Summary
Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.
Abstract
Biz sphingomyelin (SM) niteliksel çözümleme ve kantitatif sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) tarafından bir yöntem mevcut. SM bir phosphorylcholine ve bir ceramide hidrofilik ve hidrofobik bileşeni olarak sırasıyla oluşan bir ortak sphingolipid var. SM türlerinin sayısı sphingoid uzun zincirli temel (LCB) içinde a değişiklik nedeniyle memeli hücreleri mevcut ve bir N-asil yan ceramide içinde. Bu raporda, biz karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısı tahmin etme yöntemi gösterir-asil yan onların karşılık gelen ürün iyonları MS/MS/MS (MS3) deneylerde dayalı. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi SM tür biyolojik örnekler ve kozmetik gibi endüstriyel ürünlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.
Introduction
Sphingomyelin (SM) memeli hücrelerinde ortak bir sphingolipid var. Sphingosine-1-fosfat ve bir ceramide bağışıklık içinde çok önemli rolleri olan kaçakçılığı hücre ve bariyer Homeostazı, sırasıyla2deri gibi SM sentezlenmiş intracellularly1 ve diğer organizmalardandır için bir habercisi olarak hediye. 3. Böylece, SM metabolizma kesin analizini organizmalardandır fizyolojik ve patolojik rolleri elucidating için önemlidir.
SM bir ceramide ve daha da bir sphingosine ve bir Noluşan ceramide 1-hidroksi grubuna bağlı bir phosphorylcholine oluşur-asil yan. Sphingosine ve Nkarbon ve çift bağ sayıları içinde a değişiklik-asil yan sonuç sütun sayısı ve ceramide (SM) tür. Son gelişmeler LC-ESI-MS/MS / SM4,5nicel ve nitel analiz sağladı. Kalitatif analiz, karbon sayısı ve çift bağı bir sphingoid SM LCB ürün iyon spectra LCB in atayarak tespit edilmiştir. Ancak, yapısal bilgi N-asil yan doğrudan elde değil onun karşılık gelen ürün iyonları rapor değil çünkü ve bu nedenle N-asil moieties habercisi iyonlar arasındaki fark analizi tarafından sonuca vardım ve Ürün iyonları LCB için her iki pozitif ve negatif iyon modları4,5' te karşılık gelen. Bu raporda, biz ürün iyonları LCB ve Nalgılamak için bir yöntem mevcut-asil yan triple quadrupole ve hassas yapısal kolaylaştırır quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak modunda aynı anda MS3 spekülasyon her SM türler6.
Biyolojik örnekler matrisinde neden iyon bastırma (veya geliştirme) etkileri LC-ESI-Bayan analizi doğru miktar engel ve bu nedenle, aynı matris ilgi bütün analitler için kalibrasyon eğriler oluşturmak için arzu edilir biyolojik örneği. Ancak, hemen hemen bütün SM türlerin biyolojik örneklerde, özellikle de kapsamlı bir analiz hazırlamak mümkün olduğundan bu strateji mümkün değil. Böylece, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak ve biyolojik örneklerde çivili bir temsilcisi SM türler kullanarak sayısal Aralık belirlemek pratiktir. İki isotopically etiketli SM türler bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan; bir dahili bir standart diğeri bir standart bileşik kullanıldı. Küçük bir miktar isotopically etiketli SM türlerin biyolojik örnekleri çivili ve başarıyla bir kalibrasyon eğrisi ve nicel aralığı6elde edilen standart bir bileşik tespit ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Örnek bulaşma deri kaynaklı SM tarafından en aza indirmek için eldiven giymek. HeLa hücreleri % 10 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM Ltamamlanan kartal'ın en az gerekli ortamda yetiştirilen mevcut iletişim kuralı uygulandığı-glutamin, 1000 U/L penisilin ve 100 mg/L streptomisin.
1. hazırlanması Lipid örnekleri
Not: Test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapakları dahil olmak üzere tüm cam ürünleri deterjan-Alerjik olması önemlidir.
