

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Disclosures

Andrew M Scott ha supporto da AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono e Daiichi Sankyo Co di finanziamento della ricerca e ha una consulenza ed una proprietà di riserva del Life Science Pharmaceuticals. Gli autori non hanno altri rilevanti affiliazioni o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario in o finanziaria conflitto con l'argomento o materiali discussi nel manoscritto oltre a quelli resi noti.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono finanziamento da NHMRC (Fellowship 1084178 e borse di studio 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), Cancer Australia, Ludwig Cancer Research, John T Reid si fida, cura Brain Cancer Foundation, La Trobe University e l'agenzia del cancro di Victoria. Finanziamenti dal programma di supporto di infrastrutture operative fornite dal governo vittoriano, Australia è anche riconosciuto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

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References

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Biologia problema 138 microscopia confocale spettroscopia di correlazione di immagine (ICS) interazioni anticorpo: recettore anticorpo-farmaco-coniugato (ADC) imageJ Fiji image processing clustering aggregazione
Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine
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Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

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