Summary
Här presenterar vi ett protokoll att kvantifiera och kvalificera varje ceramidas Art använder flera reaktionsövervakning och MS/MS/MS läge, respektive.
Abstract
Vi presenterar en metod för att analysera ceramidas (SM) kvalitativt och kvantitativt av liquid chromatography-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS). SM är en gemensam sphingolipid som består av en fosforylkolin och en ceramide som komponenten hydrofil och hydrofoba, respektive. Ett antal SM arter förekommer i däggdjursceller på grund av en mängd i sphingoid långa kedjan bas (LCB) och en N-acyl biexponentiellt i ceramide. I den här rapporten visar vi en metod för att uppskatta antalet kol och dubbelbindningar i en LCB och en N-acyl biexponentiellt baserat på deras motsvarande produkt joner i MS/MS/MS (MS3) experiment. Dessutom presenterar vi en kvantitativ analysmetod för SM med två stabila isotopically märkt SM arter, vilket underlättar att bestämma intervallet används i SM kvantifieringsmetoden. Denna metod kommer att vara användbart i karaktärisera en mängd SM arter i biologiska prover och industriprodukter såsom kosmetika.
Introduction
Ceramidas (SM) är en gemensam sphingolipid i däggdjursceller. SM är syntetiseras intracellulärt1 och närvarande som en föregångare för andra Sfingolipider såsom en sfingosin-1-fosfat och en ceramide, som har avgörande roller i immunförsvaret cell människohandel och hudens barriär homeostas, respektive2, 3. En exakt analys av SM metabolismen är därför viktigt för belysa Sfingolipider fysiologiska och patologiska roller.
SM består av en ceramide och en fosforylkolin som är kopplad till den ceramide, som ytterligare består av en sfingosin och en N1-hydroxy grupp-acyl biexponentiellt. En mängd i kol och dubbelbindningen siffrorna i både sfingosin och N-acyl biexponentiellt resulterar i antal ceramide (och SM) arter. Senaste framstegen inom LC-ESI-MS/MS har aktiverat kvantitativ och kvalitativ analys av SM4,5. I den kvalitativa analysen identifierades antalet kol och dubbelbindningar i en sphingoid LCB av SM genom att tilldela produkt ion spektra av LCB. Dock strukturell information av N-acyl biexponentiellt erhölls inte direkt eftersom dess motsvarande produkt joner inte har rapporterats, och därför N-acyl beståndsdelarna var utläsas av differentierad analys mellan föregångare joner och produkten joner motsvarar LCB i både positiva och negativa jonen lägen4,5. I denna rapport presenterar vi en metod för att identifiera produkten jonerna av både LCB och N-acyl biexponentiellt samtidigt i MS3 läge använder trippel quadrupole och quadrupole linjär ion trap-masspektrometri, vilket underlättar den exakta strukturellt spekulation av varje SM arter6.
De ion suppression (eller förbättring) effekter som orsakas av matrisen i biologiska prover hindrar korrekt kvantifiering i LC-ESI-MS analys, och det är därför önskvärt att konstruera kalibreringskurvor för alla analyter i matrisen identisk av det biologiska provet. Denna strategi är dock inte möjligt eftersom det är nästan omöjligt att förbereda alla SM arter i biologiska prover, särskilt i omfattande analys. Därför är det praktiskt att konstruera en kalibreringskurva och fastställa kvantitativa använder en representativ SM Art spetsade i biologiska prover. Vi använde två isotopically-märkt SM arter för att konstruera en kalibreringskurva; en användes för intern standard och den andra för en standard som är sammansatta. Vi har upptäckt en liten mängd isotopically-märkt SM arter som en standard förening spetsade i biologiska prover och framgångsrikt fått en kalibreringskurva och de kvantitativa sortiment6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Konsultera alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd handskar för att minimera prov kontaminering av huden-derived SM. Detta protokoll används HeLa celler odlas i örnens minsta viktigt medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1000 U/L penicillin och 100 mg/L streptomycin.
