Summary
여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.
Abstract
우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.
Introduction
Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.
SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid LCB의 SM의 이중 결합 LCB의 제품 이온 스펙트럼을 할당 하 여 확인 되었습니다. 그러나, N의 구조 정보-acyl moiety는 직접 얻지 못하면는 해당 제품 이온 보고 하지 않은, 때문에 그리고 그러므로 N-acyl moieties 선구자 이온 사이 차동 분석 추론 했다 고 제품 이온 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 모드4,5에 LCB에 해당. 이 보고서에서는 LCB와 N의 제품 이온을 검출 하는 방법 소개-acyl moiety 트리플 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석, 정확한 구조를 용이 하 게 하를 사용 하 여 MS3 모드에서 동시에 각 SM 종6의 추측
생물 학적 샘플 매트릭스로 인 한 이온 억제 (또는 강화) 효과 방해 LC-ESI-MS 분석, 정확한 정량화 하 고 따라서, 그것은 동일한 매트릭스에 대 한 관심의 모든 analytes에 대 한 교정 곡선을 생성 하는 것이 좋습니다. 생물 학적 샘플. 그러나,이 전략은 불가능 하기 때문에 그것은 거의 모든 SM 종 종합 분석에 특히 생물학 견본에서 준비 가능 하지. 따라서, 보정 곡선을 건설 하 고 대표적인 SM 종 생물 학적 샘플에서 아군을 사용 하 여 양적 범위를 결정 하는. 우리는 보정 곡선; 구성 두 isotopically 표시 된 SM 종 사용 하나는 내부 표준 및 표준 화합물에 대 한 다른 사용 되었다. 우리는 생물 학적 샘플에 아군 하 고 성공적으로 교정 곡선과 양적 범위6표준 화합물으로 SM 종 isotopically 표시의 작은 금액을 감지.
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Protocol
사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 피부에서 파생 된 SM에 의해 샘플 오염을 최소화 하기 위해 장갑을 착용 한다. 현재 프로토콜 2 m m L10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충이 글의 최소 필수 매체에 성장 하는 HeLa 세포에 적용 했다-글루타민 1000 U/L 페니실린, 100 mg/L 스.
1입니다. 지질 샘플의 준비
참고: 모든 유리 시험관 테 플 론 늘어선 나사 모자를 포함 하 여 세제 없이 수 중요 하다.
- Bligh 및 염색 방법7 을 사용 하 여 셀 homogenate에서 총 지질 분수의 추출
- 문화를 제거 (또는 조건)-10cm 조직 문화 접시와 차가운 PBS의 6 mL로 두 번 린스에서 미디어.
- P1000 피펫으로 여 10 cm 조직 문화 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼와 세포를 수확 하 고 2.0 mL 시 플라스틱 튜브에 수집 합니다.
- 원심 분리 (1000 × g, 5 분, 4 ° C), 후에 상쾌한 P1000 피펫은 제거 합니다.
- 메탄올의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 관 짧게 고 목욕 형 sonicator에 5 분 동안 200 W sonicate.
참고: 셀 펠 릿 효율적으로 무 균 되도록 목욕 형 sonicator의 수 위를 조정 합니다. - 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브 (13 m m x 100 m m)로 피 펫 메탄올에 셀 homogenate 전송.
- 메탄올, 클로 프롬, 두 배 증류수, 0.8 mL 및 50 µ L 10 µ / L 내부 표준 d18:1 /(D31)-16의의 1 mL의 1 mL를 추가: 0 각 시험관에 SM.
- 실 온에서 5 분 동안 적극적으로 소용돌이 테스트 튜브.
참고:이 시점에서 단일 위상 (클로 프롬/메탄올/물 1/2/0.8 (v/v/v) =) 형성 된다. - 1 mL의 클로 프롬 및 두 배 증류수의 1.0 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 소용돌이 튜브.
참고:이 시점에서,는 수성 (위) 및 유기 (낮은) 위상 구분 됩니다. - 원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 일회용 유리 튜브 (초기 낮은 단계)로 낮은 단계를 전송.
