Summary
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar y calificar cada especie de esfingomielina mediante monitoreo de reacción múltiple y modo MS/MS/MS, respectivamente.
Abstract
Se presenta un método de analizar la esfingomielina (SM) cualitativamente y cuantitativamente por cromatografía líquido-electrospray ionización-tandem espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS). SM es un sphingolipid común compuesto por una Fosforilcolina y una ceramida como la componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Un número de especies de SM está presente en células de mamífero debido a una variedad en el esfingoide larga cadena base (LCB) y un N-molécula de acil en la ceramida. En este informe, se muestra un método para estimar la cantidad de carbono y de dobles enlaces en un LCB y un N-molécula de acil basado en sus correspondientes iones producto de experimentos de MS/MS/MS (MS3). Además, se presenta un método de análisis cuantitativo de SM utilizando dos estable isotópicamente etiquetada SM especies, lo que facilita determinar el rango utilizado en la cuantificación de SM. El presente método será útil en la caracterización de una variedad de especies de SM en muestras biológicas y productos industriales tales como cosméticos.
Introduction
Esfingomielina (SM) es un sphingolipid comun en células de mamíferos. SM es sintetizada intracelularmente1 y presente como un precursor para otros esfingolípidos como un esfingosina-1-fosfato y una ceramida, que tienen papeles cruciales en inmune celular trata y homeostasis de la barrera, respectivamente2, de la piel 3. Así, el análisis preciso del metabolismo del SM es importante dilucidar las funciones fisiológicas y patológicas de los ESFINGOLIPIDOS.
SM se compone de una ceramida y una Fosforilcolina vinculado con el grupo 1-hidroxilo de la ceramida, que se compone además de una esfingosina y un N-molécula de acil. Una variedad en los números de carbono y doble enlace en la esfingosina y la N-molécula de acil da lugar a la especie número de ceramida (y SM). Los avances recientes en LC-ESI-MS/MS ha permitido análisis cuantitativo y cualitativo de la SM4,5. En el análisis cualitativo, el número de carbono y de dobles enlaces de un esfingoide LCB de SM fue identificadas mediante la asignación de espectros de iones producto de LCB. Sin embargo, la información estructural de la N-molécula de acil directamente no se obtuvo porque no se han divulgado sus correspondientes iones producto y por lo tanto N-grupos acilo se dedujeron por análisis diferencial entre los iones precursores y iones del producto correspondiente a LCB en ambos iones positivos y negativos modos4,5. En este informe, presentamos un método para detectar los iones producto de LCB y N-molécula de acil simultáneamente en MS3 modo de triple cuadrupolo y espectrometría de masas de trampa iónica lineal cuadrupolo, que facilita la precisión estructural especulación de cada especie de SM6.
Los efectos de la supresión (o mejora) de ion causados por la matriz en muestras biológicas dificultan la exacta cuantificación en el análisis por LC-ESI-MS, y por lo tanto, es deseable para construir curvas de calibración para todos los analitos de interés en la matriz idéntica de la muestra biológica. Sin embargo, esta estrategia no es factible porque es casi imposible preparar todas las especies de SM en muestras biológicas, especialmente en análisis completo. Por lo tanto, es práctico construir una curva de calibración y determinar el rango cuantitativo mediante una especie de SM representante de tacon en las muestras biológicas. Utilizamos dos especies de SM isotópicamente etiquetados para la construcción de una curva de calibración; uno fue utilizado para el estándar interno y el otro de un compuesto estándar. Se detectó una pequeña cantidad de especie SM isotópicamente etiquetada como un compuesto estándar tacon en muestras biológicas y obtuvo con éxito una curva de calibración y la gama cuantitativa6.
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Protocol
Consultar todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Guantes para minimizar la contaminación de las muestras por SM derivados de la piel. El presente Protocolo se aplicó a las células HeLa cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina y estreptomicina 100 mg/L.
1. preparación de las muestras de lípidos
Nota: Es importante que toda la cristalería incluyendo tubos de ensayo con tapones de rosca forrado de teflón libre de detergente.
- Extracción de la fracción lipídica total de homogeneizado celular utilizando el método de Bligh & Dyer7
- Eliminar la cultura (o condicionado) medios de comunicación de la placa de cultivo de tejidos de 10 cm y enjuague dos veces con 6 mL de PBS helado.