1. beredning av Lipid prover
Obs: Det är viktigt att allt glas inklusive provrör med Teflon-fodrade skruvkapsyler vara fri från rengöringsmedel.
- Utvinning av totala lipid bråk från cell Homogenatet använder den Bligh & Dyer metod7
- Ta bort kulturen (eller luftkonditionering) media från 10-cm vävnadsodling maträtt och skölj två gånger med 6 mL iskallt PBS.
- Tillsätt 1 mL iskallt PBS i 10-cm vävnadsodling skålen med P1000 pipett. Skörda cellerna med cell skrapor och samla in 2.0 mL silikoniserat plaströr.
- Efter centrifugering (1000 × g, 5 min, 4 ° C), ta bort supernatanten genom P1000 pipett.
- Tillsätt 1 mL metanol. Vortex rör kort och Sonikera på 200 W för 5 min i en bad-typ någon sonikator.
Obs: Justera vattennivån i en bad-typ någon sonikator så att cellpelleten är effektivt homogeniseras. - Över cell Homogenatet i metanol med pipett till provrör (13 mm x 100 mm) med Teflon-fodrade skruvkork.
- Tillsätt 1 mL metanol, 1 mL kloroform, 0,8 mL dubbel destillerat vatten och 50 μL 10 µmol/l för intern standard d18:1 /(D31)-16:0 SM i varje provrör.
- Vortex provrör kraftigt i 5 min i rumstemperatur.
Obs: vid denna punkt, en fas (kloroform/metanol/vatten = 1/2/0,8 (v/v/v)) bildas. - Tillsätt 1 mL kloroform och 1,0 mL av dubbel destillerat vatten.
- Cyklontuber kraftigt vid 2500 rpm för 5 min i rumstemperatur.
Obs: vid denna punkt, kammarvattnet (övre) och organiska (lägre) fas separeras. - Efter centrifugering (2 150 × g, 5 min, 25 ° C), samla in och överföra den lägsta fasen till disponibla glasrör (lägre inledningsfasen).
Obs: Samla den lägsta fasen använder en Pasteur-pipett och säkerhet pipett filter. Sätt spetsen på pipetten i den lägsta fasen, pressa den liten lampan bredvid 'E' ventilen att leverera övre fasen och gränsskiktspänning ludd inuti spetsen på pipetten och sedan sifon fasen lägre i pipetten. - Tillsätt 2 mL kloroform i provrör och vortex rören kraftigt vid 2500 rpm för 5 min i rumstemperatur att blanda tillräckligt med övre fasen och gränsskiktspänning fluff.
- Efter centrifugering (2 150 × g, 5 min, 25 ° C), samla in och överföra den modifierade lägsta fasen i de disponibel glasrör med lägre inledningsfasen som beskrivs i steg 1.1.10.
- Placera glasrör enligt en kväve-stream och helt ta bort de organiska lösningsmedel i insamlade lägre fas.
- Bereda proverna med 500 µL metanol eller etanol, filtratet med 0,02 µm filter, och förvara i glasflaskor vid-20 ° C.
- Provberedning för att konstruera kalibreringskurvan och validera metoden
- Tillsätt 50 µL 0,1, 0,5, 1, 5, 10 eller 50 µmol/L av standard förening (d18:1 /(D9)-18:1 SM) i provrör med Teflon-fodrade skruvkork.
- Lägg cell Homogenatet i varje provrör och metanol till 1 mL.
Obs: Cell Homogenatet som en matris varierar enligt varje experiment. Om den SM-arten i prover från celler i en 10-cm kultur maträtt analyseras rutinmässigt, bör mängden cell Homogenatet i varje provrör nära den i celler i en 10-cm kultur maträtt. - Extrahera det totala lipid bråket som beskrivs i steg 1.1.6-1.1.14.