- Toplam lipid kesir çekme--dan Bligh & Dyer yöntem7 kullanarak hücre homogenate
- Kültür kaldırma (veya şartına) medya 10 cm doku kültürü çanak ve durulama buz gibi PBS 6 mL ile iki kez.
- Buz gibi PBS 1 mL P1000 pipet tarafından 10 cm doku kültürü çanak içine ekleyin. Hücreleri hücre Kazıma aletleri ile hasat ve 2.0 mL silikonlu plastik tüpler içine toplamak.
- (1000 × g, 5 dk, 4 ° C) aralıklarla sonra süpernatant P1000 pipet tarafından kaldırın.
- 1 mL metanol ekleyin. Kısaca tüpler ve 200 W 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide.
Not: hücre Pelet verimli bir şekilde homojen bir banyo tipi sonicator su seviyesi ayarlayın. - Metanol içinde hücre homogenate pipet tarafından test tüpleri (13 mm x 100 mm) Teflon kaplı vidalı kapağı içine aktarın.
- 1 mL metanol, kloroform, Çift Kişilik distile su 0.8 mL ve 50 µL 10 µmol/L iç standart d18:1 /(D31)-16, 1 mL ekleyin: 0 SM her tüp içine.
- Girdap test tüpleri şiddetle oda sıcaklığında 5 min için.
Not: Bu noktada, bir tek fazlı (kloroform/metanol/su 1/2/0.8 (v/v/v) =) oluşur. - 1 mL kloroform ve 1.0 mL Çift Kişilik distile su ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle girdap tüpler.
Not: Bu noktada, sulu (üst) faz ve organik (alt) faz ayrılır. - (Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve daha düşük faz tek kullanımlık cam tüpler (ilk alt aşaması) içine aktarın.
Not: Pasteur pipet ve bir emanet pipet filtresi kullanarak alt aşaması toplamak. Pipet ucu alt aşama Ekle, üst aşaması ve pipet ucu içinde interfacial kabartmak sunmak için 'E' Vana yanındaki küçük ampul sıkmak ve pipet daha düşük faz sifon. - Kloroform test tüpleri ve girdap içine 2 mL tüpler yeterince üst aşaması ve interfacial kabartmak ile karışımı oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle ekleyin.
- (Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve değiştirilen düşük faz adım 1.1.10 açıklandığı gibi ilk alt aşaması ile tek kullanımlık cam tüplerin içine aktarın.
- Cam tüpler bir azot akış altında yerleştirin ve organik çözücüler toplanan alt aşamasında tamamen kaldırmak.
- Örnekleri sulandırmak 500 µL etanol ve metanol ile filtrate ile 0,02-µm filtre ve mağaza-20 ° C'de cam şişe içinde
- Kalibrasyon eğrisi oluşturma ve doğrulama yöntemi için numune hazırlama
- 0.1, 0.5, 1, 5, 10 veya standart bileşik 50 µmol/L, 50 µL ekleyin (d18:1 /(D9)-18:1 SM) test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapağı içine.
- Hücre homogenate her test tüpüne ekleyin ve 1 mL metanol ekleyin.
Not: Cep homogenate bir matris olarak her deney göre değişebilir. 10 cm kültür tabağına hücrelerden türetilmiş örneklerinde SM tür düzenli olarak analiz edilir, hücre homogenate her test tüpü içinde miktarı bu hücre 10 cm kültür tabağına yakın olması gerekir. - Toplam lipid kesir adımları 1.1.6-1.1.14 içinde açıklandığı gibi ayıklayın.
- Kalite kontrol (QC) örnekleri gibi adımları 1.2.1-1.2.3 descried yöntemi doğrulamak için hazır olun. Üç QC örnek standart bileşik farklı konsantrasyonları ile hazırlamak (d18:1 /(D9)-18:1 SM): bir 3 x (QC düşük, QC-L), Merkezi yakın bir standart eğri alt sınır içinde (QC-orta, QC-M) ve üst sınırına yakın bir Standart eğri (QC-yüksek, QC-H).