- Agregar 1 mL de PBS helado P1000 pipeta en el recipiente de cultivo de tejidos de 10 cm. Las células de la cosecha con raspadores de células y recoger en tubos de plástico siliconados de 2,0 mL.
- Después de la centrifugación (1.000 x g, 5 min, 4 ° C), retire el sobrenadante con una pipeta P1000.
- Añadir 1 mL de metanol. Mezclar los tubos brevemente y someter a ultrasonidos en 200 W por 5 min en un sonicador de baño tipo.
Nota: Ajuste el nivel del agua en un sonicador de baño tipo para que el precipitado de células eficientemente está homogeneizado. - Transferir el homogeneizado celular en metanol con una pipeta en tubos de ensayo (13 x 100 mm) con tapones de rosca forrado de teflón.
- Añadir 1 mL de metanol, 1 mL de cloroformo, 0,8 mL de agua bidestilada y 50 μl de 10 μmol/L de d18:1 estándar interno /(D31)-16:0 SM en cada tubo de ensayo.
- Tubos de ensayo Vortex vigorosamente durante 5 min a temperatura ambiente.
Nota: en este punto, una sola fase (Cloroformo/metanol/agua = 1/2/0.8 (v/v/v)) se forma. - Añadir 1 mL de cloroformo y 1,0 mL de agua bidestilada.
- Tubos Vortex vigorosamente a 2,500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Nota: en este punto, la acuosa (superior) fase y fase orgánica (la inferior) está separada. - Después de la centrifugación (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), recoger y transferir la fase inferior en tubos de vidrio desechables (fase inferior).
Nota: Recoge la fase más baja utilizando una pipeta Pasteur y un filtro de pipetas de seguridad. Inserte la punta de la pipeta en la fase inferior, apriete el bulbo pequeño al lado de la válvula 'E' para entregar la fase superior y la interfacial pelusa dentro de la punta de la pipeta y luego succionar la fase inferior en la pipeta. - Añadir 2 mL de cloroformo en los tubos de ensayo y vórtice los tubos vigorosamente a 2,500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente para mezclar con la fase superior y pelusa interfacial suficientemente.
- Después de la centrifugación (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), recoger y transferir la fase inferior modificada en los tubos de vidrio desechables con la fase inferior inicial como se describe en el paso 1.1.10.
- Colocar los tubos de vidrio con un chorro de nitrógeno y eliminar por completo los solventes orgánicos en la fase inferior recogida.
- Reconstituya las muestras con 500 μl de metanol o etanol, líquido filtrado con un filtro de 0,02 μm y almacenar en frascos de cristal a-20 ° C.
- Preparación de muestras para construir la curva de calibración y validación del método
- Añadir 50 μl de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 o 50 μmol/L del compuesto estándar (d18:1 /(D9) 18:1 SM) en tubos de ensayo con tapones de rosca forrado de teflón.
- Homogeneizado de células en cada tubo de ensayo y añadir metanol a 1 mL.
Nota: La cantidad de homogeneizado celular como matriz varía según cada experimento. Si habitualmente se analizan las especies SM en muestras procedentes de las células en una placa de cultivo de 10 cm, la cantidad de homogeneizado celular en cada tubo de ensayo debe ser cercano de las células en una placa de cultivo de 10 cm. - Extracto de la fracción lipídica total como se describe en pasos 1.1.6-1.1.14.
- Preparar control de calidad (QC) muestras para validar el método ya descrito en pasos 1.2.1-1.2.3. Preparar tres muestras de control de calidad con diferentes concentraciones del compuesto estándar (d18:1 /(D9) 18:1 SM): en un plazo de 3 x el límite inferior de la curva estándar (control de calidad-baja, control de calidad-L), uno cerca del centro (centro de control de calidad, control de calidad-M) y uno cerca del límite superior de la curva estándar (control de calidad-alto, control de calidad-H).
2. SM análisis por LC-ESI-MS/MS
- Preparación de la fase móvil
- Mezclar los disolventes (metanol/acetonitrilo/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) para la fase acuosa y el isopropanol para la fase orgánica) en botellas con tapones de rosca forrado de teflón de cristal y someter a ultrasonidos durante 5 minutos en un sonicador de baño tipo.
- Añadir ácido fórmico (concentración final 26,4 mmol/L) y NH4OH (14.9 mmol/L) en cada fase móvil.