- Förbereda kvalitetskontroll (QC) prover för att validera metoden som descried i steg 1.2.1-1.2.3. Förbereda tre QC prover med olika koncentrationer av standard förening (d18:1 /(D9)-18:1 SM): en inom 3 x den nedre gränsen för standardkurvan (QC-låg, QC-L), en nära centrum (QC-mitten, QC-M), och en nära den övre gränsen för den standardkurvan (QC-hög, QC-H).
2. SM analys av LC-ESI-MS/MS
- Beredning av den mobila fasen
- Blanda lösningsmedel (acetonitril/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) för vattenfas och isopropanol för den organiska fasen) i glasflaskor med Teflon-fodrade skruvkork och Sonikera under 5 minuter i en bad-typ någon sonikator.
- Lägga till myrsyra (slutlig koncentration 26,4 mmol/L) och NH4OH (14,9 mmol/L) i varje mobil fas.
- Kvalitativ analys av SM av LC-ESI-MS3
- Aktivera den högpresterande vätskekromatografi (HPLC) systemet, sätta inlopp rör i glasflaskorna som innehåller mobila faser och rensa raderna HPLC. Länka en C18 HPLC-kolonnen (1,5 mm i.d. × 100 mm längd, partikel storlek 3,0 µm) i HPLC-systemet, hålla temperaturen i kolumnen ugnen på 50 ° C och konditionera kolonnen med mobila vattenfasen vid 100 µL/min. tas proverna i ett prov rack i autosampl er.
- Ange parametrarna för den tredubbla quadrupole och quadrupole linjär ion trap masspektrometri system för MS3 analys som anges i tabell 1 och tabell 2 samt första och andra föregångaren joner av SM arter av intresse.
- Dubbelklicka på ikonen för programvaran för datainsamling, dubbel klick 'Järnvaror konfigurationen', Välj 'LC + QTRAP4500 + ventil' och klicka 'Aktivera profil'.
- Skapa en ny undermapp genom att klicka på 'Nytt underprojekt' och 'OK'.
- Klicka på fliken 'Arkiv', Välj 'Ny' och välj 'Förvärvsmetoden' och 'OK'. Klicka på ikonen 'Massa Spec' och 'MS' tab. Välj Skanna typ som 'MS/MS/MS (MS3)', Scan hastighet som 10.000 Da/s polaritet som 'Negativa' och 'Varaktighet' som hela tiden ska analyseras (min). Ställa in m/z 'Start (Da)' och 'Stop (Da)' som intervallet som ska skannas. Ställ in m/z av 1st och 2nd föregångare joner av målet SM arter av intresse.
Obs: För att analysera flera SM arter, markera den '-MS3' ikon, högerklicka, Välj 'Kopiera detta experiment' och sedan sätta m/z av 1st och 2nd föregångare joner av andra SM-arter. - Välj fliken 'Avancerat MS' och ange varje parameter enligt följande: skanningsläge som 'Profil', stegstorlek som 0.12 (Da), Resolution Q1 och Q3 'Enhet' och 'LIT', respektive intensitet tröskel som 0, härdningstid som 50 (ms), paus mellan massa spänner som 1.5 ms, Välj ' dynamisk fylla tid ', Q3 inträdeshinder som 8 V och Excitation tid som 25 ms.
- Klicka på knappen 'Redigera parametrar' på fliken 'MS' och välj 'Source/Gas' tab. ange parametrarna av gardin gas, kollision gas, ionspray spänning, temperatur, ion källa gas1 och gas2 som anges i tabell 1. Välj fliken 'Förening' ange sedan parametrarna av den declustering potential, entré potential, kollision energi, exciteringsenergi och kollision energi sprids som förtecknas i tabell 2.
- Markera 'Integrated Valco Valve' och välj 'Position namn för steg 0' som A och ange 'B' som position för total tid 5.0 min. Också ange 'A' som position för total tid 70,0 min.