2. SM analiz LC-ESI-MS/MS tarafından
- Mobil faz hazırlanması
- Solvent karışımı (Asetonitril/metanol/GKD2O sulu faz ve isopropanol için organik faz için = 1/2/2 (v/v/v)) içinde cam şişe Teflon kaplı vidalı kapakları ve 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide.
- Formik asit (son konsantrasyonu 26,4 mmol/L) ve NH4OH ekleyin (14,9 mmol/L) her mobil faz içine.
- LC-ESI-MS3 SM kalitatif analiz
- Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sistemi etkinleştirmek, giriş tüpler mobil aşamalarını içeren cam şişe koymak ve HPLC satırları temizle. HPLC sistemi bir C18 HPLC sütun (1.5 mm kimlik × 100 mm Uzunluk, parçacık boyutu 3.0 µm) bağlantı, sıcaklığı 50 ° C sütun fırında tutmak ve sütun ile 100 µL/dak örnekleri autosampl bir örnek rafa koymak, sulu mobil faz durumu er.
- Triple quadrupole ve birinci ve ikinci habercisi yanı sıra Tablo 1 ve Tablo 2 iyonları ilgi SM türlerin listelendiği gibi MS3 analizi için quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistemi parametrelerini ayarlamak.
- Veri toplama yazılımı simgesini çift tıklatın, çift tıklayın 'Donanım yapılandırma', 'LC + QTRAP4500 + Vana' seçin ve 'Profil' etkinleştir'i tıklatın.
- 'Yeni alt projesi' ve 'Tamam' ı tıklatarak yeni bir alt klasör oluşturun.
- 'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MS/MS/MS (MS3)' tıklatın, oranı 10.000 Da/s, 'Negatif' olarak polarite ve sürekli olarak ' süre' analiz (dk) olmak inceden inceye gözden geçirmek. M/z 'Start (Da)' ve 'Dur (Da)' taranacak aralığı ayarlayın. SM tür ilgi hedefinin 1 ve 2 habercisi iyonların m/z ayarlayın.
Not: birden fazla SM tür analiz için vurgulamak '-MS3' simgesi, sağ tıklatın, 'Bu deney Kopyala' seçin ve daha sonra diğer SM türlerin 1. ve 2 habercisi iyonların m/z koyun. - 'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: tarama modu 'Profil', adım boyu 0,12 (Da), çözünürlük Q1 ve Q3 olarak olarak sırasıyla seçme yoğunluğu eşik 0, ayar süresi 50 (ms), 1,5 ms olarak kitle aralıkları arasında duraklama olarak 'Birimi' ve 'Edebiyat', ' dinamik doldurmak saat ', Q3 giriş engel olarak 8 V ve uyarma zamanı 25 ms olarak.
- 'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklayın ve select 'kaynak/gaz' sekmesini perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 parametrelerini ayarlamak. Sonra select 'Bileşik' sekmesini declustering potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji, uyarma enerji ve Tablo 2' de listelenen yayılmış çarpışma enerji parametrelerini ayarlamak.
- 'Entegre Valco Vana' vurgulayın ve 'Pozisyon adı için adım 0' A olarak seçin ve 'B' olarak pozisyon için toplam 5.0 dk zaman. Ayrıca pozisyon için toplam olarak 'A' ayarla 70.0 dk zaman.
- 'Shimadzu LC sistemi' vurgulayın. 'Pompa' sekmesini seçin ve pompalama modunu ayarlayın ikili akış, 0,28 mL/dk ve en fazla baskı limitler 20,0 MPa olarak olarak toplam akış olarak. 'Otomatik Örnekleyici' sekmesini seçin ve durulama 200 µL ayarlamak, 35 µL/s hızda durulama, örnekleme hızı 5.0 µL/s olarak kontur olarak 52 mm, iğne, 25,0 min zamanda tasfiye, 'Önce ve sonra aspirasyon' olarak 5 s ve durulama modu olarak dip zamanı durulayın.