- Análisis cualitativo de SM por LC-ESI-MS3
- Activar el sistema de cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento, poner tubos de entrada en las botellas de vidrio que contienen fases móviles y purgar la linea HPLC. Enlazar una columna HPLC de18 C (1,5 mm diámetro interior x 100 mm de longitud, partícula tamaño 3.0 μm) con el sistema HPLC, mantener la temperatura en el horno de la columna a 50 ° C y la columna con la fase móvil acuosa en 100 μl/min poner las muestras en una gradilla de muestras en el autosampl de la condición ER.
- Configure los parámetros de la triple cuadrupolo quadrupole sistema de espectrometría de masas de trampa iónica lineal para MS3 análisis indicados en la tabla 1 y tabla 2 , así como el precursor de la primero y la segundo los iones de la especie SM de interés.
- Haga doble clic en el icono del software de adquisición de datos, haga doble clic en la configuración de' Hardware', seleccione 'LC + QTRAP4500 + válvula' y haga clic en 'Activar perfil'.
- Crear una nueva subcarpeta haciendo clic en 'Nuevo subproyecto' y 'OK'.
- Haga clic en la pestaña 'archivo', seleccione 'Nuevo' y seleccione 'Método de adquisición' y 'OK'. Haga clic en el icono de 'Masa espec' y 'MS' ficha seleccione escanear tipo como 'MS/MS/MS (MS3)', tasa de lectura como 10.000 Da/s polaridad como 'Negativos' y 'Duración' como todo tiempo para ser analizado (min). Establecer la m/z de la 'Parada (Da)' y 'Start (Da)' como la gama que se analizarán. Establecer la m/z de los iones precursores 1 º y 2 º del objetivo especies de SM de interés.
Nota: Para analizar múltiples especies de SM, destacan la '-MS3' icono, click derecho, seleccione 'Copiar este experimento' y luego poner la m/z de los iones precursores 1 y 2 de otras especies de SM. - Seleccione la ficha 'MS avanzado' y establecer cada parámetro como se indica a continuación: modo de escaneo como 'Perfil', el tamaño de paso como 0.12 (Da), resolución Q1 y Q3 'Unidad' y 'Iluminada', respectivamente, umbral de intensidad como 0, tiempo de fraguado como 50 (ms), pausa entre rangos de masa como 1,5 ms, seleccione ' dinámica completar ', barrera de entrada Q3 como 8 V y el tiempo de excitación como 25 ms.
- Haga clic en el botón 'Editar parámetros' en la pestaña de 'MS' y seleccione la 'fuente Gas' ficha configurar los parámetros de la cortina gas, colisión, ionspray voltaje, temperatura, iones fuente gas1 y gas2 como se indica en la tabla 1. Luego seleccione la ficha 'Compuesto' configure los parámetros del potencial desclusterización, potencial de entrada, energía de la colisión, energía de la excitación y energía de la colisión separado como se indica en la tabla 2.
- Destacar 'Integrado Valco Valve' y seleccionar 'Nombre de la posición de paso 0' como A y 'B' como posición total 5,0 min de tiempo. También establecer 'A' como posición total tiempo min 70,0.
- Destacar el 'Sistema de Shimadzu LC'. Seleccione la ficha 'Bomba' y programar el modo de bombeo como flujo binario, flujo total 0,28 mL/min, como máximo de límites de presión como 20,0 MPa. Seleccione la ficha 'Automático' y ajuste el volumen de enjuague como 200 μL, carrera 52 mm, enjuague velocidad 35 μl/s, velocidad de 5.0 μL/s de muestreo de la aguja, purga tiempo 25,0 min., enjuague inmersión tiempo como 5 s y el modo de enjuague como 'Antes y después de la aspiración'.
- Además, permite la unidad, la temperatura más fría 4 ° c y el movimiento de la aguja de control vial como 52 mm. Seleccione la ficha 'Horno', activar el horno fijar la temperatura del horno y temperatura máxima 50 ° C y 85 ° C, respectivamente.
- Seleccione la ficha 'Controlador' y marque la casilla 'Encendido'. Seleccione la ficha 'Programa' y establecer así los gradientes de solventes: solventes A / B en una proporción de 100/0 por 5 min, programa lineales alteraciones a 80/20 durante 4 min, 35/65 sobre 50 minutos, 25/75 y más 1 minuto luego , mantener durante 10 minutos, luego linealmente a 100/0 de 25/75 sobre 4 minutos. Guarde el método.
