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一种研究血栓素A2受体基因C924T多态性的方法

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DOI：

10.3791/57289

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2019年4月1日

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1SS Annunziata University Hospital, Unit of Clinical Molecular Biology and Predictive Medicine, University of Chieti, 2Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, University of Chieti, 3Department of Biotechnological and Applied Clinical Sciences, University of L'Aquila, 4CNR - Institute of Molecular Genetics, Section of Chieti

本文内容

摘要

在本研究中，我们描述了一种分析 C924T 基因型的方法。该方案包括三个步骤：DNA 提取、聚合酶链式反应（PCR）扩增，以及在琼脂糖凝胶上进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。

摘要

血栓素A2受体（TBXA2R）基因属于具有七个跨膜区域的G蛋白偶联受体超家族。该基因参与动脉粥样硬化的发生发展、缺血及心肌梗死过程。本文介绍一种对患者进行基因分型的方法，用于研究位于TBXA2受体基因3'区的C924T多态性（rs4523）在转录后水平的作用。该方法包括从全血中提取DNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增包含C924T突变位点的TBXA2基因片段，并利用限制性酶切分析——即在琼脂糖凝胶上进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析——来鉴定野生型和/或突变型基因型。此外，通过测序TBXA2R基因对结果进行了验证。该方法具有多项潜在优势，例如利用PCR和限制性内切酶分析可高效、快速地识别C924T多态性。通过分析患者TBXA2R C924T多态性的基因型，该方法可用于预测斑块形成及动脉粥样硬化进展。该方法的应用有望识别出更易发生动脉粥样血栓事件的个体，特别是高风险且接受阿司匹林治疗的人群。

引言

TBXA2R 属于具有七个跨膜区域的 G 蛋白偶联受体超家族，广泛表达并定位于细胞膜或细胞内结构上1,2。TBXA2R 信号通路参与了晚期动脉粥样硬化过程3。在动脉粥样硬化进展过程中，TBXA2 受体的表达水平升高，临床和实验研究显示其在缺血和心肌梗死中具有重要作用4。C924T 是 TBXA2R 基因的一个单核苷酸多态性（SNP），已被确认为健康志愿者中的功能性多态性，并与多种临床疾病相关5。此外，我们先前的研究6表明，TBXA2R 基因的 C924T 多态性影响转录本的稳定性；具体而言，与野生型（CC）相比，突变型（TT）转录本的不稳定性增加。另外，不同浓度的二磷酸腺苷（ADP）、肾上腺素和胶原等刺激物诱导的血小板聚集在突变型（TT）中效果较弱。这与血栓形成和止血功能的减弱一致。因此，TBXA2R 转录本的不稳定性及其相关的血小板聚集减少可能提示 TBXA2R TT 基因型在高危阿司匹林治疗患者中对动脉粥样血栓形成及其并发症具有保护作用6。

本文介绍一种用于患者基因分型的方法，旨在研究位于TBXA2受体基因3'区的C924T多态性（rs4523）在转录后水平的作用。该方法包括以下步骤：（1）从全血中提取DNA，（2）通过PCR扩增包含C924T突变位点的TBXA2R基因片段，（3）利用琼脂糖凝胶电泳结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析鉴定野生型和/或突变型基因型。RFLP技术基于同源DNA序列之间的差异7。该技术曾被用于检测DNA多态性，尤其是单核苷酸多态性（SNP），并探索遗传变异的生物学意义8。首次在人类中应用RFLP-PCR分析的多态性是ABO血型系统9。RFLP-PCR方法通过使用高度特异性的限制性内切酶消化DNA后，检测产生不同长度的DNA片段，从而实现对同源DNA序列中遗传突变的分析10。

近年来，利用PCR技术进行SNP分析的方法包括：短等位基因特异性寡核苷酸杂交11、等位基因特异性PCR12、DNA微阵列上的引物延伸13、寡核苷酸连接检测14、直接DNA测序以鉴定位点特异性单核苷酸多态性15、TaqMan法16、基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析17以及GeneChips技术18。这些技术操作复杂，且可能需要昂贵的仪器设备。相比之下，PCR-RFLP方法成本低廉、操作简便、使用方便、效率高，能够快速鉴定C924T多态性。此外，我们还通过Sanger测序法对TBXA2R基因进行测序，验证了实验结果15。

通过分析患者TBXA2R C924T多态性的基因型，该方法可对斑块形成及动脉粥样硬化进展进行预测性研究。该方法能够识别出更易发生动脉粥样血栓形成的人群，特别是那些属于高风险并接受阿司匹林治疗的患者。