참고: 낮은 단계 파스퇴르 피 펫 및 안전 피 펫 필터를 사용 하 여 수집 합니다. 낮은 위상에는 피 펫의 끝을 삽입 하 고 위 위상 및 피 펫, 팁 내부의 계면 보풀을 제공 하는 'E' 밸브 옆 작은 전구를 집어넣은 다음에 피펫으로 낮은 단계를 사이 펀. - 튜브 위 단계와 계면 보풀 충분히 섞어 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 테스트 튜브, 그리고 소용돌이에 클로 프롬의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 수정 된 낮은 단계 단계 1.1.10에서에서 설명 된 대로 초기 낮은 단계와 일회용 유리 튜브로 전송.
- 질소 스트림 아래 유리 튜브를 놓고 완전히 수집된 낮은 단계에서 유기 용 매를 제거 합니다.
- 샘플 reconstitute 메탄올 또는 에탄올의 500 µ L, 0.02 µ m 필터, 여과-20 ° c.에 유리 튜브에 저장
- 보정 곡선을 건설 하 고 메서드를 유효성 검사를 위한 샘플 준비
- 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 또는 표준 화합물의 50 µ / L의 50 µ L를 추가 (d18:1 /(D9)-18:1 SM) 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브로.
- 각 시험관에 세포 homogenate를 추가 하 고 1 mL에 메탄올을 추가.
참고: 셀 homogenate 매트릭스로의 양은 각 실험에 따라 다릅니다. 샘플 10 cm 배양 접시에 셀에서 파생 된 SM 종 정기적으로 분석 하 고, 각 테스트 튜브에 세포 homogenate의 양을 10 cm 배양 접시에 셀의 가까이 이어야 한다. - 1.1.6-1.1.14 단계에에서 설명 된 대로 총 지질 분수를 추출 합니다.
- 단계 1.2.1-1.2.3에서 descried로 메서드를 유효성 검사에 대 한 품질 검사 (QC) 샘플을 준비 합니다. 표준 화합물의 다른 농도와 3 QC 샘플 준비 (d18:1 /(D9)-18:1 SM): 3 표준 곡선 (QC 로우, QC L), 하나 센터 근처의 더 낮은 경계 배 내에서 (중간 품질 관리, 품질 관리-M)의 상한 근처 하나는 표준 곡선 (QC-높은, QC-H).
2. SM LC-ESI-MS/MS 분석
- 모바일 위상의 준비
- 혼합 용 제 (이기/메탄올/ddH2O 수성 단계와 소 프로 파 놀 유기 단계에 대 한 2/2/1 (v/v/v) =)에 유리 테 플 론 늘어선 나사 모자 병 및 목욕 형 sonicator에서 5 분 sonicate.
- 포 름 산 (최종 농도 26.4 mmol/L)와 NH4오 추가 (14.9 mmol/L) 각 모바일 단계에.
- LC-ESI-MS3 SM의 질적 분석
- 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 활성화 하 고 모바일 단계를 포함 하는 유리 병에 넣어 입구 튜브 HPLC 라인을 제거. HPLC 시스템에 C18 HPLC 열 (1.5 m m 아이디 × 100 m m 길이, 입자 크기 3.0 µ m)를 연결, 열 오븐에서 50 ° C에 온도 유지 하 고 상태는 autosampl에서 샘플 선반에 샘플을 넣어 100 µ L/분에 수성 모바일 단계와 열 어.
- 3 배 4 중 극 및 4 극 자 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 MS3 분석 이온의 SM 종의 첫 번째 및 두 번째 전조 뿐만 아니라 표 1 과 표 2 에 나열 된 매개 변수를 설정 합니다.
- 데이터 수집을 위한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, 더블 클릭 ' 하드웨어 구성 ', ' LC + QTRAP4500 + 밸브 ' 선택한 ' 활성화 프로필 '을 클릭 합니다.
- ' 새 하위 프로젝트 ' 및 '확인'을 클릭 하 여 새 하위 폴더를 만듭니다.
- '파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 10000 Da/s, 극성 '부정적'으로 그리고 '기간' 전체 시간으로 분석 된 (분)으로 속도 스캔, ' MS/MS/MS (MS3)'으로 ' 질량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 검색 범위는 '시작 (Da)'와 '정지 (다)'의 m/z 를 설정 합니다. SM 종 관심의 대상의 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 설정 합니다.
