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Developmental Biology

आंशिक Lobular Hepatectomy: सुघड़ जिगर पुनर्जनन के लिए एक शल्य मॉडल

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57302
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 3Comprehensive Pneumology Center, Institute of Lung Biology and Disease, Helmholtz Zentrum München, 4German Center for Lung Research (DZL)

Summary

यहां, हम नवजात (0 दिन) चूहों में छोड़ दिया यकृत पालि के आंशिक लकीर के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करते हैं । इस नए प्रोटोकॉल नवजात की स्थापना में तीव्र जिगर की चोट और चोट प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

रूपात्मक अंग पुनर्जनन निंनलिखित तीव्र ऊतक हानि कम रीढ़ के बीच आम है, लेकिन शायद ही कभी स्तनधारी जन्मोत्तर जीवन में मनाया जाता है । ७०% आंशिक hepatectomy परिणाम के बाद वयस्क जिगर पुनर्जनन चयापचय गतिविधि की बहाली के साथ शेष पालियों में कुछ प्रतिकृति के साथ hepatocyte अतिवृद्धि में, लेकिन घायल पालि आकृति विज्ञान और वास्तुकला के स्थाई नुकसान के साथ । यहां, हम विस्तार neonate में एक नई शल्य चिकित्सा पद्धति है कि एक शारीरिक उत्थान के लिए अनुकूल वातावरण छोड़ देता है । इस मॉडल को छोड़ दिया पालि सर्वोच्च और बाद में रूढ़िवादी प्रबंधन आहार के विच्छेदन शामिल है, और प्रमुख जिगर वाहिकाओं या रासायनिक चोट के बंधाव के लिए आवश्यकता का अभाव है, एक शारीरिक वातावरण जहां पुनर्जनन हो सकता है छोड़ने । हम किशोर पर विच्छेदन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार (P7-14) चूहों, जिसके दौरान अंग पुनर्जनन से घायल जिगर संक्रमण अतिवृद्धि द्वारा क्षतिपूरक विकास के लिए. प्रस्तुत, संक्षिप्त 30 मिनट प्रोटोकॉल एक रूपरेखा के उत्थान के तंत्र का अध्ययन प्रदान करता है, अपनी उंर स्तनधारियों में गिरावट से जुड़े, और ख्यात यकृत स्टेम या progenitors के लक्षण वर्णन ।

Introduction

करने के लिए एक अंग पुनर्जंम, या फार्म और समारोह बहाल करने की क्षमता, ज्यादातर विकासवादी समय पर खो सोचा गया है । तीव्र रासायनिक या शारीरिक चोट के बाद वयस्क स्तनधारी जिगर की अपक्षयी क्षमता अतिवृद्धि की लहरों और कोशिका विभाजन के कुछ दौर में जिसके परिणामस्वरूप शेष सभी हेपैटोसाइट्स के जुड़ाव को शामिल करने के लिए पाया गया है, एक कार्यात्मक लेकिन वास्तु अलग अंग1,2,3,4,5. हाल ही में, अध्ययनों से नवजात स्तनधारी अंगों के जीवन के पहले सप्ताह के भीतर चोट करने के लिए6,7,8के अपक्षयी प्रतिक्रिया विशेषताएं शुरू कर दिया है । इन अध्ययनों से पता चला है कि जब नवजात विकास के दौरान घायल, कुछ स्तनधारी अंगों रूपात्मक पुनर्जनन के बजाय क्षतिपूरक वृद्धि या फाइब्रोसिस7,8के साथ प्रतिक्रिया ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि दोनों वैश्विक संरचना और समारोह के पुनर्जनन जल्दी नवजात अवधि6,7,8के दौरान होता है । जिगर की चोट प्रोटोकॉल की स्थापना की रासायनिक चोट या इथेनॉल9,10,11, एसिटामिनोफेन12,13,14,15 के प्रशासन शामिल , कार्बन टेट्राक्लोराइड16,17,18,19, ७०% आंशिक hepatectomy4,20,21, या बाएं से हटाने और माध्य पालि । रासायनिक प्रशासन hepatocyte कोशिका मृत्यु की ओर जाता है, लेकिन अक्सर सूक्ष्म और स्थूल संरचनाओं बरकरार छोड़ देता है । सुघड़ पुनर्जनन आसानी से इस संदर्भ में अध्ययन नहीं किया जा सकता है, के रूप में समग्र यकृत वास्तुकला obliterated नहीं था । ७०% आंशिक hepatectomy प्रमुख जहाजों की सीवन बंधाव शामिल है, जो रक्तस्राव को रोकने के लिए आवश्यक है, लेकिन vasculature के स्थायी विघटन के साथ एक गैर-शारीरिक वातावरण छोड़ देता है । इसके अलावा, इस विधि केवल वयस्क कुतर पर इस्तेमाल किया गया है, और नवजात शिशुओं के लिए अपने आवेदन तकनीकी रूप से बेहद मुश्किल है । इस के साथ मन में, हम एक विधि है जिसमें बाएं पालि के शीर्ष के 20-30% एक नवजात P0 माउस (चित्र 1a-1b) में हटा दिया है विकसित की है । इस विधि शल्य चिकित्सा रूढ़िवादी है, न्यूनतम इनवेसिव, नहीं तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और vasculature के बंधाव बिना आकृति विज्ञान के सकल नुकसान की ओर जाता है, होने के लिए पुनर्जनन के लिए कमरे में जा. परिणामस्वरूप कदम दर कदम प्रोटोकॉल, नीचे वर्णित है, किसी भी शोधकर्ता के लिए नवजात चूहों पर एक आंशिक lobular hepatectomy प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है ताकि प्रसव के बाद के जीवन के प्रारंभिक दौर में स्तनधारी नवजात उत्थान के अध्ययन के लिए । इस विधि भी पुनर्अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल जीवविज्ञान में तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए स्पष्ट आवेदन किया है, क्योंकि यह जीवन के बाद के चरणों के दौरान जिगर में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