方案

该方案遵循基耶蒂大学医学研究伦理委员会的指南。

1. 试剂配制

  1. 配制 Tris-EDTA (TE) 缓冲液 (pH 8.0)。在烧杯中加入 200 µL 的 0.5 M EDTA 和 1 mL 的 1 M Tris-Cl，用无菌水定容至 100 mL。TE 缓冲液终浓度：10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA。室温 (RT) 保存。
  2. 配制 1 L 的 10× 储存液电泳缓冲液 (TBE)。将 108 g Tris 碱、55 g 硼酸和 40 mL 的 0.5 M EDTA (pH 8) 溶解于烧杯中，用无菌水定容至 1 L。室温 (RT) 保存。
  3. 配制凝胶上样染料。将 0.25 g 溴酚蓝、0.25 g 二甲苯青 FF、50 g 甘油和 1 mM EDTA (pH 8) 溶于 60 mL 去离子水或蒸馏水中，再用无菌水定容至 100 mL。4 °C 保存（数月）或 -20 °C 保存（数年）。
  4. 配制 200 mL 的 2% 琼脂糖凝胶。新鲜使用，或 alternatively 将凝固后的凝胶在室温下保存数周。
    1. 在 600 mL 烧杯中，将 4 g 琼脂糖溶于 200 mL 的 1× TBE 缓冲液中。使用磁力搅拌器搅拌约 5 分钟，直至琼脂糖完全悬浮。
    2. 将 2% 琼脂糖溶液置于沸水浴或电热板上加热（约 10 分钟，直至琼脂糖完全溶解）。注意：盛有琼脂糖凝胶的烧杯必须用铝箔覆盖。或者，也可将未覆盖的烧杯在微波炉中高温加热约 3–5 分钟。
    3. 使用磁力搅拌器轻轻旋涡混合 2% 琼脂糖溶液，检查琼脂糖是否完全溶解。
      注意：在完全溶解前，未溶解的琼脂糖颗粒呈半透明颗粒状。必要时可重新加热数分钟（约 5–10 分钟）以溶解残留颗粒。
    4. 若使用储存的琼脂糖凝胶，将覆盖铝箔的烧杯置于约 60 °C 的热水浴中加热，直至琼脂糖完全溶解。在倾倒前，用巴斯德移液管移除表面残留的"微量"凝固琼脂糖。

2. DNA 纯化

  1. 开始纯化前，请执行以下步骤：
    1. 使用人新鲜全血样本，或将冷冻的全血样本在37 °C水浴中快速解冻（约2–3分钟），同时轻轻振荡，然后在使用前平衡至室温。
    2. 通过反复倒置试管数次，充分混匀新鲜或解冻后的血液样本。
  2. 按照试剂供应商提供的操作说明，以100 µL洗脱体积开始纯化程序。
  3. 通过测定260 nm、280 nm和320 nm处的吸光度，定量并计算DNA纯度。
    1. 使用无菌水稀释样本，并用于分光光度计的校准。
    2. 应用以下公式计算DNA样本浓度 = 50 µg/mL × (A260 − A320) × 稀释倍数，以及DNA纯度 = (A260 − A320)/(A280 − A320)，其中纯度比值在1.7至1.9之间为可接受范围。

3. DNA 样本的 PCR 扩增

  1. 在0.2 mL的微量扩增管中配制25 µL反应混合液，如表1所示。
  2. 使用自动热循环仪对纯化的DNA样品进行PCR扩增，扩增程序见表2。
  3. PCR扩增结束后，将DNA样品置于4 °C以终止PCR反应。

4. PCR 产物的限制性片段长度多态性分析

  1. 为每个样本配制 22.5 µL 的酶切反应主混合液，使所选限制性内切酶能够消化 PCR 产物，如 表 3 所示。
  2. 使用移液器和带滤芯吸头，将每个样本的 2.5 µL PCR 产物转移至新的 PCR 管中。
  3. 使用移液器和带滤芯吸头，向含有各样本 PCR 产物的 PCR 管中加入 22.5 µL 酶切反应主混合液。
  4. 将反应混合物（主混合液和 PCR 产物）在 37 °C 下孵育 4 小时。

5. PCR-RFLP 样品的凝胶电泳分析

  1. 将溴化乙锭（EtBr）以 0.5 µg/mL 的终浓度加入琼脂糖凝胶中，染色 10 分钟。EtBr 可结合 DNA，在紫外光（UV）下可被观察到。
    注意：操作、储存和处理 EtBr 时必须佩戴手套及其他防护设备，因为 EtBr 是一种具有潜在致癌性的诱变剂。
  2. 将制备好的琼脂糖凝胶倒入带有加样孔梳子的凝胶托盘中，静置至完全凝固。
  3. 将凝固后的琼脂糖凝胶放入电泳槽（电泳装置）中。
  4. 向电泳槽中加入 1× TBE 缓冲液，直至完全浸没凝胶。
  5. 使用移液器和滤芯吸头，将 6 µL 扩增后的消化 DNA 样品（具体为每份样品 5 µL 加 1 µL 凝胶上样染料）加入琼脂糖凝胶的加样孔中。另设一个独立加样孔，平行加入 DNA 分子量标记物。
  6. 在 100 V 条件下电泳运行 20–30 分钟。
  7. 使用紫外透射仪观察被切割的 DNA 片段或未被消化的 PCR 产物，通过与 DNA 分子量标记物比较片段大小，并按照制造商说明进行拍照记录结果。
    注意：在紫外光源周围操作时应使用防护设备（如护目镜或面罩）。