참고: 여러 SM 종 분석, 강조는 '-MS3' 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, '이 실험 복사' 선택 하 고 다음 다른 SM 종 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 넣어. - ' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: '프로 파일', 단계 크기 0.12 (다), 해상도 q 1과 q 3로 스캔 모드 '단위'와 '조명', 각각 50 (ms), 1.5 ms로 대량 범위 사이 일시 중지도 0, 설정 시간으로 강도 임계값 선택 ' 동적 시간을 채우기 ', 8 V, 3 분기 진입 장벽 및 25 ms로 여기 시간.
- 'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 선택 ' 소스/가스 ' 탭 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 설정. 그런 다음 선택 '복합' 탭 declustering 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 여기 에너지, 및 충돌 에너지는 표 2에 나열 된 전파의 매개 변수 설정.
- ' 통합 Valco 밸브 '를 강조 하 고 ' 단계 0에 대 한 위치 이름을 ' a, 선택한 설정 'B' 총에 대 한 위치와 5.0 분 시간. 또한 'A' 총에 대 한 위치 설정 70.0 분 시간.
- 'Shimadzu LC 시스템'을 강조 표시 합니다. '펌프' 탭을 선택 하 고 이진 흐름, 0.28 mL/min와 최대 압력 한계 20.0 MPa로 전체 흐름으로 양수 모드를 설정 합니다. 'Autosampler' 탭을 선택 하 고 200 µ L로 헹 구는 볼륨 설정, 35 µ L/s 속도 rinsing, 샘플링 속도 5.0 µ L/s로 52 m m, 스트로크를 바늘, 25.0 분으로 시간을 제거, '전후 포부' 5 s, 그리고 린스 모드 딥 시간을 씻어.
- 또한, 쿨러 장치를 활성화, 쿨러 온도 4 ° C로 설정 고 제어 유리병 바늘 선 52 m m. '오븐' 탭을 선택 하는 대로 오븐을 사용 각각 오븐 온도 최고 온도 50 ° C에서 85 ° C로 설정.
- '컨트롤러' 탭을 선택 하 고 확인란을 '에 힘'. ' 시간 프로그램 ' 탭을 선택 하 고 용 매 기울기를 다음과 같이 설정: 용 매 A / 5 분 동안 100/0 비율로 B 80/20을 선형 변경 프로그램 35/65 4 분 이상 50 분 이상 및 25/75 이상 1 분 후 25/75 10 분 동안 다음 선형 100/0에서 그들을 잡고 4 분 이상. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.
- 배치 파일 만들기
- ' 건설 인수 일괄 ' 아이콘 더블 클릭, 클릭 ' 추가 설정 ', ' 추가 샘플 ', 새로운 샘플 수를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.
- ' 기가 ' 버튼을 클릭 하 고 사용할 방법을 선택 합니다. 여러 메서드 한 배치 파일에 사용 되는 경우 ' 여러 방법을 사용 '의 상자를 확인 하 고 각 샘플에 대 한 수집 방법을 선택 합니다. ' 샘플 이름 ' 이름 바꾸기 ' 유리병 위치 '에 대 한 적절 한 번호를 설정 하 고 주입 볼륨의 금액을 넣어. 다음 배치 파일을 저장 합니다.
- LC-ESI-MS3 분석에 의해 MS3 제품의 SM 종의 이온 스펙트럼을 얻기
- 배치 파일에서 '제출' 탭을 선택 하 고, 분석 샘플의 줄을 강조 표시 '제출' 버튼을 클릭 합니다.
- 클릭은 ' 보기 Quene' 아이콘 '평형' 아이콘을 선택 인수 메서드를 사용할 수 1 분으로 시간을 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.
- 해당 아이콘을 클릭 하 여 ' 튜닝에 대 한 예비 악기 '를 비활성화 합니다. 다음 ' 시작 샘플 ' 아이콘을 클릭 하 여 일괄 처리 시퀀스를 실행 합니다.
- 질량 이온 스펙트럼 제품의 비 (m/z)를 충전 하 고는 sphingoid의 정확한 질량을 비교 하 여 각 MS3 SM의 제품 이온 스펙트럼 할당 LCB와 N-acyl moiety 관심의. LCB와 N은 sphingoid에서 탄소 이중 수 채권 확인-해당 제품 이온에 따라 acyl moiety.