- Crear el archivo por lotes
- Haga doble clic en el icono de 'Construir la adquisición lote', haga clic en 'Añadir Set', ' Añadir ', establecer el número de muestras nuevas y haga clic en 'Aceptar'.
- Haga clic en el botón ' método Editor' y seleccione el método que se utilizará. Si se utilizan múltiples métodos en un archivo por lotes, seleccione la casilla de 'Uso múltiples métodos' y seleccione el método de adquisición para cada muestra. Cambiar el nombre de 'Nombre' de la muestra, el número apropiado para' frasco', poner y la cantidad de volumen de inyección. Guarde el archivo por lotes.
- Obtener el producto de3 MS espectros de iones de las especies de SM de interés por el análisis por LC-ESI-MS3
- Seleccione la opción de 'Enviar' en el archivo por lotes, resaltar la línea de las muestras a analizar y haga clic en el botón 'Enviar'.
- Haga clic en la '' vista Quene', icono 'Equilibrado', seleccione el método de adquisición a utilizar, establecer tiempo como 1 min y haga clic en 'Aceptar'.
- Desactivar 'Instrumento de reserva para Tuning' haciendo clic en el icono correspondiente. Luego ejecutar secuencia de lote haciendo clic en el icono de 'Sample Start'.
- Asignar a cada MS3 espectros de iones producto de la SM comparando la masa para cargar cociente (m/z) del producto espectros de iones y la masa exacta del esfingoide LCB y N-molécula de acil de interés. Determinar el número de carbonos y dobles enlaces en el esfingoide LCB y N-molécula de acil según los iones del producto correspondiente.
- Confirme que está seleccionada la carpeta correspondiente sub-proyecto, haga doble clic en el icono 'Abrir el archivo de datos' y seleccionar las muestras a analizar. Arrastrar el pico en el cromatograma de cada destino especies de SM y haz luego doble clic. Se presentarán los obtenidos MS3 producto ion espectros dentro de la zona arrastrada.
- Análisis cuantitativo de la SM por LC-ESI-MS/MS
- Establecer las fases móvil y columna HPLC como se describe en el paso 2.1 y 2.2.1.
- Configure los parámetros de la triple cuadrupolo quadrupole sistema de espectrometría de masas de trampa iónica lineal de reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) que se enumeran en la tabla 1 y tabla 2.
- Realizar los procedimientos como se describe en paso 2.2.2.1 2.2.2.2.
- Haga clic en la pestaña 'archivo', seleccione 'Nuevo' y seleccione 'Método de adquisición' y 'OK'. Haga clic en el icono de 'Masa espec' y 'MS' ficha seleccione escanear tipo como 'MRM', polaridad como 'Positivo'. Establecer 'Duración' como todo el tiempo a analizar. Configurar el m/z de [M + H]+ y 184 'Q1 masa (Da)' como 'Q3 masa (Da)' del objetivo especies de SM de interés, respectivamente. Establecer 'Time' como 'ID' como el nombre del destino especies SM 10 ms.
- Seleccione la ficha 'MS avanzado' y ajustar cada parámetro como sigue: de la resolución Q1 y Q3 como 'Unidad', el umbral de intensidad 0, tiempo de fraguado como 0 (ms) y pausa entre rangos de masa como ms 5.
- Haga clic en el botón 'Editar parámetros' en la pestaña de 'MS' y seleccione la ficha 'Fuente Gas' poner el parámetro de cortina gas, colisión, ionspray voltaje, temperatura, iones fuente gas1 y gas2 como se indica en la tabla 1. Continuación, seleccione la ficha 'Compuesto' poner los parámetros de desclusterización potencial, potencial de entrada, energía de la colisión y colisión célula salida potencial como se indica en la tabla 2.
- Coloque la válvula como se describe en el paso 2.2.2.6.
- Establezca la condición de la LC como se describe en el paso 2.2.2.7. Guarde el método.
- Crear el archivo por lotes como se describe en el paso 2.2.3.
- Obtener los datos MRM de cada especie SM LC-ESI-MS/MS de análisis como se describe en el paso 2.2.4.
- Los datos de MRM usando el software para integración de datos y obtener los datos de área de pico para el cromatograma de iones extraídos de cada especie de SM.