- Ayrıca, soğutucu birimi etkinleştirmek, soğutucu sıcaklık 4 ° C ayarlayın ve denetim şişe iğne kontur 52 mm. seçtiğinizde 'Fırın' sekmesinde, fırın etkinleştirmek ve fırın sıcaklık ve en yüksek sıcaklığı 50 ° C ile 85 ° C anılan sıraya göre ayarla.
- 'Denetleyicisi' sekmesini seçin ve 'Güç' kutuyu işaretleyin. 'Zaman programı' sekmesini seçin ve solvent degradeleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çözücüler A / B 100/0 oranında 5 min için 80/20 için doğrusal değişiklik program üzerinde 4 dk 35/65 üzerinde 50 dk ve 25/75 için 1 dk. sonra , 25/75 10 dk sonra doğrusal olarak 100/0 tutunuz 4 dak. Sonra yöntem kaydedin.
- Toplu iş dosyası oluşturun
- 'Satın alma toplu yapı' simgesini çift tıklatın, 'Set Ekle','ı tıklatın 'Örnekleri' eklemek, yeni örnekleri ayarlamak ve 'Tamam' ı tıklatın.
- ' Yöntemi Düzenleyicisi ' düğmesini tıklatın ve kullanılacak yöntemi seçin. Bir toplu iş dosyasında birden çok yöntemi kullanılırsa, 'Birden fazla yöntemleri kullan' kutuyu işaretleyin ve her örnek için edinme yöntemini seçin. ' Örnek yeniden adlandırın ', 'Şişe konumunu' uygun bir sayı belirleyin ve enjeksiyon Birim miktar koymak. Ardından toplu iş dosyasını kaydedin.
- MS3 ürün iyon spectra ilgi SM türlerin LC-ESI-MS3 analizi tarafından elde.
- Toplu iş dosyasında 'Gönder' sekmesini seçin, örnekleri analiz satırı vurgulayın ve 'Gönder' düğmesini tıklatın.
- Tıklatın "View Quene' simgesini, 'Equilibrate' simgesi, kullanılması, saat 1 dk. ayarla ve 'Tamam' ı tıklatın için satın alma yöntemi seçin.
- 'İnce ayarlar için rezerv araç' karşılık gelen simgeyi tıklatarak devre dışı bırakın. Sonra toplu sırayı "Basit Başlat" simgesini tıklatarak yürütmek.
- Her MS3 ürün iyon spectra SM oranı (m/z) çarpımı iyon spectra şarj etmek için kitle ve sphingoid tam kitle karşılaştırarak atamak LCB ve N-asil yan ilgi. Karbonlar ve çift sayı Tahvil sphingoid LCB ve Nbelirlemek-ilgili ürün iyonları göre asil yan.
- Uygun alt proje klasörün işaretlendiğinden emin olun, 'Açık veri dosyası' simgesini çift tıklatın ve analiz edilecek örnekleri seçin. Zirve Kromatografik her hedef SM türler için sürükleyin ve sonra çift tıklatın. Elde edilen MS3 ürün iyon spectra sürüklenen alanı içinde sunulacak.
- Kantitatif analiz LC-ESI-MS/MS tarafından SM
- Mobil aşamaları ve HPLC sütun 2.1 ve 2.2.1. adımda açıklandığı gibi ayarlayın.
- Triple quadrupole ve quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistem izleme (MRM) çözümlemesi Tablo 1 ve Tablo 2içinde listelendiği gibi birden çok tepki için parametrelerini ayarlamak.
- 2.2.2.1 ve 2.2.2.2. adımda açıklandığı gibi ve prosedürlerini yürütecektir.
- 'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MRM', 'Pozitif' olarak polarite'yi seçin. 'Süre' çözümlenmesi için tüm zaman olarak ayarlayın. [M + H]+ m/z ve 184 'Q1 kitle (Da)' ve 'Q3 kitle (Da)' hedef SM tür ilgi anılan sıraya göre ayarlayın. 'Zaman' 10 ms ve hedef SM tür adı olarak ' ID' olarak ayarlayın.