सबसे आम तीव्र जिगर की चोट के अध्ययन रासायनिक-प्रेरित नुकसान कर रहे हैं, वयस्क जिगर विच्छेदन, या ७०% आंशिक hepatectomy. रासायनिक नुकसान अक्सर नसों, intraperitoneal या एसिटामिनोफेन, कार्बन टेट्राक्लोराइड, या इथेनॉल के मौखिक प्रशासन शामिल है, और एक अपेक्षाकृत आसान और गैर इनवेसिव चोट मॉडल है । के रूप में पहले से चर्चा की, hepatocyte कोशिका मृत्यु में रासायनिक नुकसान परिणाम है, लेकिन अक्सर स्ट्रोमा और पैरेन्काइमा संरचनाओं बरकरार छोड़ देता है, यह मुश्किल सुघड़ पुनर्जनन के बारे में दावा करने के लिए बना । रासायनिक नुकसान अक्सर यकृत वाहिकाओं पर केंद्र, यह एक उपयोगी तकनीक साइट और सेल विशेष चोट का अध्ययन करने के लिए बना रही है, लेकिन यह भी मुश्किल से पूछताछ करने के लिए बनाता है, पूरे अंग स्तर पर, अन्य आबादी है कि आगे जहाजों से स्थित हो सकता है और कि हो सकता है उत्थान में योगदान करें । इन सीमाओं के बावजूद, रासायनिक नुकसान अभी भी एक उपयोगी और उच्च शारीरिक रूप से प्रासंगिक चोट मॉडल रहता है ।

वयस्क ७०% आंशिक hepatectomy यकृत vasculature के बंधाव निंनलिखित छोड़ दिया और औसत पालियों को हटाने शामिल है । hepatectomy की प्रतिक्रिया अच्छी तरह से किया गया है: विच्छेदित जिगर 14 दिनों के बाद ७०% आंशिक hepatectomy कि मूल क्षति पालि के से एक निहायत अलग वास्तुकला विकसित करता है, शेष सही और caudate पालियों के हेपैटोसाइट्स के रूप में अतिवृद्धि और सेल डिवीजन4,5के कुछ दौर से गुजरना । इस बनाता है बड़े पैमाने पर खो दिया है और समारोह, लेकिन दो काट पालियों पुनर्जीवित करने में विफल रहता है, और इसलिए सकल आकृति विज्ञान की जगह नहीं है । नतीजतन, ७०% आंशिक hepatectomy के लिए चोट प्रतिक्रिया सीमित पुनर्जनन के साथ क्षतिपूरक विकास तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है ।

यहां, हम पूरी तरह से एक नवजात आंशिक lobular hepatectomy के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रक्रिया उचित पशु चयन और तैयारी, शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयारी, शल्य चिकित्सा, और वसूली शामिल है । अनुकूलन और इन चरणों में से प्रत्येक के अनुकूलन प्रोटोकॉल के विभिंन अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है ।

हम बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया है और इस प्रोटोकॉल अनुकूलित वंय प्रकार C57BL/6J पिल्ले (JAX ०००६६४) पर, तथापि, विभिंन कोशिका आबादी और उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम भी विभिंन Cre बंदरगाह चूहों सहित विभिंन ट्रांसजेनिक जानवरों का इस्तेमाल किया और CreERT2 transgenes और/या दस्तक-ins (Axin2CreERT2 JAX ०१८८६७, और Sox9CreERT2 JAX ०१८८२९) फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयोजन में, जैसे इंद्रधनुष और mTmG सिस्टंस (R26VT2/GK3, R26 एमटी/मिलीग्राम) 22 , 23. हम अलग माउस उपभेदों के लिए इस पद्धति को बदलने की जरूरत नहीं पाया, अस्तित्व के परिणामों या अपक्षयी क्षमता में कोई मतभेद के रूप में मनाया गया ।