- Markera 'Shimadzu LC system'. Välj fliken 'Pump' och Ställ in pumpning som binära flödet, totala flödet som 0,28 mL/min och maximalt tryck gränser som 20,0 MPa. Välj fliken 'Autosampler' och ange skölja volymen som 200 µL, nål Stroke som 52 mm, sköljer hastighet som 35 µL/s, provtagning hastighet som 5.0 µL/s, rensa tid som 25,0 min, skölj dopp tid som 5 s och skölj läge som 'Före och efter aspirationen'.
- Dessutom aktivera svalare enheten, ställa in svalare temperatur som 4 ° C och kontroll injektionsflaska nål stroke som 52 mm. Välj fliken 'Ugn' Aktivera ugnen och Ställ in ugnstemperaturen och högsta temperatur som 50 ° C och 85 ° C, respektive.
- Välj fliken ”registeransvarig” och markera rutan 'Power på'. Välj fliken 'Tid Program' och ange de lösningsmedel lutningarna följande: lösningsmedel A / B på en 100/0 förhållande i 5 minuter program linjär förändringar till 80/20 över 4 min, 35/65 över 50 min, och att 25/75 över 1 min. efteråt , håll dem på 25/75 i 10 min, sedan linjärt till 100/0 över 4 min. Spara sedan metoden.
- Skapa kommandofil
- Dubbel klicka på ikonen 'Bygga förvärv Batch', 'Lägg till Set', 'Lägg till prover', antalet nya prover och klicka på 'OK'.
- Klicka på knappen ' metod Editor' och välj metoden som ska användas. Om flera metoder används i en batch-fil, markera rutan för 'Använda flera metoder' och välj förvärvsmetoden för varje prov. Byta namn på 'Prov namn', ange numret för 'Injektionsflaska Position' och sätta mängden injektionsvolym. Spara kommandofilen.
- Få den MS3 produkten ion spektra av SM arter av intresse av LC-ESI-MS3 analys
- Välj fliken 'Skicka' i batchfilen, markera raden för prov som ska analyseras och klicka på knappen 'Skicka'.
- Klicka på den '' Visa Quene', 'Jämvikt' ikonen, Välj förvärvsmetoden användas, ange tid som 1 min och klicka på 'OK'.
- Inaktivera ”Reserve Instrument för Tuning' genom att klicka på motsvarande ikon. Då utföra parti sekvens genom att klicka på ikonen 'Börja prov'.
- Tilldela varje MS3 produkt ion spektra av SM genom att jämföra massan att debitera baserat (m/z) av produkten ion spectra och exakta massan av sphingoid LCB och N-acyl biexponentiellt sevärdheter. Bestämma antalet kolatomer och dubbel obligationer i sphingoid LCB och N-acyl biexponentiellt enligt motsvarande produkt jonerna.
- Bekräfta att mappen lämpligt delprojekt är markerad, dubbelklicka på 'Öppna datafil' ikonen, och välj proverna som ska analyseras. Dra toppen i kromatogrammet för varje mål SM arter och då dubbel klick. De erhållna MS3 produkt ion spektra inom området dras kommer att presenteras.
- Kvantitativ analys av SM av LC-ESI-MS/MS
- Ställa in mobila faser och HPLC-kolonnen som beskrivs i steg 2.1 och 2.2.1.
- Ange parametrar för trippel quadrupole och quadrupole linjär ion trap masspektrometri system för flera reaktion övervakning (MRM) analys som anges i tabell 1 och tabell 2.
- Genomföra förfaranden som beskrivs i steg 2.2.2.1 och 2.2.2.2.
- Klicka på fliken 'Arkiv', Välj 'Ny' och välj 'Förvärvsmetoden' och 'OK'. Klicka på ikonen 'Massa Spec' och 'MS' tab. Välj Skanna typ som 'MRM', polaritet som 'Positiv'. Ange 'Varaktighet' som hela tiden ska analyseras. Som m/z [M + h]+ 184 som 'Q1 massa (Da)' och 'Q3 massa (Da)' målet SM arter av intresse, respektive. Ange 'Tid' som 10 ms och 'ID' som namn på målet SM arter.