- 'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: çözünürlük Q1 her ikisini ve Q3 'Birimi', yoğunluk eşik 0, olarak olarak saat (ms) 0 ayarlanması ve duraklatma 5 ms olarak kitle aralıkları arasında.
- 'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklatın ve parametre perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 koymak ' Kaynak/gaz' sekmesini seçin. Sonra potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji ve Tablo 2' de listelenen çarpışma hücre çıkış potansiyel declustering parametreleri koymak 'Bileşik' sekmesini seçin.
- Vana 2.2.2.6 adımda açıklandığı gibi ayarlayın.
- LC koşulu 2.2.2.7. adımda açıklandığı gibi ayarlayın. Sonra yöntem kaydedin.
- 2.2.3. adımda açıklandığı gibi toplu iş dosyası oluşturun.
- 2.2.4. adımda açıklandığı gibi LC-ESI-MS/MS analizi tarafından her SM türlerin MRM verileri alır.
- Veri tümleştirmesi için yazılım kullanarak MRM verileri işlemek ve ayıklanan iyon Kromatografik her SM türler için en yüksek alan verileri elde etmek.
- Veri tümleştirmesi kantitatif analiz yazılımı simgesini çift tıklatın, 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve Tümleştirme Kullanıcı Varsayılanlarını seçin. Gauss pürüzsüz genişlik 1,0 punto ayarlayın ve 'Tamam' ı tıklatın. 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve 'Yeni sonuçları tablo' seçin. Entegre edilebilir, bir ok düğmesini tıklatın ve 'İleri' düğmesini tıklatın örnek seçin. 'Yeni yöntem Oluştur' seçin, yöntemin adını ayarla ve 'İleri' yi tıklatın. 'İleri' düğmesini tıklatın ve d18:1 /(D31)-16 kutuyu işaretleyin: 0 SM olduğu gibi 'İleri' düğmesini tıklatın ve '' Son'u tıklatın.
- 'Tepe inceleme görüntüler' tıklatın ve Kromatografik doruklarına uygun şekilde tanındığını onaylayın. Bu unutulmamalıdır bu d18:1 /(D31)-16 tutma zamanı: SM tarafından genellikle daha küçük 0 ~ 34-1 SM biri ile karşılaştırıldığında 0.3 min (genellikle oluşur d18:1 / 16:0 SM).
- D18:1 /(D31)-16 her SM türlere zirvesine her SM tür oranı göre ölçmek: 0 SM iç standart.
- 'Dosya' sekmesini tıklatın, 'Ver' seçin, 'Sonuçları tablo' seçin, Biçim 'MultiQuant', 'tüm sütunları vermek gibi' sütun onaylamak, satır olarak 'Bu açıkça gizli dışında tüm satırları Aktar' ve 'Tamam' tıklatın.
- Dışa aktarılan dosyayı Excel yazılımında açın. SM tür hedef alan IS alanına göre normalize (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Sonra hedef eklenen örnek SM türler miktarını hesaplamak için IS enjekte örnek teorik miktarıyla çarpın.
- Standart eğri oluşturmak yoluyla
- D18:1 /(D9)-18 MRM veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 SM örneklerde standart eğri LC-ESI-MS/MS analizi tarafından adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi oluşturmak için.
- D18:1 /(D9)-18 pik alanının veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 2.3.5. adımda açıklandığı gibi SM.
- D18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.6 olarak eklenen örnek.
- /(D9)-18 x ekseni ve y ekseni nominal tutar ve d18:1 hesaplanan miktarı ayarlayarak eğilim çizgisini oluşturmak: 1 SM ve eğilim çizgisi formül elde edilir.
- Nicel yöntemi Excel yazılımı kullanarak doğrulama
- Yöntem doğrulamak için d18:1 /(D9)-18 miktarını ölçmek: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 QC SM örnekleri her QC analiz ederek örnek en az üç kez 1 günde ve adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi en az 3 gün tekrarlayın.
- En yüksek alan verileri elde etmek ve d18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.5 ve 2.3.6 olarak eklenen örnek.