विभिन्न पशु उपभेदों का उपयोग करने के अलावा, हम भी 4-hydroxy-tamoxifen और 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) के रूप में छोटे अणुओं, के साथ इलाज नवजात चूहों पर आंशिक lobular hepatectomies प्रदर्शन किया. Dimethyl sulfoxide (DMSO) और इथेनॉल सॉल्वैंट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया, के रूप में यह पाया गया कि मकई तेल रुग्णता का एक महत्वपूर्ण कारण था । हम अंयथा पाया है कि छोटे अणुओं के intraperitoneal प्रशासन अस्तित्व या अपक्षयी परिणामों को प्रभावित नहीं किया । हम भविष्यवाणी है कि इस प्रोटोकॉल अंय छोटे अणुओं के साथ उपयोग के लिए पुनर्जनन के विभिंन पहलुओं से पूछताछ के लिए अनुकूलित किया जाएगा ।

नवजात माउस सर्जरी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और पशु हैंडलिंग और सूक्ष्म विच्छेदन में विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता हो सकती है । पशुपालन विशेषज्ञता के लिए सर्जरी के बाद मातृ और तत्काल वसूली की अवधि के दौरान नरभक्षी से बचने के लिए आवश्यक है ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) और प्रयोगशाला पशु पर स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के प्रशासनिक पैनल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों के साथ सख्त अनुसार में किया गया देखभाल (APLAC), (प्रोटोकॉल संख्या #10266) और संयुक्त राज्य अमेरिका में, या यूरोपीय पशु कल्याण अधिनियम, निर्देश 2010/ इस प्रोटोकॉल को समिति द्वारा बावरिया, जर्मनी की सरकार के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर अनुमोदित किया गया था और अनुमति प्राप्त नहीं: 55.2-1-54-2532-150-2015 ।

1. पशु तैयारी

  1. एक हीटिंग पैड पर उचित बिस्तर के साथ एक खाली पिंजरे तैयार करते हैं ।
  2. दस्ताने के साथ पशुओं को छूने से पहले, दस्ताने पर मां बिस्तर रगड़ना ।
  3. अपनी मां से सभी पिल्ले निकालें और खाली पिंजरे में जगह है । माँ के बिस्तर के कुछ निकालें और पिल्ले के साथ खाली पिंजरे में जगह है ।
  4. एक अलग, साफ, शुष्क पिंजरे में मां को सर्जिकल मैदान से दूर रखें ।
  5. नई, साफ बाँझ दस्ताने शल्य फील्ड तैयारी करने से पहले डॉन ।

2. सर्जिकल फील्ड तैयारी

  1. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. पिपेट 10 सेमी पेट्री डिश में betadine या समकक्ष विरोधी सेप्टिक समाधान के 2 मिलीलीटर ।
  3. सर्जिकल मैदान पर एक विदारक गुंजाइश रखें । विदारक गुंजाइश लैंप चालू करें और सर्जन के आराम करने के लिए प्रकाश के स्तर को समायोजित करें । एक पिल्ला विदारक गुंजाइश दीपक के नीचे शल्य क्षेत्र में रखा जा सकता है । पर्याप्त प्रकाश पिल्ला के ventral सतह पर छाया के अभाव से पुष्टि की जा सकती है ।
  4. isoflurane संज्ञाहरण चैंबर तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) एक नाक शंकु के साथ । चैंबर मूत्र या मल के सबूत के बिना साफ किया जाना चाहिए । नाक शंकु और संबद्ध टयूबिंग सर्जिकल क्षेत्र में विदारक गुंजाइश के तहत रखें । ऑक्सीजन का प्रवाह डायवर्ट करें और पूरी तरह नाक कोन तक isoflurane ।
  5. लगभग ३७ ° c पर सेट हीटिंग पैड के साथ एक पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी क्षेत्र तैयार करें । बाद ऑपरेटिव वसूली हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखा धुंध के 4 टुकड़े से मिलकर होना चाहिए । यदि संभव हो, मां के बिस्तर में धुंध पैड रगड़ना, मल, और मूत्र मां की गंध को बनाए रखने के लिए ।
    नोट: यह यह मुश्किल तापमान को नियंत्रित करने के लिए बनाता है के रूप में, एक गर्मी लैंप का उपयोग करने की सलाह दी बीमार है. ऊंचा तापमान नवजात चूहों की मौत का परिणाम होगा ।
  6. तैयार करने और एक आटोक्लेव के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल । उपकरण की जरूरत में शामिल हैं: सूक्ष्म विदारक कैंची, सूक्ष्म विदारक संदंश, धुंध, hemostat, और किसी भी 6-0 monofilament गैर अवशोषित टांका । सर्जिकल उपकरणों किसी भी गिलास मनका नसबंदी के साथ resterilzed जा सकता है ।