- Haga doble clic en el icono del software para integración de datos en análisis cuantitativo, haga clic en la pestaña de 'Edición' y selecciona usuario integración por defecto. Establecer ancho liso Gaussiano como 1,0 punto y haga clic en 'Aceptar'. Haga clic en la pestaña de 'Edición' y seleccione 'Nueva tabla de resultados'. Seleccionar la muestra a ser integrado, haga clic en un botón de la flecha y haga clic en 'Siguiente'. Seleccione 'Crear nuevo método' establecer el nombre del método y haga clic en 'Siguiente'. Haga clic en 'Siguiente' y marque la casilla de d18:1 /(D31) 16:0 SM tal como está, haga clic en 'Siguiente' y haga clic en 'Finalizar'.
- Haga clic en 'Muestra la revisión de pico' y confirmar que los picos del cromatograma se reconocen apropiadamente. Cabe señalar que el tiempo de retención de d18:1 /(D31)-16:0 SM es generalmente menor en ~ 0,3 min en comparación con el de la SM de 34-1 (generalmente se compone de d18:1 / 16:0 SM).
- Cuantificar cada especie SM según la relación del pico de cada especie de SM a la d18:1 /(D31) 16:0 estándar interno de SM.
- Haga clic en la pestaña 'Archivo', seleccione 'Exportar', seleccione 'Tabla de resultados', confirmar el formato como 'MultiQuant', columnas como exportación de todas las columnas, filas como 'Exportar todos los registros excepto los explícitamente ocultos' y haga clic en 'OK'.
- Abra el archivo exportado en el software Excel. Normalizar la zona del objetivo especies de SM por la zona de es (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Luego multiplique por la cantidad teórica del es de la muestra inyectada para calcular la cantidad de objetivo especies de SM en la muestra inyectada.
- Construir la curva estándar
- Obtener los datos MRM de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM en las muestras para la construcción de la curva estándar por LC-ESI-MS/MS de análisis como se describe en el paso 2.3.1-2.3.4.
- Obtener los datos de la zona del pico de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM como se describe en el paso 2.3.5.
- Calcular la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada como se describe en paso 2.3.6.
- Construir la línea de tendencia estableciendo el eje x y eje y como la cantidad nominal y la cantidad calculada de d18:1 /(D9)-18:1 SM y obtener la fórmula de la línea de tendencia.
- Validar el método cuantitativo utilizando el software Excel
- Para la validación del método, cuantificar la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM en el control de calidad de muestras mediante el análisis de cada control de calidad de la muestra por lo menos tres veces en un día y repetir al menos 3 días, como se describe en paso 2.3.1-2.3.4.
- Obtener los datos de área de pico y calcular la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada como se describe en paso 2.3.5 y 2.3.6.
- Según la curva de calibración obtenida, calcule la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada.
- Evaluación de la precisión
- Calcular la media y la desviación estándar de la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtenida en el paso 2.5.3 en el dataset del intra-día y el día utilizando el software de Excel.
- La media obtenida en el paso 2.5.4.1 es dividida por la desviación estándar y expresada en %.
- Evaluación de la exactitud
- Calcular la exactitud de cada datos como sigue:
[(Calculado importe obtenido en el paso 2.5.3.) / (Cantidad nominal) - 1] × 100(%) - Calcule el promedio del valor absoluto de la precisión en el conjunto de datos del intra-día y entre días.
- Calcular la exactitud de cada datos como sigue:
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Representative Results
Químicamente sintetizados d18:1 / SM (figura 1A) y d18:1 24:0 / 24:0 SM en las muestras de lípidos extraídas de las células HeLa (figura 1B) se analizaron por LC-ESI-MS empleando a3 [M + HCOO]– y [M-CH3]- como iones del precursor de la primera y segunda, respectivamente. Tenga en cuenta que la intensidad del espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) es mayor que la de la SM N-molécula de acil (m/z 378). Además, el espectro correspondiente a [M-colina-CH3 (esfingosina-1-fosfato)]– también es útil para asignar la LCB de la SM. También confirmamos que el espectro de lo SPC de desmetilado (m/z 449) se produce principalmente de d18:1 SPC bajo la condición de nuestro análisis de3 MS (figura 1C).
La curva de calibración utilizando dos isotópicamente etiquetada SM especies se muestra en la figura 2A. La línea de tendencia se obtuvo mediante la aplicación de 1 / x2como el factor de ponderación. El resultado del análisis residual fue mostrado en la figura 2B. Observe que el valor residual cerca del límite inferior de cuantificación (0.1 pmol en este presente estudio) era más pequeño mediante la aplicación de 1 / x2como el factor de ponderación.