- 적절 한 하위 프로젝트 폴더 선택 되어 있는지 확인, 다음 ' 데이터 파일 열기 ' 아이콘을 두 번 클릭 하 고 샘플 분석을 선택 합니다. SM 종 각 대상에 대 한 크로마에 피크를 끌어서 다음 두 번 클릭 합니다. 드래그 영역 내에서 얻은 MS3 제품 이온 스펙트럼 표시 됩니다.
- LC-ESI-MS/MS에 의해 SM의 정량 분석
- 2.1 및 2.2.1 단계에서 설명한 대로 모바일 단계 및 HPLC 열을 설정 합니다.
- 3 배 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 모니터링 (MRM) 분석 표 1 과 표 2에 나열 된 여러 반응의 매개 변수를 설정 합니다.
- 2.2.2.1 및 2.2.2.2 단계에서 설명한 대로 절차를 수행 합니다.
- '파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 'MRM', '긍정적'으로 극성으로 ' 대량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 전체 시간 분석을 '기간'을 설정 합니다. [M + H]+ 의 m/z 와 184 ' 1 분기 질량 (Da)'와 ' 3 분기 질량 (다)'의 대상 이자, SM 종으로 각각 설정. 10 ms 및 SM 종 대상의 이름으로 ' ID' '시간'을 설정 합니다.
- ' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: 해상도 1 분기의 모두 3 분기 단위로' ', 강도 임계값 0으로 시간 (ms), 0으로 설정 하 고 5 ms로 대량 범위 사이의 일시 중지.
- 'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 넣어 ' 소스/가스 ' 탭을 선택 합니다. 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 그리고 충돌 세포 출구 잠재적인 표 2에 나열 된 declustering의 매개 변수를 넣어 '컴파운드' 탭을 선택 합니다.
- 2.2.2.6 단계에서 설명한 대로 밸브를 설정 합니다.
- 2.2.2.7 단계에서 설명한 대로 액정 상태를 설정 합니다. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.
- 2.2.3 단계에서 설명한 대로 배치 파일을 만듭니다.
- LC-ESI-MS/MS 분석 단계 2.2.4에에서 설명 된 대로 각 SM의 MRM 데이터를 가져옵니다.
- 데이터 통합 소프트웨어를 사용 하 여 MRM 데이터를 처리 하 고 SM 종 각의 추출된 이온 크로마 피크 영역 데이터를 가져옵니다.
- 정량 분석에서 데이터 통합에 대 한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, '편집' 탭을 클릭 하 고 사용자 통합 기본값을 선택 합니다. 1.0 점으로 가우스 부드러운 너비를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다. '편집' 탭을 클릭 하 고 ' 새 결과 테이블 '을 선택 합니다. 샘플 통합, 화살표 단추를 누르고 '다음'을 선택 합니다. ' 만들 새로운 방법 '을 선택, 메서드의 이름을 설정 하 고 '다음'을 클릭 합니다. '다음'을 클릭 하 고 d18:1 /(D31)-16의 확인란: 0 그대로 SM '다음'을 클릭 하 고 '마침'을 클릭 합니다.
- '피크 검토 표시'를 클릭 하 고 크로마 봉우리는 적절 하 게 인식 하는 확인 하십시오. 주목 해야 한다 그 d18:1 /(D31)-16의 보존 기간: 0 SM에 의해 일반적으로 작습니다 ~ 34-1 SM 중에 비해 0.3 분 (d18:1 / 16:0 SM에 일반적으로 구성 됩니다).
- D18:1 /(D31)-16에 SM 종 각의 피크의 비율에 따라 각 SM 종 계량: 0 SM 내부 표준.
- '파일' 탭을 클릭, '내보내기', ' 결과 테이블 ', 'MultiQuant', '모든 열 수출' 열으로 포맷을 확인, '그 명시적으로 숨겨진 제외 하 고 모든 행을 내보내려면', 그리고 '확인'을 클릭 행.