3. आंशिक Lobular Hepatectomy

  1. Anesthetize अपनी पीठ पर नाक शंकु में रखकर पिल्ला और धीरे से अपने पैर और हाथ जगह में टेप । पिल्ला ऑक्सीजन में 5% isoflurane प्राप्त किया जाना चाहिए ।
    1. पिल्ला 5 मिनट के लिए या पर्याप्त रूप से anesthetized है, जो एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण द्वारा सत्यापित किया जा सकता है जब तक बैठने की अनुमति दें ।
    2. 5 मिलीग्राम/किलो carprofen के चमड़े के नीचे से पहले चीरा करने के लिए सुई ।
      नोट: पूरे शल्य चिकित्सा 30 मिनट से अधिक नहीं ले जाना चाहिए । गरीब परिणाम नवजात शिशुओं में मनाया जा सकता है कि सामांय संज्ञाहरण के तहत 30 से अधिक मिनट के लिए कर रहे हैं । सावधानियों लेने के लिए पूरी तरह से क्षेत्र की तैयारी और त्वचा के गीला करने से पहले बंद करने के लिए सीवन प्रेरित त्वचा आंसू के माध्यम से शल्य चिकित्सा की लंबाई कम ।
  2. धीरे से एक छोटा धुंध पैड के साथ गीला के पीछे पेट की दीवार से साफ betadine । betadine 1 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
  3. एक वाम मध्य clavicular ०.५ सेमी तुरंत रिब पिंजरे के नीचे सूक्ष्म विदारक कैंची और संदंश के साथ नीचे चीरा बनाओ । धीरे संदंश का उपयोग कर त्वचा को अलग और पेरिटोनियल गुहा में एक दूसरे गहरी चीरा बनाने ( चित्रा 1C, वाम और केंद्र देखें)
  4. धीरे पीठ का उपयोग कर पेट के दोनों किनारों से पार्श्व दबाव लागू, सूक्ष्म विदारक कैंची और संदंश के कुंद समाप्त होता है पेरिटोनियल गुहा के बाहर छोड़ दिया पालि के शीर्ष बल । बाएं पालि के बाएं शीर्ष आसानी से visualized किया जाना चाहिए (चित्रा 1C, सही) ।
  5. शीर्ष से, विच्छेदन और ऊतक की मात्रा को हटाया जा करने के लिए वजन ।
    1. सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का प्रयोग, धीरे बाएं पालि के शीर्ष से ऊतक के वांछित राशि काटना ।
    2. विच्छेदित ऊतक एक १.५-ए. ए. में पंजाबियों से भरा ट्यूब प्लेस । एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर काट ऊतक वजन ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: शेष राशि पर जाली या कागज का एक टुकड़ा रखें और उसे बारदाना दें । फिर जाली या कागज पर विच्छेदित ऊतक रखें और इसके द्रव्यमान को मापने ।
    3. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर 2% paraformaldehyde में विच्छेदित क्षेत्र को ठीक करें और जमे हुए खंड विश्लेषण के लिए सूखी बर्फ पर इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में जगह । किसी भी मानक cryostat का उपयोग 7-10 µm वर्गों काटने से जमे हुए वर्गों का विश्लेषण ।
  6. धुंध का एक टुकड़ा लुढ़का का उपयोग करना, धीरे पेरिटोनियल गुहा में छोड़ दिया पालि की जगह । गुहा में जब तक खून बह रहा बंद हो जाता है धुंध छोड़ दें ।
  7. धुंध निकालें और सर्जिकल साइट गीला और पंजाबियों के साथ लथपथ धुंध के साथ आसपास के क्षेत्र ।
  8. 6-0 monofilament, एक चल सिलाई के साथ गैर अवशोषित टांके के साथ सर्जिकल साइट बंद करो । इसके लिए अलग से त्वचा और योनि बंद होनी चाहिए ।
    नोट: धीरे से पंजाब के साथ लथपथ धुंध के साथ त्वचा गीला टांका प्रेरित आंसू कम कर सकते हैं ।
  9. धीरे लेकिन अच्छी तरह से पंजाबियों के साथ लथपथ धुंध के साथ पिल्ला साफ और कोई रक्त या betadine सुनिश्चित रहता है । भिगो धुंध पैड रोल और घाव हस्ताक्षर पर धीरे साफ़ करने के लिए बंद किसी भी रक्त या betadine साफ ।
    नोट: यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के रूप में मां पिल्ले cannibalize सकता है अगर वे अपर्याप्त रूप से साफ कर रहे हैं ।
  10. नाक शंकु से पिल्ला निकालें और यह वसूली क्षेत्र है कि धुंध पैड मां के मल और मूत्र को उजागर शामिल है पर जगह है । एक बार पिल्ला ठीक हो, मां के बिस्तर के साथ खाली पिंजरे में पिल्ला की जगह ।
    नोट: एक गर्मी लैंप का उपयोग न करें । एक गर्मी लैंप का उपयोग neonate के लिए गरम करना पैदा कर सकता है ।
  11. पिल्ले की वांछित संख्या पर प्रक्रिया को दोहराएँ । सभी पिल्ले इस्तेमाल किया जा सकता है, यह आम तौर पर संचालित पिल्ले के साथ प्रतिस्थापित किया जा करने के लिए पर संचालित नहीं कुछ पिल्ले छोड़ने के लिए सलाह दी जाती है.
  12. सभी पिल्ले मां के पिंजरे में अपनी मां के बिस्तर के साथ एक साथ बदलें ।