结果

本方法的目的是评估血栓素A2受体基因在C924T多态性位点的基因型。人类TBXA2R基因位于19p13.3，跨度为15 kbp，由两个内含子分隔的三个外显子组成。使用如图1所示的PCR引物扩增TBXA2R基因（539 bp）的C924T多态性区域，这些引物经过精心设计，可特异性扩增目标DNA区域，而不会扩增同源或旁系同源的非特异性区域。此外，对PCR产物进行RFLP分析，使用RsaI限制性内切酶（图1）消化，并在琼脂糖凝胶上观察结果，以鉴定所研究的特异性SNP。

根据DNA消化后产生不同长度的片段，可以区分患者在C924T多态性位点的基因型。实际上，如图2所示，主要等位基因纯合子（CC）显示两条条带（395和144 bp），因为限制性内切酶在TBXA2R基因的C924T多态性位点精确切割。次要等位基因纯合子（TT）表现为单一条带（539 bp），因为该位点未发生限制性内切酶切割。杂合子（CT）等位基因则显示三条条带（539、395和144 bp）。如图2所示，通过PCR产物的RsaI酶切所确定的C924T多态性，已通过测序分析得到证实。

组分体积 (µL)终浓度
10x PCR 缓冲液 Tween-20 (15 M MgCl2)0.251.5 MgCl2 mmol/L
dNTP 混合液 (10 mM)1200 µM
引物（正向）(10 pmol/µM)10.4 µM/µL
引物（反向）(10 pmol/µM)10.4 µM/µL
Taq 聚合酶 (5 U/µL)0.21 U/µL
样品 DNA (42 ng/µL)142 ng/µL
无 DNase 水20.55
总量25

表1： PCR扩增体系设置。 在0.2 mL PCR管中配制25 µL预混反应体系，用于扩增单个DNA样本。

标准PCR
初始激活步骤5 min95 °C
三步循环
变性30 s94 °C
退火60 s55 °C
延伸60 s72 °C
循环次数30 cycles
最终延伸8 min72 °C

表2：PCR扩增程序。使用自动热循环仪进行PCR，以扩增模板DNA。PCR反应通过在4 °C冷却终止。

组分体积 (µL) (n = 1)体积 (µL) (n = 10)*
10x 酶缓冲液2.527.5
限制性内切酶 (5 U/µL)0.55.5
无DNA酶水19.5214.5
总量22.5247.5

表3： PCR产物的限制性酶切。配制预混液，使所选限制性内切酶能够消化PCR产物。*：为10个样本配制预混液时，需多加10%，最终按11个样本的量配制。

figure-results-1
图1：PCR引物与RsaI限制性内切酶。 设计用于扩增包含C924T多态性的539 bp TBXA2R基因片段的上下游引物。RsaI为选择用于识别GTAC位点的限制性内切酶。˅：RsaI酶的切割位点。C(/T)：C924T多态性。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：电泳图谱与DNA序列分析。（A）C924T基因型通过RsaI特异性酶切后的RFLP图谱进行鉴定。（B）DNA序列分析：采用测序分析验证了RsaI限制性内切酶消化后所得的RFLP结果，证实存在C924T多态性。该图经修改自De Iuliis et al.，Prostaglandins & Other Lipid Mediators6。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在本研究中，我们描述了一种方法，可用于对患者进行基因分型，以研究位于TBXA2R基因3'区的C924T多态性（rs4523）在转录后水平的作用。首先，该方法依赖于从全血中提取DNA。具体而言，此第一步过程包括从新鲜或冷冻的全血样本中纯化总人源DNA（包括基因组DNA和线粒体DNA），这些血液样本需经EDTA（或柠檬酸盐或肝素）抗凝处理。对于全血样本的短期保存，可在2-8 °C下保存最多10天；若保存时间超过10天，则应将样本储存在-70 °C。自动化纯化过程包括四个步骤：裂解、结合、洗涤和洗脱。其次，该方法通过PCR扩增包含C924T突变位点的TBXA2R基因片段。最后，利用限制性酶切分析（RFLP）在琼脂糖凝胶上鉴定野生型和/或突变型基因型。