- Kalibrasyon eğrisi elde göre d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM enjekte örnek.
- Hassas değerlendirilmesi
- Ortalama ve standart sapma d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM içi günün veri kümesinde 2.5.3. adımda elde edilen ve arası gün Excel yazılımı kullanarak.
- 2.5.4.1 adımda elde ortalama standart sapma tarafından bölünmüş ve % ifade.
- Doğruluk değerlendirilmesi
- Her veri doğruluğunu aşağıdaki gibi hesaplar:
[(2.5.3. adımda elde hesaplanan tutar.) / (Nominal tutar) - 1] × 100(%) - Veri kümesi içi günlük ve arası gün üzerinde doğruluk mutlak değerini ortalamasını hesaplamak.
- Her veri doğruluğunu aşağıdaki gibi hesaplar:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kimyasal sentez d18:1 / 24:0 SM (şekil 1A) ve d18:1 / 24:0 SM lipid örneklerinde HeLa hücreleri (şekil 1B) elde analiz LC-ESI-MS3 [M + HCOO]- istihdam ve [M-CH3] tarafından- birinci ve ikinci habercisi iyonları, olarak anılan sıraya göre. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) spektrum yoğunluğunu SM Ndaha büyük olduğunu unutmayın-asil yan (m/z 378). Buna ek olarak, [M-Kolin-CH3 (sphingosine-1-fosfat)] karşılık gelen spektrum- Ayrıca SM LCB atamak yararlı olduğunu. Biz de demethylated SPC (m/z 449) spektrum esas olarak d18:1 bizim MS3 analiz (şekil 1C) koşul altında SPC üzerinden üretilen doğruladı.
İki isotopically etiketli SM türler kullanarak kalibrasyon eğrisi Şekil 2içindeAgösterildi. Eğilim çizgisini 1 / x2ağırlığı faktörü olarak uygulayarak elde edildi. Kalıntı analiz sonucu Şekil 2' deBgösterildi. Alt limit Nefelometri (0.1 pmol mevcut bu çalışmada) yakın artık değeri daha küçük olduğunu 1 uygulayarak / x2ağırlığı faktörü olarak unutmayın.
Elde edilen kalibrasyon eğrisi ve doğrulama sonucu parametreleri Tablo 3' te gösterilmiştir. Hassasiyet ve doğruluk değerini % 15 ± da çalışmanın LC-MS8kullanarak Nefelometri yöntemi olarak kriterlerini karşıladı gösterilen, içinde vardı.
HeLa hücreleri her SM türler miktarını Tablo 4' te gösterilmiştir. HeLa hücreleri yetiştirilen kültür % 10 içeren medyada FBS ve hasat. D18:1 / 16:0 SM ve d18:1 / 24:1 SM yapısı belirlendi ve sırasıyla % 54 ve toplam SM, % 14 oluşur çoğu ve ikinci en bol SM türler
Resim 1 . MS3 spectra SM HeLa hücreleri içinde belirli m/z sinyallerin. MS3 spectra kimyasal olarak sentezlenmiş d18:1 / 24:0 SM(a)ve d18:1 / 24:0 SM HeLa hücreleri (B) çıkarılan lipid örnekte gösterilir. Sonuçları Hama ve ark. adapte edildi 6 SPC spektrum yoğunluğu Ndaha büyük olduğunu unutmayın-asil yan, kimyasal olarak sentezlenmiş d18:1 SPC SM. MS3 spectra ürününün iyonları aynı m/z ile istihdam ederek (C) gösterilir ([M + HCOO]-, m /z 499) 1. ve 2 habercisi iyonları olarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Kalibrasyon eğrileri iki isotopically etiketli SM türler kullanarak SM. (Kalibrasyon eğrisi kullanarakA) iki isotopically etiketli SM türler (d18:1 /(D9)-18:1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibrasyon eğrileri inşa ağırlığı faktörü kullanarak = 1 /2x. Doğrulama sonuçlar Tablo 3' te listelenir. (B) kalıntı analizi için inşa kalibrasyon eğrisi iyilik değerlendirilmesi. Ağırlığı faktörü kullanarak kalibrasyon eğrisi içinde kalanlar = 1 /2 x ağırlığı faktörü kullanarak olanlardan daha küçüktür = 1 / x veya 1, özellikle de d18:1 /(D9)-18 daha düşük bir miktar: 1 SM. burayı tıklayın bunları daha büyük bir sürümünü görüntülemek için şekil.