- Välj fliken 'Avancerat MS' och ange varje parameter enligt följande: både i resolutionen Q1 och Q3 som 'Enhet', intensitet tröskel som 0, härdningstid som 0 (ms), och gör paus mellan massa spänner som 5 ms.
- Klicka på knappen 'Redigera parametrar' på fliken 'MS' och välj fliken ' Källa/Gas' sätta parametern av gardin gas, kollision gas, ionspray spänning, temperatur, ion källa gas1 och gas2 som anges i tabell 1. Välj sedan fliken 'Förening' sätta parametrarna för declustering potential, entré potential, kollision energi och kollision cell avsluta potential som förtecknas i tabell 2.
- Ställ ventilen som beskrivs i steg 2.2.2.6.
- Villkoret för LC som beskrivs i steg 2.2.2.7. Spara sedan metoden.
- Skapa kommandofilen som beskrivs i steg 2.2.3.
- Få MRM data för varje SM art genom LC-ESI-MS/MS-analys som beskrivs i steg 2.2.4.
- Bearbeta MRM data med hjälp av programvaran för dataintegrering och erhålla data för topparea för extraherade ion kromatogrammet för varje SM art.
- Dubbelklicka på ikonen för programvaran för dataintegrering i kvantitativ analys, klicka på fliken 'Redigera' och användaren Integration defaults. Gaussisk slät bredd som 1.0 punkt och klicka på 'OK'. Klicka på fliken 'Redigera' och välj 'Ny resultat tabell'. Välj provet integreras en pilknapp, och klicka på 'Nästa'. Välj 'Skapa ny metod', ange namnet på metoden och klicka på 'Nästa'. Klicka på 'Nästa' och markera rutan för d18:1 /(D31)-16:0 SM som det är, klicka på 'Nästa' och klicka på 'Avsluta'.
- Klicka på 'Visar översynen topp' och bekräfta att kromatogramtopparna redovisas korrekt. Det bör noteras att retentionstiden för d18:1 /(D31)-16:0 SM är vanligtvis mindre av ~ 0.3 min jämfört med en av de 34-1 SM (vanligtvis består av d18:1 / 16:0 SM).
- Kvantifiera varje SM art enligt kvoten av toppen av varje SM art till d18:1 /(D31)-16:0 SM intern standard.
- Klicka på fliken 'Arkiv', Välj 'Export', Välj 'Resultattabellen', bekräfta formatet som 'MultiQuant', kolumner som 'Exportera alla kolumner', rader som 'Exportera alla rader utom dessa uttryckligen dolda' och klicka 'OK'.
- Öppna den exporterade filen i programmet Excel. Normalisera området i målet SM arter av området av IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Sedan multiplicera med den teoretiska mängden IS i det injicerade provet att beräkna mängden mål SM arter i injicerade provet.
- Att konstruera standardkurvan
- Hämta MRM data av d18:1 /(D9)-18:1 SM och d18:1 /(D31)-16:0 SM i proverna för att konstruera standardkurvan genom LC-ESI-MS/MS-analys som beskrivs i steg 2.3.1-2.3.4.
- Erhålla data för topparean för d18:1 /(D9)-18:1 SM och d18:1 /(D31)-16:0 SM som beskrivs i steg 2.3.5.
- Beräkna mängden d18:1 /(D9)-18:1 SM i det injicerade provet som beskrivs i steg 2.3.6.
- Konstruera trendlinjen genom att ställa de x-axeln och y-axeln som den nominella belopp och beräknade beloppet av d18:1 /(D9)-18:1 SM och erhålla formeln trendlinje.