4. रिकवरी और विश्लेषण

  1. चूहों पर रोज फॉलो करें.
    1. जांच करें कि घाव बंद रहता है और किसी भी मृत पिल्ले को हटा दें, अगर मौजूद है ।
    2. यदि घाव फिर से खोल, शल्य साइट और वसूली क्षेत्र पहले वर्णित के रूप में तैयार है, और ३.८ चरणों को दोहराने के लिए ३.१२ ।
    3. सुई 5 मिलीग्राम/carpofen के चमड़े के नीचे 24 और ४८ ज की प्रक्रिया के बाद ।
    4. ५६ दिन या अधिक के लिए पिल्ले का पालन करें ।
  2. कार्बन डाइऑक्साइड (2) जोखिम और ग्रीवा विस्थापन द्वारा पोस्ट-ऑपरेटिव दिनों की वांछित राशि के बाद पशुओं को Euthanize ।
    1. प्रेरण/इच्छामृत्यु चैंबर में चूहों प्लेस और सह2 पर बारी जब तक चूहों साँस लेना बंद करो.
    2. गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु सुनिश्चित करना । सामने उंगली और अंगूठे का उपयोग कर माउस की पृष्ठीय गर्दन पर नीचे पुश और दूसरे हाथ का उपयोग कर, पूंछ पर नीचे खींचो ।
  3. पूरे जिगर ब्लॉक एन निकालें और यह वजन ।
    1. ध्यान से प्रत्येक पालि और अलग तौलना ।
      नोट: डायाफ्राम और यकृत और पोर्टल वाहिकाओं के सावधान विच्छेदन से जिगर को हटा दें । एक दूसरे से अपने समीपस्थ लगाव पर प्रत्येक पालि ध्यान से पालियों अलग ।
  4. पूरे जिगर के द्रव्यमान के लिए काट दिया छोड़ पालि के द्रव्यमान की तुलना करके उत्थान की हद तक का निर्धारण । एक घायल छोड़ पालि पूरे जिगर के लगभग 30% है ।

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Representative Results

चित्र 1a विवरण नवजात आंशिक lobular hepatectomy की एक सामांय समयरेखा ( चित्र 1bमें योजनाबद्ध), और समय की उंमीद की लंबाई के लिए पुनर्जनन जब तक इंतज़ार किया है मनाया । वाम पालि के सूक्ष्म उत्थान 7-14 दिनों के बाद सर्जरी मनाया जा सकता है । पूर्ण पुनर्जनन अक्सर ५६ दिनों के बाद सर्जरी के बाद मनाया गया था । चूहों सर्जरी के बाद शारीरिक विषमता का कोई संकेत नहीं दिखाना चाहिए ।

चूहों आंशिक lobular hepatectomies के दौर से गुजर 2, 7, 14, ३५, और ५६ दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दी गई । वसूली के बाद इन चूहों से घायल वाम पालियों के Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) चित्रा 2में दिखाया गया है । विशेष रूप से, ५६ दिनों के बाद, विच्छेदित वाम पालि नियंत्रण, घायल पालियों से अलग लग सकता है । P14 किशोर चूहों पर किया सर्जरी तुलना के लिए किया गया था और 7, 14, और ५६ दिनों के बाद सर्जरी (आंकड़ा एस1) के लिए ठीक करने की अनुमति दी ।