- Excel 소프트웨어에서 내보낸된 파일을 엽니다. IS의 영역 SM 종 대상의 영역을 정상화 (d18:1 /(D31)-16:0 SM). 다음 대상 SM 종 주입 된 샘플에서의 양을 계산 하 주입된 샘플에 IS의 이론적인 금액을 곱하십시오.
- 표준 곡선을 건설
- D18:1 /(D9)-18의 MRM 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 LC-ESI-MS/MS 분석 하 여 표준 곡선을 만들기 위한 샘플에 SM.
- D18:1 /(D9)-18의 피크 면적의 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 SM 2.3.5 단계에서 설명한 대로.
- D18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.6으로 주입 된 샘플에서 SM.
- /(D9)-18 명목 금액 및 d18:1의 계산 된 금액으로 x 축과 y 축을 설정 하 여 추세선을 구성: 1 SM 추세선 수식의 얻을.
- 양적 방법 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 유효성 검사
- 방법의 유효성 검사에 대 한 d18:1 /(D9)-18의 양을 계량: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16: 0는 QC에 SM 샘플링 각 QC를 분석 하 여 1 일에 세 번 이상 샘플 및 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 최소 3 일을 반복.
- 피크 지역 데이터를 가져오고 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.5 2.3.6으로 삽입 된 샘플에 SM.
- 얻은 보정 곡선에 따라 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1 삽입 된 샘플에서 SM.
- 정밀 평가
- 평균 및 표준 편차 d18:1 /(D9)-18의 금액의 계산: 1 SM 2.5.3-하루의 데이터 집합에 단계에서 얻은 및 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 간 일.
- 2.5.4.1 단계에서 얻은 평균 표준 편차로 나눈 값 이며, %로 표시.
- 정확도의 평가
- 다음과 같이 각 데이터의 정확도 계산.
[(계산된 양 단계 2.5.3에서에서 얻은입니다.) / (명목 금액)-1] × 100(%) - 하루 간 날의 dataset에 정확도의 절대 값의 평균을 계산 합니다.
- 다음과 같이 각 데이터의 정확도 계산.
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Representative Results
화학적 합성 d18:1 / 24:0 SM (그림 1A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (그림 1B)에서 추출한 지질 샘플에서 LC-ESI-MS3 채용 [M + HCOO]- , [M-채널3]에 의해 분석 되었다- 첫 번째 및 두 번째 선구자 이온으로 각각. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449)의 스펙트럼 강도 SM N의 그것 보다 더 큰-acyl moiety (m/z 378). 또한, [M-콜린-채널3 (sphingosine 1 인산 염)]에 해당 하는 스펙트럼에- 는 SM의 LCB 할당도 유용. 우리는 또한 demethylated-SPC (m/z 449)의 스펙트럼 d18:1 SPC MS3 분석 (그림 1C)의 조건에서 주로 생산을 확인 했다.
2 isotopically 레이블된 SM 종을 사용 하 여 보정 곡선은 그림 2A에 표시 했다. 추세선 1 / x2가중치 요인으로 적용 하 여 얻은 했다. 잔류 분석의 결과 그림 2B에 표시 했다. 참고 잔존 가치에 가까운 정량 (0.1 pmol이 현재 연구에서)의 한계를 낮은 작은 1을 적용 하 여 /2x 가중치 요인으로.
얻은 보정 곡선 및 유효성 검사의 결과의 매개 변수는 표 3에 표시 했다. 정밀도 정확도의 값 ± 15%, 보여주는 현재 연구 LC MS8를 사용 하 여 정량 방법으로 기준을 충족 했다.