- Validera den kvantitativa metoden använder Excel programvara
- För validering av metoden, kvantifiera mängden d18:1 /(D9)-18:1 SM och d18:1 /(D31)-16:0 SM i QC prov genom att analysera varje QC prov minst tre gånger i 1 dag, och upprepa minst 3 dagar som beskrivs i steg 2.3.1-2.3.4.
- Hämta peak områdesdata och beräkna mängden d18:1 /(D9)-18:1 SM i det injicerade provet som beskrivs i steg 2.3.5 och 2.3.6.
- Enligt kalibreringskurvan erhållits, beräkna mängden d18:1 /(D9)-18:1 SM i det injicerade provet.
- Utvärdering av precision
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för mängden d18:1 /(D9)-18:1 SM införskaffad i steg 2.5.3 på datamängden av intra- och Inter dag använder Excel programvara.
- Den genomsnittliga som erhölls i steg 2.5.4.1 är dividerat med standardavvikelsen, och uttryckt i %.
- Utvärdering av noggrannhet
- Beräkna riktigheten i varje data enligt följande:
[(Det beräkna belopp som erhålls i steg 2.5.3.) / (Nominella belopp) - 1] × 100(%) - Beräkna medelvärdet för det absoluta värdet av exaktheten på datamängden intradaglig och Inter dagen.
- Beräkna riktigheten i varje data enligt följande:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemiskt syntetiserade d18:1 / 24:0 SM (figur 1A) och d18:1 / 24:0 SM i lipid prover ur HeLa cells (figur 1B) analyserades av LC-ESI-MS3 anställa [M + HCOO]– och [M-CH3]- som första och andra föregångare joner, respektive. Observera att spektrum intensitet demetylerade-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) är större än SM N-acyl biexponentiellt (m/z 378). I tillägg, det spektrum som motsvarar [M-kolin-CH3 (sfingosin-1-fosfat)]– är också användbart att tilldela LCB för SM. Vi bekräftade också att spektrumet av den demetylerade-SPC (m/z 449) produceras främst från d18:1 SPC under förutsättning att våra MS3 analys (figur 1C).
Upp kalibreringskurvan med två-isotopically märkt SM arter visades i figur 2A. Trendlinjen erhölls genom att tillämpa 1 / x2som viktningsfaktorn. Resultatet av den återstående analysen visades i figur 2B. Observera att det återstående värdet nära nedre gränsen för kvantifiering (0,1 pmol i den nu aktuella studien) var mindre genom att tillämpa 1 / x2som viktningsfaktorn.
Parametrarna för erhållna kalibreringskurvan och resultatet av validering var visas i tabell 3. Värdet av den precision och noggrannhet var inom ± 15%, visar att den aktuella studien uppfyllde kriterierna som kvantitering metod använder LC-MS8.
Beloppet för varje SM arter i HeLa cellerna var visas i tabell 4. HeLa celler odlades i kultur media som innehåller 10% FBS och skördade. D18:1 / 16:0 SM och d18:1 / 24:1 SM var de flesta och näst vanligaste SM arter vars struktur fastställdes, och består av 54% och 14% av totala SM, respektive
Figur 1 . MS3 spektra av specifika m/z signaler för SM i HeLa cells. MS3 spektra av kemiskt syntetiserade d18:1 / 24:0 SM (A) och d18:1 / 24:0 SM i lipid prover ur HeLa cells (B) visas. Resultaten var anpassade från Hama m.fl. 6 Observera att spektrum intensiteten i SPC är större än N-acyl biexponentiellt av SM. MS3 spektra av kemiskt syntetiserade d18:1 SPC visas i (C) genom att anställa joner med identiska m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) som 1st och 2nd föregångare jonerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Kalibreringskurvorna för SM med två isotopically-märkt SM arter. (A) den kalibrering kurva med två-isotopically märkt SM arter (d18:1 /(D9)-18:1 SM och d18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibreringskurvorna konstruerades med viktningsfaktorn = 1 / x2. Resultatet av validering listas i tabell 3. (B) återstående analys för utvärdering av en Byggyta kalibreringskurva godhet. Residualerna i upp kalibreringskurvan med viktningsfaktorn = 1 / x2 är mindre än de använder viktningsfaktorn = 1 / x eller 1, speciellt i en lägre mängd d18:1 /(D9)-18:1 SM. Klicka här för att se en större version av denna Figur.