नवजात पुनर्जनन को चिह्नित करने के लिए, ४५ चूहों 0 दिन में आंशिक lobular hepatectomy से गुजरा और अपने सभी पालियों के जनता ५६ दिनों के बाद सर्जरी लिया गया । घायल वाम पालि के जन जब अंय घायल माध्य, ठीक है, और caudate पालियों (चित्रा 3) और घायल नियंत्रण, P56 में एक घायल वाम पालि के द्रव्यमान के निकट की तुलना में बड़े पैमाने पर एक वृद्धि हुई परिवर्तन के लिए चला गया । यह इंगित करता है कि नवजात जिगर की चोट के बाद पुनर्जनन बाईं पालि के लिए स्थानीयकृत है । P14 किशोर चूहों पर किया सर्जरी तुलना के लिए किया गया था, जो छोड़ दिया पालि में कम पुनर्जनन दिखाया और घायल पालियों से मुआवजा बढ़ा (चित्र बी), यह दर्शाता है कि द्वारा 14 दिनों, तीव्र लकीर को चोट प्रतिक्रिया पालि विशिष्ट पुनर्जनन से वैश्विक क्षतिपूर्ति करने के लिए बंद कर दिया । इसके अलावा लक्षण वर्णन कोशिका झिल्ली (चित्रा 4a) कल्पना करने के लिए रेशा actin (एफ actin) के साथ पोस्ट-ऑपरेटिव दिवस ५६ में घायल चूहों से छोड़ दिया पालि के दाग क्षेत्रों द्वारा किया गया था । चोट के क्षेत्र में बाहर और समीपस्थ क्षेत्रों के लिए घायल नियंत्रण और वयस्क पालियों की तुलना में 14 दिन ७०% आंशिक hepatectomies के बाद किया गया । हेपैटोसाइट्स को घायल नियंत्रण के रूप में इसी तरह के क्षेत्रों में पाया गया, के बारे में 1.5-वयस्क शास्त्रीय ७०% आंशिक hepatectomy (चित्रा 4B) निंनलिखित पुनर्जनन दौर से गुजर चूहों से भी कम है । इससे पता चलता है कि अतिवृद्धि उत्थान में भूमिका नहीं निभाते । अंत में, नवजात चूहे ९०% पंजाबियों और 10% इथेनॉल और 1, 3, 5, 7, और 14 दिनों के बाद सर्जरी में 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) के ०.०२५ मिलीग्राम के साथ इंजेक्शन थे । 7 दिनों के बाद सर्जरी (चित्र 4c) के लिए पुनर्प्राप्त करने के लिए अनुमत चूहों से EdU धनात्मक कक्षों की संख्या गिनाई गई. जब घायल नियंत्रणों की तुलना में EdU धनात्मक कक्षों की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई तो घायल/पुनः चूकने के बाद, यह दर्शाता है कि कोशिका प्रसार नवजात उत्थान में योगदान देता है ।

Figure 1
चित्र 1: आंशिक Lobular Hepatectomy अवलोकन. (क) एक सामांय योजनाबद्ध और आंशिक lobular hepatectomy की समयरेखा नवजात जिगर P0 में किया लकीर के साथ दिखाया गया है । िरा P7, P14, P35, या P56 पर किया गया । P7 और P14 पर भी लकीरें आजमाई गईं. (ख) बाएं पालि की लकीर की सीमा के एक योजनाबद्ध, demarcating 20 और 30% लकीरें दिखाया गया है । (यह आंकड़ा Tsai एट अलसे संशोधित किया गया है.) 6. (ग) दिखा नवजात सर्जरी से छवियां: ठीक तरफा मध्य clavicular चीरा (बाएँ, केंद्र) और वाम पालि एपेक्स (दाएँ) के जोखिम. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: उत्थान निंन आंशिक Lobular Hepatectomy । P0 पर आंशिक lobular hepatectomies से गुजर चूहों 2, 7, 14, ३५, और ५६ दिनों के लिए पीछा किया गया । जिगर तय किया और एच एंड ई के साथ दाग, और वाम सर्वोच्च के उत्थान की हद तक उल्लेख किया गया था । तीर क्षेत्रों जहां पुनर्जनन P0 चूहों में हुई निरूपित । स्केल बार 1 सेमी है । यह आंकड़ा Tsai एट अल से संशोधित किया गया था । ६ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रति पालि पुनर्जनन आंशिक Lobular Hepatectomy के बाद । (एक) P0 पर आंशिक lobular hepatectomies के दौर से गुजर चूहों 7, ३५, और ५६ दिनों के बाद-ऑपरेटिव में विश्लेषण किया गया । चूहों euthanized थे और घायल चूहों (लाल) से सभी पालियों के बड़े पैमाने पर लिया और घायल नियंत्रण (लाल) की उंर के मिलान जनता की तुलना में किया गया । बी P14 पर आंशिक lobular hepatectomies के दौर से गुजर चूहों 7, ३५ में विश्लेषण किया गया, और ५६ दिनों के बाद ऑपरेटिव । घायल चूहों (लाल) से सभी पालियों की जनता ले लिया और घायल नियंत्रण (लाल) की जनता की तुलना में किया गया । * = p < ०.०५, * * = p < ०.००५, * * * = p < ०.०००५, NS = महत्वपूर्ण नहीं । यह लगा Tsai एट अल से संशोधित किया गया है । ६ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पुनर्जनन पोस्ट Hepatectomy के लक्षण वर्णन । (एक) P0 पर आंशिक lobular hepatectomies के दौर से गुजर चूहों ५६ दिनों के बाद लकीर का विश्लेषण किया गया और एफ के लिए दाग-actin । छवियां दाग के क्षेत्रों से समीपस्थ और विच्छेदन के क्षेत्र के लिए बाहर से दिखाया गया है, साथ ही उंर से मिलान घायल नियंत्रण, और वयस्क चूहों से 14 दिनों के बाद ७०% आंशिक hepatectomy । स्केल बार्स १०० µm हैं । (ख) समीपस्थ या फिर लकीर साइट के लिए बाहर के क्षेत्रों में चोट के बाद हेपैटोसाइट्स के क्षेत्रों में हेपैटोसाइट्स के क्षेत्रों की तुलना में घायल नियंत्रण और वयस्क ७०% आंशिक hepatectomies से थे । * = p < ०.०५, * * = p < ०.००५, * * * = p < ०.०००५, * * * * = p < ०.००००५, NS = महत्वपूर्ण नहीं । (ग) P0 पर lobular hepatectomies से गुजरने वाले चूहों का इलाज EdU के साथ किया गया था और वे लकीर के बाद 7 दिनों का विश्लेषण कर रहे थे । EdU+ बाएं पालि में कक्ष दिखाए जाते हैं । (स्केल बार, १०० µm) । (घ) ठहराव की edu+ कोशिकाओं की edu 7 और 14 दिनों के साथ इलाज में आंशिक lobular hepatectomy के बाद नियंत्रण की तुलना में । मूल्यों का अर्थ है ± SEM । यह Tsai एट अल से संशोधित किया गया है लगा । ६ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र s: किशोर चूहों के अपूर्ण पुनर्जनन । P14 में आंशिक lobular hepatectomies के दौर से गुजर चूहों 7, ३५, और ५६ दिनों के लिए पीछा किया गया । जिगर निश्चित और एच एंड ई के साथ दाग और वाम सर्वोच्च के उत्थान की हद तक उल्लेख किया गया था । तीर क्षेत्रों जहां पुनर्जनन P0 चूहों में हुई निरूपित । स्केल बार 1 सेमी है । यह लगा Tsai एट अल से संशोधित किया गया था । ६ इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