Los parámetros de la curva de calibración obtenida y el resultado de la validación se muestran en la tabla 3. El valor de la precisión y exactitud fueron dentro de ± 15%, mostrando que el presente estudio cumplió los criterios como un método de cuantificación mediante LC-MS8.
La cantidad de cada especie de SM en las células HeLa se muestra en la tabla 4. Las células HeLa fueron cultivadas en medios de cultivo que contiene 10% FBS y cosechado. D18:1 / 16:0 SM y d18:1 24:1 SM fueron el segundo más abundantes y más especies de SM cuya estructura se determinó y consisten en 54% y el 14% del total SM, respectivamente
Figura 1 . MS3 espectros de señales específicas de m/z de la SM en células HeLa. MS3 espectros de d18:1 síntesis química / 24:0 SM (A) y d18:1 / 24:0 SM en las muestras de lípidos extraídas de las células HeLa (B) se muestran. Los resultados fueron adaptados de Hama et al. 6 tenga en cuenta que la intensidad del espectro de la SPC es mayor que la de la N-molécula de acil de SM MS3 espectros de síntesis química d18:1 SPC se muestra en (C) empleando iones con idéntico m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) como los iones precursores de 1ª y 2ª. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Curvas de calibración de SM utilizando dos especies de SM isotópicamente etiquetados. (A) la curva de calibración utilizando dos isotópicamente etiquetada especies de SM (d18:1 /(D9) 18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM). Curvas de calibración fueron construidas usando el factor de ponderación = 1 / x2. Los resultados de la validación se enumeran en la tabla 3. (B) análisis Residual para la evaluación de la bondad de una curva de calibración construida. Los residuos en la curva de calibración utilizando el factor de ponderación = 1 / x2 es más pequeño que los que utilizan el factor de ponderación = 1 / x o 1, especialmente en una cantidad inferior de d18:1 /(D9)-18:1 SM haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.
| Configuración de TurboIonSpray | ||||||
| Modo de | Cortina Gas (psi) | Gas de colisión | voltaje de spray ion (V) | Temperatura (° C) | gas de la fuente de iones 1 (psi) | gas fuente de ion 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Alta | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabla 1. Las condiciones de la fuente de ion electrospray para el análisis cualitativo y cuantitativo. Esta tabla fue adaptada de Hama et al. 6
| modo de | polaridad | ion precursor (Q1) | producto ion o 2 ion precursor (Q3) | desclusterización potencial (V) | entrada potencial (V) | energía de la colisión (V) | potencial de salida de celda de colisión (V) | propagación de energía de la colisión (V) | Tiempo de excitación (ms) | Velocidad (Da/seg) | tiempo (s) | resolución |
| MRM | positiva | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Unidad |
| MS3 | negativo | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automáticamente caluculated | Unidad |
Tabla 2. Los parámetros del MS3 y MRM en triple cuadrupolo y trampa de iones lineal cuadrupolo de masas espectrometría utilizado para análisis cuantitativo y cualitativo, respectivamente. Esta tabla fue adaptada de Hama et al. 6
Tabla 3. Los parámetros de la curva de calibración obtenida y el resultado de la validación. Los resultados fueron adaptados de Hama et al. 6
| especies moleculares de SM | cantidad (pmol/mg de proteína) |
| D18:1 / 14:0 | 115.5 |
| D16:1 / 16:0 | 115.5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203,8 |
| D18:1 / 17:0 | 106.3 |
| D18:2 / 18:0 | 26.5 |
| D20:0 / 16:1 | 94.9 |
| D18:1 / 18:0 | 94.9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83.3 |
| D18:1 / 23:0 | 23.9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94.6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12.9 |
Tabla 4. La cantidad de cada especie de SM en células HeLa. Las células HeLa fueron cultivadas en medios de cultivo que contiene 10% FBS. Las células se cosecharon, y fracción lipídica total fue extraído por el método de Bligh & Dyer. Los resultados fueron adaptados de Hama et al. 6
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Discussion
En el presente método cualitativo, hemos obtenido MS3 iones del producto de un proceso estadístico y un N-molécula de acil. Es fundamental para asignar correctamente un SPC y una N-molécula de acil. Para ello, debe señalarse que también se pueden detectar otras moléculas de Fosforilcolina que contiene como MS3 iones del producto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) y del plasmalógeno del PC están abundantemente presentes en células de mamífero y su hidrofobicidad es similar a la de SM. Por lo tanto, diacil-PC y PC del plasmalógeno con un isótopo (generalmente 13C) pueden teóricamente detectarse simultáneamente con SM. En nuestros experimentos, los iones del producto3 MS de plasmalógeno PC simultáneamente fueron observados en el análisis de SM. Es útil seleccionar correctamente los iones del producto MS3 de SM para saber que la intensidad del espectro de la SPC es mayor que la de la SM N-molécula de acil (figura 1A y B). En cambio, es más grande que la intensidad de la molécula de acil graso (o casi igual) que el lysoplasmalogen-PC demethylated (datos no mostrados).