| TurboIonSpray ayarları | ||||||
| Modu | Perde gaz (PSI) | Çarpışma gaz | İyon sprey voltaj (V) | Sıcaklık (° C) | İyon kaynağı gaz 1 (PSI) | İyon kaynağı gaz 2 (PSI) |
| MS3 | 40 | Yüksek | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tablo 1. Nitel ve nicel analiz için kullanılan electrospray İyon kaynağı şartları. Bu tablo Hama ve ark. uyarlanmıştır 6
| modu | Polarite | öncü iyon (Q1) | Ürün iyon veya 2 habercisi iyon (Q3) | declustering potansiyel (V) | giriş potansiyel (V) | çarpışma enerji (V) | çarpışma hücre çıkış potansiyel (V) | (V) çarpışma enerji yaymak | Uyarma süresi (ms) | Hız (Da/sn) | zaman (s) | Çözünürlük |
| MRM | pozitif | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Birim |
| MS3 | negatif | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | otomatik olarak caluculated | Birim |
Tablo 2. MS3 ve MRM modunda triple quadrupole ve quadrupole doğrusal iyon kapanı parametrelerini kütle spektrometresi nitel ve nicel analiz için sırasıyla kullanılan. Bu tablo Hama ve ark. uyarlanmıştır 6
Tablo 3. Elde edilen kalibrasyon eğrisi ve doğrulama sonucu parametrelerini. Sonuçları Hama ve ark. adapte edildi 6
| SM moleküler türlerin | tutarı (pmol/mg protein) |
| D18:1 / 14:0 | 115.5 |
| D16:1 / 16:0 | 115.5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106.3 |
| D18:2 / 18:0 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94.9 |
| D18:1 / 18:0 | 94.9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83.3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94.6 |
| D18:1 / 25:1 | 12,9 |
Tablo 4. HeLa hücreleri her SM türler miktarını. HeLa hücreleri yetiştirilen kültür % 10 içeren medyada FBS. Hücre hasat edildi ve toplam lipid kesir Bligh & Dyer yöntemle ayıklandı. Sonuçları Hama ve ark. adapte edildi 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut nitel yöntemde, biz MS3 ürün iyonları bir SPC ve bir Nelde edilen-asil yan. Düzgün bir SPC ve bir Natamak için önemlidir-asil yan. Bu amaçla, bu diğer phosphorylcholine içeren moleküller de MS3 ürün iyonları tespit edilebilir olması gerekmektedir. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) ve plasmalogen-PC bol memeli hücrelerinde varsa ve onların hydrophobicity SM benzemektedir. Bu nedenle, diacyl-PC ve plasmalogen-PC ile bir izotop (genellikle 13C) teorik olarak aynı anda SM ile tespit edilebilir. Bizim denemelerinde MS3 ürün iyonları plasmalogen-PC aynı anda SM analizde tespit edildi. Düzgün MS3 ürün iyonları SM SPC spektrum yoğunluğunu SM Ndaha büyük olduğunu seçmek yararlıdır-asil yan (şekil 1A ve B). Buna ek olarak, yağlı açil-yan yoğunluğu daha büyük (veya hemen hemen aynı) bu demethylated lysoplasmalogen-PC (veri gösterilmez).