HeLa 세포에서 SM 종 각의 크기는 표 4에 표시 했다. HeLa 세포는 10%를 포함 하는 문화 미디어에서 성장 했다 FBS와 수확. d18:1 / 16:0 SM 및 d18:1 / 24:1 SM 대부분 하 고 두 번째 가장 풍부한 SM 종 그 구조 결정, 그리고 54% 및 총 SM의 14%를 각각 이루어져 있
그림 1 . HeLa 세포에서 SM의 특정 m/z 신호 MS3 스펙트럼. MS3 스펙트럼 화학적 합성된 d18:1 / 24:0 SM (A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (B)에서 추출한 지질 견본에 표시 됩니다. 결과 하 마 외. 에서 적응 했다 6 참고 SPC의 스펙트럼 강도 N의 그것 보다 더 큰-acyl moiety 화학적 합성된 d18:1 SPC의 SM. MS3 스펙트럼의 동일한 m/z와 이온을 채용 하 여 (C)에 표시 됩니다 ([M + HCOO]-m /z 499) 1, 2 선구자 이온으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 두 개의 isotopically 표시 된 SM 종을 사용 하 여 SM의 보정 곡선. (A) 사용 하 여 보정 곡선 2 isotopically 라는 SM 종 (d18:1 /(D9)-18:1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 SM). 보정 곡선 가중치 요소를 사용 하 여 건설 되었다 = 1 /2x. 유효성 검사의 결과 표 3에 나열 됩니다. (B) 생성 된 교정 곡선의 세상의 평가 대 한 잔류 분석. 가중치 요소를 사용 하 여 보정 곡선에 오차 = 1 /2 x 가중치 요소를 사용 하 여 사람 보다 작으면 = 1 / x 또는 특히 d18:1 /(D9)-18의 낮은 금액에서에서 1:1 SM. 여기를 클릭 하십시오이의 더 큰 버전을 보려면 그림.
| TurboIonSpray 설정 | ||||||
| 모드 | 커튼 가스 (psi) | 충돌 가스 | 이온 스프레이 전압 (V) | 온도 (° C) | 이온 소스 가스 1 (psi) | 이온 소스 가스 2 (psi) |
| MS3 | 40 | 높은 | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
표 1입니다. 분무 이온 소스 질적 및 양적 분석을 위한 사용의 조건. 이 테이블은 하 마 외. 에서 적응 6
| 모드 | 극성 | 선구자 이온 (1 분기) | 제품 이온 또는 2 선구자 이온 (3 분기) | declustering 잠재력 (V) | 잠재적인 입구 (V) | 충돌 에너지 (V) | 충돌 세포 출구 잠재력 (V) | 충돌 에너지 확산 (V) | 여기 시간 (밀리초) | 속도 (Da/초) | 시간 (s) | 해상도 |
| MRM | 긍정적인 | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | 단위 |
| MS3 | 네거티브 | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | 자동으로 caluculated | 단위 |
표 2입니다. MS3 , 3 배 4 중 극 및 4 극 자 선형 이온 함정에서 MRM 모드 매개 변수 대량 각각 질적 및 양적 분석, 사용 분석. 이 테이블은 하 마 외. 에서 적응 6
테이블 3입니다. 얻은 보정 곡선 및 유효성 검사의 결과의 매개 변수. 결과 하 마 외. 에서 적응 했다 6
| SM의 분자 종 | 금액 (pmol/mg 단백질) |
| d18:1 / 14:0 | 115.5 |
| d16:1 / 16:0 | 115.5 |
| d17:1 / 16:0 | 239.8 |
| d18:2 / 16:0 | 449.9 |
| d18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| d18:0 / 16:0 | 203.8 |
| d18:1 / 17:0 | 106.3 |
| d18:2 / 18:0 | 26.5 |
| d20:0 / 16:1 | 94.9 |
| d18:1 / 18:0 | 94.9 |
| d18:2 / 22:0 | 102.3 |
| d18:1 / 22:0 | 235 |
| d18:1 / 23:1 | 83.3 |
| d18:1 / 23:0 | 23.9 |
| d18:1 / 24:2 | 286.5 |
| d18:2 / 24:1 | 286.5 |
| d18:1 / 24:1 | 853.2 |
| d18:1 / 24:0 | 94.6 |
| d18:1 / 25: 1 | 12.9 |
표 4입니다. HeLa 세포에서 SM 종 각의 금액. HeLa 세포는 10%를 포함 하는 문화 미디어에서 성장 했다 FBS. 셀 수확 했다, 그리고 총 지질 분수 Bligh 및 염색 방법으로 추출 되었다. 결과 하 마 외. 에서 적응 했다 6
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Discussion
현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소 (보통 13C) plasmalogen-PC 감지할 수 있습니다 이론적으로 동시에 SM으로. 우리의 실험에서 plasmalogen PC의 MS3 제품 이온 동시에 SM 분석에서 관찰 되었다. 그것은 제대로 SPC의 스펙트럼 강도 인지 SM N보다 큰 에스엠의 MS3 제품 이온을 선택 하는 데 도움이-acyl moiety (그림 1A 와 B). 반면, 지방 acyl moiety의 강도 보다 큰은 (또는 거의 동일) demethylated lysoplasmalogen-PC (데이터 표시 되지 않음)의.