En el presente método cuantitativo, es fundamental para precisamente preparar muestras para construir la curva de calibración y validación del método. Además, el factor de ponderación debe utilizarse correctamente para construir la curva de calibración; es útil mejorar el ajuste especialmente en una baja concentración de la curva. Se compararon las curvas de calibración utilizando factores de ponderación diferentes. La curva de ajuste en baja concentración mejoró claramente utilizando el factor de ponderación = 1 / x2 en comparación con usando el factor de ponderación = 1 o 1 / x (figura 2B). Debe ser el valor de la precisión y exactitud dentro de ± 15%. Si la concentración del control de calidad-L es idéntica al límite inferior de la curva estándar (límite inferior de cuantificación), debe ser dentro de ± 20%8.
Se empleó el método de Bligh & Dyer para extraer la fracción total de lípidos de las células cultivadas en este estudio. Otros métodos para la extracción de lípidos tales como el método de Folch son también útiles9. Es importante extraer la fracción lipídica mediante el método adecuado según la cantidad y propiedades de las muestras. El número de especies de SM analizados simultáneamente en cada inyección no debe ser demasiado grande para evitar sobrecargar el software para adquisición de datos. El MRM programada será útil para la cuantificación simultáneamente un número de especies de SM.
Nuestro método actual mediante el análisis de3 MS es útil especular el número del carbono y enlaces dobles de LCB y N-molécula de acil de SM sin dispositivos adicionales. Sin embargo, no puede obtenerse otra información estructural como la ubicación de los dobles enlaces, isómero (cis o trans) y forma (recta o ramificada). Es necesario utilizar una energía más alta para obtener los iones del producto y su información estructural usando instrumentos adicionales10,11,12,13. La fórmula molecular de los iones del producto correspondiente a N-grupos acil era [RCO2]– iones que contienen nitrógeno. Es actualmente desconocido cómo la colisión inducida por el producto de disociación.
Para el análisis de3 MS, es importante ajustar los parámetros de energía de la colisión (CE) y el tiempo de excitación de MS3 fragmentación (ExT). Una CE mayor causará excesiva fragmentación y reducir la intensidad del ion del producto de la SM demethylated como el ion del precursor 2nd . Además, el patrón de fragmentación depende significativamente en la ext. Antes de los experimentos, es deseable determinar la condición apropiada de la CE y ExT que maximizan la intensidad de los iones producto del demethylated SM, SPC y N-molécula de acil por infusión de SM sintético disuelto en las fases móviles.
Utilizamos d18:1 /(D9) 18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM como dos especies de SM isotópicamente etiquetados para la construcción de la curva de calibración. La eficiencia de ionización puede variar según la especie de SM y la condición de la fase móvil. Así, si el número de SM de interés es limitado, es deseable preparar el isotópicamente etiquetada SM las especies de interés para la cuantificación más exacta.
La estructura de SM se ha determinado hasta el momento según el ión precursor y el ion del producto correspondiente al SPC desmetilado. Además, a veces fue obstaculizado para determinar precisamente el límite inferior de cuantificación en la matriz de la muestra de presencia ya que los compuestos de la blanco de interés fueron abundantemente presentes en la matriz de la muestra.
El presente estudio es útil para estimar la cantidad de carbono y de dobles enlaces en un LCB y un N-molécula de acil basado en sus correspondientes iones producto de MS3 experimentos sin instrumentos adicionales. Además, se presenta un método de análisis cuantitativo de SM utilizando dos estable isotópicamente etiquetada SM especies, lo que facilita determinar el rango utilizado en la cuantificación de SM. El presente método será útil en la caracterización de una variedad de especies únicas de la SM en diferentes muestras biológicas y productos industriales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Dufr (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) y una beca para el estudio de la enfermedad del Ministerio de Salud, trabajo y bienestar (K.Y. 201510032A #). Agradecemos la Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de una versión preliminar de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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