तीव्र यकृत चोट परंपरागत रूप से रासायनिक (एसिटामिनोफेन, इथेनॉल, कार्बन टेट्राक्लोराइड), या शल्य चिकित्सा मॉडल (७०% आंशिक hepatectomy) का उपयोग कर अध्ययन किया गया है । ७०% आंशिक hepatectomy के बाद reअपक्षय प्रतिक्रिया वैश्विक hepatocyte अतिवृद्धि और सेल डिवीजन4,5के कई दौर शामिल करने के लिए विशेषता है । ख़ून को रोकने के लिए, हालांकि, यह मॉडल सीमित है, क्योंकि प्रमुख जहाजों को पुनर्जनन के लिए एक असामान्य वातावरण छोड़ना ligated होना चाहिए । कई अध्ययनों से इसलिए रासायनिक क्षति के माध्यम से तीव्र चोट के अन्य कम इनवेसिव मॉडल कार्यरत हैं, होने के लिए पुनर्जनन के लिए जगह में सकल वास्तुकला छोड़ने. हाल ही में, Porrello एट अल. और चांग एट अल. दिल में तीव्र चोट के बाद एक स्पष्ट रूप से अलग नवजात अपक्षयी प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है, अंक युक्तियां, और कान7,8। उनके परिणाम समानांतर प्रस्तुत निष्कर्ष है कि जिगर भी नवजात जीवन6में एक विशिष्ट पुनर्जन्म की घटना से गुजरा । प्रमुख अंगों में कई समान निष्कर्षों के साथ, प्रसव के बाद के प्रारंभिक चरण में पुनर्जनन स्टेम सेल जीवविज्ञान के लिए संभावित प्रभाव के साथ एक उभरते क्षेत्र है ।

नवजात आंशिक lobular hepatectomies से शीघ्र मृत्यु दर अक्सर अपर्याप्त वसूली, प्रमुख रक्तस्राव, या मातृ उपेक्षा से आता है । जैसा कि पहले कहा, वसूली के लिए एक गर्मी लैंप के रूप में एक उच्च तीव्रता गर्मी स्रोत के उपयोग, शल्य चिकित्सा के बाद मौत का कारण बन सकता है । नवजात चूहे अपनी मां पर जीवन के कम से पहले दो सप्ताह के लिए निर्भर हैं । एक ही समय में, मां अक्सर उपेक्षा और या उसके जवान cannibalize अगर वह होश में एक विषमता (जैसे रक्त या अंय रसायनों की गंध के रूप में)24,25। इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है कि neonate अच्छी तरह से साफ है के बाद ऑपरेटिव और मातृ बिस्तर के साथ मला किसी भी अप्रिय scents मुखौटा । यदि इन मुद्दों को पर्याप्त रूप से संबोधित कर रहे हैं, अस्तित्व १००% तक पहुंच सकते हैं । अगर मातृ नरभक्षी एक मुद्दा बन जाता है, पिल्ले उसे अपने पिल्ले से कुछ के साथ एक किराए की मां के साथ एक पिंजरे में रखा जा सकता है । यदि यह मामला है, पिछले चरणों में सरोगेट मां के बिस्तर का उपयोग करें ।