| TurboIonSpray inställningar | ||||||
| Läge | Gardin Gas (psi) | Kollision Gas | Ion spray spänning (V) | Temperatur (° C) | Ion källan gas 1 (psi) | Ion källan gas 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Hög | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabell 1. Villkoren för elektrospray ion källa används för både kvalitativ och kvantitativ analys. Den här tabellen anpassades från Hama m.fl. 6
| läge | polaritet | föregångaren ion (Q1) | produkt ion eller 2nd föregångare ion (Q3) | declustering potential (V) | ingången potentiella (V) | kollision energi (V) | kollision cell avsluta potential (V) | kollision energi sprida (V) | Magnetiseringen tid (ms) | Hastighet (Da/sekund) | tid (s) | upplösning |
| MRM | positivt | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Enhet |
| MS3 | negativa | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automatiskt caluculated | Enhet |
Tabell 2. Parametrarna för MS3 och MRM mode i trippel quadrupole och quadrupole linjär ion trap mass spectrometry används för kvalitativ och kvantitativ analys, respektive. Den här tabellen anpassades från Hama m.fl. 6
Tabell 3. Parametrarna för erhållna kalibreringskurvan och resultatet av validering. Resultaten var anpassade från Hama m.fl. 6
| molekylstorleken för SM | belopp (pmol/mg protein) |
| D18:1 / 14:0 | 115,5 |
| D16:1 / 16:0 | 115,5 |
| D17:1 / 16:0 | 239,8 |
| D18:2 / 16:0 | 449,9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106,3 |
| D18:2 / 18:0 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94,9 |
| D18:1 / 18:0 | 94,9 |
| D18:2 / 22:0 | 102,3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286,5 |
| D18:2 / 24:1 | 286,5 |
| D18:1 / 24:1 | 853,2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12,9 |
Tabell 4. Beloppet för varje SM art i HeLa cells. HeLa celler odlades i kultur media som innehåller 10% FBS. Celler skördats, och totala lipid bråk extraherades med Bligh & Dyer metod. Resultaten var anpassade från Hama m.fl. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna kvalitativa metod, vi fått MS3 produkt joner av ett Tilläggsskydd och en N-acyl biexponentiellt. Det är viktigt att korrekt tilldela både ett Tilläggsskydd och en N-acyl biexponentiellt. I detta syfte bör det noteras att andra fosforylkolin-innehållande molekyler kan också identifieras som MS3 produkt joner. Diacyl-fosfatidylkolin (PC) och plasmalogen-PC finns rikligt i däggdjursceller, och deras vattenavvisande egenskaper är liknande den i SM. Därför kan diacyl-PC och plasmalogen-PC med en isotop (vanligtvis 13C) teoretiskt upptäckas samtidigt med SM. I vårt experiment observerades samtidigt MS3 produkt jonerna plasmalogen-PC i SM analysen. Det är bra att korrekt välja MS3 produkt jonerna av SM att veta att spektrum intensiteten i SPC är större än SM N-acyl biexponentiellt (figur 1A och B). Däremot intensiteten av feta acyl-delen är större än (eller nästan samma som) som de demetylerade lysoplasmalogen-PC (inga data anges).