현재 정량 방법에 그것은 정확 하 게 보정 곡선을 건설 하 고 메서드를 유효성 검사에 대 한 샘플을 준비 하는 중요 한입니다. 또한, 가중치 요소 해야 제대로 사용을 구성할 수 보정 곡선; 낮은 농도에서 특히 피팅 곡선을 개선 하는 것이 유용 합니다. 우리는 서로 다른 가중치 요소를 사용 하 여 보정 곡선을 비교. 낮은 농도에서 피팅 곡선 가중치 요소를 사용 하 여 명확 하 게 개량 되었다 = 1 /2 사용 하 여 가중치 요인 비교 x = 1 또는 1 / x (그림 2B). 정밀도 정확도의 값 ± 15% 이내 이어야 한다. QC L의 농도 표준 곡선 (정량의 한)의 더 낮은 경계, ± 208이내 이어야 한다.
우리 총 지질 분수가이 연구에서 배양된 세포에서 추출 하는 Bligh & 다이어 방법을 채택. 지질 추출 Folch 메서드와 같은 다른 방법을 유용한9있습니다. 그것은 금액 및 샘플의 속성에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 지질 분수를 추출 해야 합니다. 동시에 각 주입에 분석 SM 종 수 데이터 수집을 위한 소프트웨어를 오버 로드 하는 것을 막기 위해 너무 커서 해서는 안됩니다. 예약 된 MRM 동시에 SM 종 수 quantitating 하는 데 유용 있을 것입니다.
MS3 분석을 사용 하 여 우리의 현재 메서드는 LCB와 N의 이중 결합 탄소 수를 추측 하는 데 유용-acyl moiety SM의 추가 장치 없이. 그러나, 이중 결합, 이성질체 (cis 또는 트랜스), 및 모양 (직선 또는 분기)의 위치와 같은 다른 구조 정보를 얻을 수 없습니다. 그것은 높은 에너지를 사용 하 여 제품 이온 및 추가 악기10,11,,1213를 사용 하 여 그들의 구조 정보를 얻을 필요가 있다. N해당 제품 이온의 분자 공식-acyl moieties [RCO2]- 이온 질소를 포함 하지 않는 했다. 그것은 현재 알려진 충돌 분리 진행을 유도 하는 방법입니다.
MS3 분석에 대 한 충돌 에너지 (CE) 및 MS3 조각 (ExT)에 대 한 구동 시간 매개 변수를 조정 중요 하다. 높은 CE 하면 초과 조각화 되며 2nd 선구자 이온으로 demethylated SM의 제품 이온의 농도. 또한, 조각화 패턴은 크게는 내선에 의존 실험을 하기 전에 그것은 CE demethylated SM, SPC, 및 N의 제품 이온의 강도 극대화 하는 ExT의 적절 한 상태를 확인 하는 것이 좋습니다-합성 SM을 일으키는 여 acyl moiety 모바일 단계에 녹아.
D18:1 /(D9)-18 사용: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 보정 곡선을 건설 하기 위하여 2 개의 isotopically 표시 된 SM 종족으로 SM. 이온화의 효율성은 SM 종 및 모바일 단계의 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 관심의 SM의 수는 제한 하는 경우 더 정확한 정량에 대 한 관심의 isotopically 표시 된 SM 종 준비 하는 것 이다.
SM 구조는 지금까지 선구자 이온 및 demethylated spc에 해당 하는 제품 이온 결정 되었습니다. 또한, 그것은 때로는 이후 관심의 대상 화합물 샘플 매트릭스에 풍부 하 게 존재 했다 존재 샘플 매트릭스에 정량의 하한값을 정확 하 게 결정을 방해 했다.
현재 연구는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 예측 하는 데 유용-acyl moiety 추가 악기 없이 MS3 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 다양 한 생물 학적 샘플 및 산업 제품에 독특한 SM 종의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.
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Disclosures
저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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