नवजात वाम पालि और बाद के उत्थान के 20-30% की लकीर की संभावना केवल बाएं पालि में निहित नहीं है । वर्तमान में, इस विधि केवल बाईं ओर परीक्षण किया गया है, के रूप में औसत और अधिक पीछे सही और caudate पालियों को उजागर एक बड़ा laparotomy जरूरत होगा, नकसीर के एक उच्च जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप और, परोक्ष रूप से, के लिए मातृ के एक उच्च जोखिम नरभक्षी neonate । हालांकि, कि नवजात पुनर्जनन के तंत्र जिगर के भीतर विषम है एक महत्वपूर्ण सवाल को संबोधित किया है, और इसलिए इस प्रोटोकॉल को शल्य चिकित्सा समायोजन के लिए अंय यकृत पालियों पूछताछ किया जाना चाहिए ।

इन नवजात hepatectomy अध्ययनों से परिणाम एक समय अवधि (P0-P7) दिखाया गया है जिसके दौरान उत्थान होने में सक्षम है । इसी तरह के यकृत लकीरें किशोर चूहों पर किया गया है (P7, P10, P14) और प्रदर्शन निशान और फाइब्रोसिस के साथ पूर्ण उत्थान में परिणाम नहीं है, एक स्पष्ट क्षेत्र अंकन जहां विच्छेदन हुई । हालांकि आंशिक lobular hepatectomy निंनलिखित किशोर चूहों में चोट की प्रतिक्रिया एक प्रारंभिक अध्ययन का ध्यान केंद्रित नहीं था, नवजात और किशोर चूहों के बीच पुनर्अपक्षय क्षमता में विसंगति, और अंग और ऊतक का पुनर्गठन करने की क्षमता का नुकसान वास्तुकला, क्या तंत्र स्टेम या जनक सेल नवजात उत्थान होता है द्वारा समझने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

हम पहले से प्रदर्शित किया है कि नवजात पुनर्जीवित जिगर न केवल वास्तुकला और संरचना में ही दिखाई देते हैं, लेकिन यह भी समारोह से अलग कर रहे हैं । इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसे कार्यात्मक यकृत एंजाइमों के लिए दाग glutamine synthetase (जी एस), carbamoylphosphate synthetase (सीपीएस), और cytochrome p450 2E1 पुनर्जीवित क्षेत्रों के भीतर एक समान वितरण शो जब घायल पालियों की तुलना में । हालांकि, एक पुनर्जीवित neonate के द्वितीयक reअपक्षय क्षमता परीक्षण नहीं किया गया है । के रूप में नवजात ५६ दिनों के लिए वसूली के लिए अनुमति चूहों को घायल नियंत्रण से शारीरिक रूप से अलग कर रहे हैं, यह संभावना है कि शास्त्रीय reअपक्षयी प्रतिक्रिया वयस्क ७०% आंशिक hepatectomy के बाद हो जाएगा । हालांकि, इस जिगर पुनर्जनन अक्सर hepatocyte थकावट द्वारा सीमित है, और इसलिए धारावाहिक hepatectomies निंनलिखित आंशिक lobular hepatectomies एक महत्वपूर्ण अध्ययन होगा ।

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Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

Acknowledgments

हम एच एंड ई और प्रोटोकॉल प्रदर्शन के लिए पी चू धंयवाद; और सी. वांग और ए. McCarty के लिए उपयोगी विचार-विमर्श । अनुसंधान वर्जीनिया और डी. के. लुडविग कोष से कैंसर अनुसंधान के लिए धन के माध्यम से समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL058770 और U01HL099999); और कैलिफोर्निया संस्थान के लिए reअपक्षय चिकित्सा (RC1 ००३५४) I.W. Y.R. को अनुदान मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम कैरियर विकास पुरस्कार (CDA00017), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (आरआई 2787/1), Siebel स्टेम सेल संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, और थॉमस और स्टेसी Siebel फाउंडेशन (1119368-104-GHBJI) । J.M.T. NIH (T32GM007365), राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार (1F30DK108561), और नए अमेरिकियों के लिए पौलुस और डेज़ी सोरोस फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name Company Catalog Number Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope Zeiss ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors Vannas 72932-01
5SF Forceps Dumont 11252-00
Straight Kelly forceps Grainger 17-050G
Heating pad Sunbeam 000771-810-000
Isoflurane Abbott Labs 0044-5260-05
Rodent Anesthesia System Kent Scientific 1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm Fisher Scientific 13-761-52
Name Company Catalog Number Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube Eppendorf 22363204
6-0 monocryl sutures Ethicon MCP489G
Petri dish Fisher Scientific S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V Drummond 4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances Fisher Scientific 01-912-402
Low Cost Induction Chamber Kent Scientific SOMNO-0730

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३५ आंशिक Lobular Hepatectomy Hepatectomy जिगर जिगर लकीर जिगर विच्छेदन पुनर्जनन
आंशिक Lobular Hepatectomy: सुघड़ जिगर पुनर्जनन के लिए एक शल्य मॉडल
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Tsai, J. M., Weissman, I. L.,… More

Tsai, J. M., Weissman, I. L., Rinkevich, Y. Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57302, doi:10.3791/57302 (2018).

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