I denna kvantitativa metod är det viktigt att just förbereda prover för att konstruera kalibreringskurvan och validera metoden. Dessutom bör viktningsfaktorn ordentligt användas till kalibreringskurvan; Det är användbart att förbättra kurvan passande särskilt vid låga koncentrationer. Vi jämförde justeras efter kalibreringskurvorna med hjälp av olika viktningsfaktorer. Kurvan montering vid låg koncentration var klart förbättrats med hjälp av viktningsfaktorn = 1 / x2 jämfört med att använda viktningsfaktorn = 1 eller 1 / x (figur 2B). Värdet av den precision och noggrannhet bör ligga inom ± 15%. Om koncentrationen av QC-L är identisk med den nedre gränsen för standardkurvan (nedre gränsen för kvantifiering), bör det vara inom ± 20%8.
Vi anställt metoden Bligh & Dyer att extrahera det totala lipid bråket från odlade celler i denna studie. Andra metoder för lipid utvinning såsom Folch metoden är också användbar9. Det är viktigt att extrahera det lipid bråk med hjälp av lämplig metod enligt de belopp och/eller egenskaper av proverna. Antalet SM arter samtidigt analyseras i varje injektion bör inte vara för stor för att förhindra överbelastning programvaran för datainsamling. Den schemalagda MRM kommer att vara användbart för quantitating ett antal SM arter samtidigt.
Vår nuvarande metod att använda MS3 analys är användbart att spekulera antalet kol och dubbelbindningar LCB och N-acyl biexponentiellt för SM utan ytterligare enheter. Dock inte kan andra strukturella information såsom platsen av dubbla förbindelser isomeren (cis eller trans) och form (rak eller grenad) erhållas. Det är nödvändigt att använda högre energi för att få produkten joner och deras strukturella information med hjälp av ytterligare instrument10,11,12,13. Formeln av produkten joner motsvarar N-acyl beståndsdelarna var [RCO2]– -joner som inte innehåller kväve. Det är för närvarande okänt hur kollisionen inducerad dissociation vinning.
För MS3 analys är det viktigt att justera parametrarna för kollision energi (CE) och excitation tid för MS3 fragmentering (ExT). En högre CE kommer att orsaka överflödig fragmentering och minska intensiteten i produkt ion för den demetylerade SM som 2nd föregångare jonen. Den fragmentering mönstret är dessutom betydligt beroende på ExT. Innan experiment, är det önskvärt att fastställa lämpliga villkoret av CE och ExT som maximera intensiteten av produkten jonerna av demetylerad SM, SPC och N-acyl biexponentiellt genom infusion syntetiska SM upplöst i mobila faser.
Vi använde d18:1 /(D9)-18:1 SM och d18:1 /(D31)-16:0 SM som två isotopically-märkt SM art till kalibreringskurvan. Effektiviteten av jonisering kan variera enligt den SM-arten och villkorar av den mobila fasen. Således, om antalet SM sevärdheter är begränsad, är det önskvärt att förbereda de isotopically-märkt SM arterna av intresse för mer exakt kvantifiering.
SM strukturen har fastställts hittills enligt föregångare jonen och produkt ion motsvarar demetylerad SPC. Det hämmades dessutom ibland för att exakt bestämma den lägsta gränsen för kvantifiering i matrisen närvaro prov eftersom föreningarna som target sevärdheter fanns rikligt i matrisen provet.
Föreliggande studie är användbart att uppskatta antalet kol och dubbelbindningar i en LCB och en N-acyl biexponentiellt baserat på deras motsvarande produkt joner i MS3 experiment utan ytterligare instrument. Dessutom presenterar vi en kvantitativ analysmetod för SM med två stabila isotopically märkt SM arter, vilket underlättar att bestämma intervallet används i SM kvantifieringsmetoden. Denna metod kommer att vara användbart i karaktärisera en mängd unika SM arter i olika biologiska prover och industriprodukter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett forskningsanslag från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik av Japan (KAKENHI) att K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) och bidrag för studier av svårbehandlad sjukdom projekt från ministeriet för Hälsa, arbete och välfärd (K.Y. #201510032A). Vi tackar gruppen Edanz (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