Mevcut nicel yöntemde kalibrasyon eğrisi oluşturma ve doğrulama yöntemi için örnekleri tam olarak hazırlamak için önemlidir. Buna ek olarak, ağırlığı faktörü düzgün kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılması gereken; Özellikle düşük bir konsantrasyon uydurma eğrisi artırmak yararlıdır. Biz farklı ağırlık faktörleri kullanarak kalibrasyon eğrileri göre. Düşük konsantrasyon uydurma eğrisi açıkça ağırlığı faktörü kullanarak geliştirilmiş = 1 /2 ile karşılaştırıldığında bu ağırlığı faktörü kullanarak x = 1 veya 1 / x (Şekil 2B). Hassasiyet ve doğruluk değeri ± %15 içinde olmalıdır. QC-L konsantrasyonu standart eğri (Nefelometri alt sınırı) alt sınır için aynı ise, ± % 208içinde olmalıdır.
Bu çalışmada kültürlü hücrelerden toplam lipid kısmını ayıklamak için yöntem Bligh & Dyer çalıştırmaya başladık. Diğer lipid çıkarılması Folch yöntemi gibi için de yararlı9yöntemlerdir. Uygun yönteme göre miktar ve/veya örnekleri özelliklerini kullanarak lipid kısmını ayıklamak önemlidir. Aynı anda her enjeksiyon analiz SM türlerinin sayısı veri toplama yazılımı aşırı yükleme önlemek için çok büyük olmamalıdır. Zamanlanmış MRM SM türlerinin sayısı aynı anda quantitating için faydalı olacaktır.
MS3 analizi kullanarak bizim mevcut yöntem karbon sayısı ve çift Tahvil LCB ve Nspekülasyon yararlıdır-SM asil yan ek aygıtlar olmadan. Ancak, çift tahvil, izomer (CIS veya trans) ve şekli (düz veya dallı) konumu gibi diğer yapısal bilgileri alınamıyor. Ürün iyonları ve ek araçlar10,11,12,13kullanarak onların yapısal bilgileri elde etmek için yüksek enerji kullanmak gereklidir. Moleküler formülü Niçin karşılık gelen ürün iyonların-asil moieties [RCO2] nitrojen içermeyen- iyonları yapıldı. Nasıl çarpışma ayrılma gelirleri indüklenen şu anda bilinmiyor.
MS3 analiz için çarpışma enerji (CE) ve uyarma zaman MS3 parçalanma (ExT) için parametreleri ayarlamak önemlidir. Daha yüksek bir CE fazla parçalanma neden ve 2nd habercisi iyon olarak demethylated SM ürün iyon yoğunluğunu azaltır. Buna ek olarak, parçalanma desen önemli ölçüde ExT. üzerinde bağlıdır Önce deneyler, CE ve demethylated SM, SPC ve Nürün iyonlarının yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ExT uygun durumunu belirlemek için arzu edilir-sentetik SM beslerken tarafından asil yan çözünmüş mobil aşamalarında.
Biz d18:1 /(D9)-18 kullanılır: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 SM iki isotopically etiketli SM tür olarak kalibrasyon eğrisi oluşturmak için. İyonlaşma verimliliğini SM türler ve mobil faz durumuna göre değişebilir. Böylece, SM ilgi sayısı sınırlı ise, ilgi isotopically etiketli SM türler daha doğru Nefelometri için hazırlamak için arzu edilir.
SM yapısı defa habercisi iyon ve demethylated SPC için karşılık gelen ürün iyon göre tespit edilmiştir. Ayrıca, bazen ilgi hedef bileşikleri örnek matris içinde bol bol mevcut olduğundan tam Nefelometri varlığı örnek matris alt sınırı belirlemek için engel oldu.
Bu da çalışmanın karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısını tahmin etmek yararlıdır-asil yan bağlı olarak onların karşılık gelen ürün iyonları MS3 deneylerde ek araçlar olmadan. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi çeşitli biyolojik örnekler ve endüstriyel ürünler eşsiz SM türlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya (KAKENHI) K.H. (#15 K 01691) için Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) ve bir hibe Bakanlığı inatçı hastalığı projeden incelenmesi için bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Sağlık, iş gücü ve refahı (K.Y. #201510032A). Edanz grubu (www.edanzediting.com/ac) bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