该方案中的关键步骤如下：（i）若使用室温保存的部分琼脂糖凝胶，可在倒胶前通过沸水浴（60 °C 下约 15–20 分钟）或微波炉（3–5 分钟）重新溶解已凝固的琼脂糖。注意：用瓶子重新熔化琼脂糖时应松开瓶盖。（ii）此外，再次加热琼脂糖时，蒸发会导致其浓度升高。因此，可通过加入少量水进行补偿。（iii）小于 1,000 bp 的 DNA 片段可通过琼脂糖凝胶进行区分，建议使用 TBE 缓冲液以获得最佳分离效果。（iv）我们倾向于使用琼脂糖凝胶而非聚丙烯酰胺凝胶，因为后者的制备更为困难，且需要更长的凝固时间。（v）凝胶电泳运行时间的选择取决于预期扩增产物的大小。根据本方案，由于 PCR 片段大小在 100–500 bp 范围内，因此在 2% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 20–30 分钟已足够。（vi）必须获得从人源样本中提取的 10 至 50 ng 高质量模板 DNA。为此，我们更倾向于使用全自动 DNA 纯化方法，而非半自动或手动方法。（vii）配制用于 PCR 扩增的主混合反应液和用于 PCR 产物消化的主混合溶液时，应将计算所得的单个 DNA 样本所需体积乘以样本数量，再额外增加 10%（以补偿移液过程中的液体损耗）。

该方法最常见的缺陷是由于热循环仪程序设置错误、扩增主混合物配制不当或DNA模板污染，导致出现额外的扩增产物。此外，PCR产物的缺失可能源于失活的Taq 聚合酶或热循环仪运行错误。另外，出现非预期的片段可能是由于PCR产物污染，或限制性内切酶消化不完全所致，后者可能由酶失活、限制性内切酶用量过少或孵育时间过短引起。

近年来，利用PCR技术进行SNP分析的方法包括：短等位基因特异性寡核苷酸杂交11、等位基因特异性PCR12、DNA微阵列上的引物延伸13、寡核苷酸连接检测14、直接DNA测序以鉴定位点特异性单核苷酸多态性15、Taqman法16、基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析17以及GeneChips技术18。这些方法并不理想，因为它们操作复杂和/或需要昂贵的设备。相比之下，本研究中描述的PCR-RFLP方法成本低、操作简便、使用方便、效率高，并可快速鉴定C924T多态性。该方法的局限性在于，每次实验仅适用于少量SNP及少量样本。

在未来应用中，该方法可通过分析患者TBXA2R C924T多态性的基因型，用于预测斑块形成及动脉粥样硬化进展的研究。此外，该方法可识别出更易发生动脉粥样硬化性血栓事件的个体，特别是接受阿司匹林治疗的高危患者。最后，该方法还可用于研究与特定药物（例如抗凝药和抗癫痫药）个体化治疗相关的其他多态性，以在开始治疗前明确每位患者的合适药物剂量及其个体化的药理学和临床反应，从而避免不良反应的发生。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目部分资金由意大利大学部向 S.M. 和 E.T. 提供的 60% 阿滕尼奥资助（Ateneo grants）支持。此外，本研究的经费还部分来自基耶蒂大学医学、口腔与生物技术科学系 "G. d'Annunzio" 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QIAsymphony SPQIAGEN937055
分光光度计EPPENDORF6131-02222
紫外透射仪UVP732-110
PCR管EPPENDORFH0030121589
PCR扩增仪EPPENDORF5331-03721
移液器及滤芯吸头EPPENDORFH4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
水平微型凝胶电泳装置DIATECH PHORESIS 10RI002-10
干式恒温加热器TWIN INCUBATORDG210
QIAsymphony DNA Midi试剂盒QIAGEN931255
10x PCR缓冲液（通常由Taq DNA聚合酶生产商提供）DIATECH AND TAKARAT0100 AND R0001DM
Taq DNA聚合酶TAKARAR0001DM
dNTP混合物DIATECH  pharmacogeneticsNM001dNTP MIX 10x 100 微升，10 mM
PCR引物DIATECH  pharmacogenetics\\
限制性内切酶RsaINew England biolabsR0167L
限制性内切酶10x缓冲液New England biolabsR0167L
琼脂糖SigmaA9539DNA片段在TBE缓冲液中分离效果最佳
Tris碱SigmaT6066
硼酸SigmaB7901
0.5 M EDTA，pH 8.0SigmaE7889
10%（质量/体积）过硫酸铵SigmaE3678每次使用前新鲜配制
溴化乙锭（EtBr，0.5 μg/μL）SigmaE8751
溴酚蓝SigmaB0126
二甲苯青FFSigmaX4126
甘油SigmaG5516
DNA分子量标记物DIATECH  pharmacogeneticsR1002-10质粒pBluescript II SK (+) 经MSPI酶切
无菌水（经高压灭菌）DIATECH  pharmacogenetics\\

参考文献

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标签

DNA PCR RFLP

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