Summary
Vi præsenterer her, en ny metode til delvis resektion af leverens venstre lap i neonatal (dag 0) mus. Denne nye protokol er egnet til at studere akut leverskade og skade svar i indstillingen neonatal.
Abstract
Morfologiske orgel regeneration efter akut væv tab er udbredt blandt lavere hvirveldyr, men er sjældent observeret i pattedyr postnatal liv. Voksen lever regenerering efter 70% delvis hepatectomy resulterer i hepatocyt hypertrofi med nogle replikering i resterende lapper med restaurering af metaboliske aktivitet, men med permanent tab af den skadede lap morfologi og arkitektur. Vi detalje her, en ny kirurgisk metode i den nyfødte, der efterlader en fysiologisk miljø befordrende for regenerering. Denne model indebærer amputation af venstre lap apex og en efterfølgende konservative ledelse regime, og mangler nødvendighed for ligatur af store leveren fartøjer eller kemisk skade, forlader en fysiologisk miljø hvor regeneration kan forekomme. Vi udvider denne protokol til amputationer på juvenile (P7-14) mus, hvor den tilskadekomne leveren overgange fra orgel regeneration til kompenserende vækst af hypertrofi. Præsenteret, korte 30 min-protokollen giver en ramme for at studere mekanismerne af regenerering, sin alder-associerede tilbagegang i pattedyr og karakterisering af formodede hepatisk stilk eller stamfaderen.
Introduction
Evnen til at regenerere en orgel eller genoprette form og funktion, har været tænkt til at være overvejende tabt over evolutionære tid. Regenerativ potentialet i den voksne pattedyr lever efter akut kemisk eller fysisk skade er blevet fundet for at inddrage mobilisering af alle resterende hepatocytter resulterer i bølger af hypertrofi og par runder af celledeling, hvilket resulterer i en funktionel, men arkitektonisk forskellige orgel1,2,3,4,5. For nylig er begyndt undersøgelser til at karakterisere den regenerativ svar af neonatal pattedyr organer at skade inden for den første uge af livet6,7,8. Disse undersøgelser har vist, at når såret under neonatal udvikling, visse pattedyr organer reagerer med morfologiske regenerering i stedet for kompenserende vækst eller fibrose7,8.
Nylige undersøgelser har vist, at regenerering af både globale struktur og funktion opstår under den tidlige neonatale periode6,7,8. Etablerede leverskade protokoller inddrage kemisk skade eller administration af ethanol9,10,11, acetaminophen12,13,14,15 , tetrachlormethan16,17,18,19, 70% delvis hepatectomy4,20,21, eller fjernelse af venstre og Median fliger. Kemiske administration fører til hepatocyt celledød, men ofte efterlader mikro - og makro-strukturer intakt. Morfologiske regeneration kan ikke let studerede i denne sammenhæng, som den samlede hepatisk arkitektur ikke blev udslettet. 70% delvis hepatectomy indebærer sutur ligatur af de store fartøjer, som er nødvendige til at stoppe blødninger, men efterlader en ikke-fysiologisk miljø med permanent afbrydelse af Vaskulaturen. Desuden, denne metode er kun blevet brugt på voksen gnavere, og dens anvendelse til nyfødte er teknisk meget vanskeligt. Med dette i tankerne, udviklede vi en metode, hvor 20-30% af toppen af den venstre lap er fjernet i en nyfødt P0 mus (figur 1A-1B). Denne metode er kirurgisk konservative, minimalt invasive, ikke teknisk udfordrende, og fører til brutto tab af morfologi uden ligatur af Vaskulaturen, forlader plads til regenerering at forekomme. Den resulterende trinvise protokollen, beskrevet nedenfor, giver mulighed for enhver forsker til at udføre en delvis dråbeformede hepatectomy på neonatal mus for at studere pattedyr neonatal regenerering i de tidlige stadier af postnatal liv. Denne metode har også klart applikationer til sammenlignende studier i regenerativ medicin og stamceller biologi, da det kan bruges i leveren under senere stadier af livet.
De mest almindelige akut leverskade undersøgelser er kemisk induceret skade, voksen lever amputation eller 70% delvis hepatectomy. Kemiske skader ofte involverer intravenøs, intraperitoneal eller oral administration af acetaminophen, tetrachlormethan eller ethanol, og er en forholdsvis nem og ikke-invasiv skade model. Som tidligere diskuteret, kemiske skader resultater i hepatocyt celledød, men ofte blade stroma og parenkym strukturer intakt, hvilket gør det vanskeligt at fremsætte krav om morfologiske regenerering. Kemiske skader centreret ofte om hepatisk fartøjer, hvilket gør det en nyttig teknik til at studere websted og celle-specifikke skade, men gør det også vanskeligt at afhøre, på hele orglet plan, andre populationer, der kan være placeret længere væk fra fartøjer og der kan bidrage til regenerering. På trods af disse begrænsninger stadig kemiske skader en nyttig og meget fysiologisk relevante skade model.
Voksen 70% delvis hepatectomy indebærer fjernelse af de venstre og median lapper efter ligatur af hepatisk Vaskulaturen. Svar til hepatectomy har været godt præget: amputerede leveren 14 dage post 70% delvis hepatectomy udvikler et groft anderledes arkitektur end den oprindelige ubeskadigede lap, som hepatocytter af de resterende højre og spiegelske lapper gennemgå hypertrofi og et par runder af celledeling4,5. Dette gør op tabt masse og funktion, men undlader at regenerere de to amputerede kamre, og derfor erstatter ikke grov morfologi. Skade svar på 70% delvis hepatectomy er nyttige at studere kompenserende vækst mekanismer med begrænset regenerering.
Her, vi fuldt ud at beskrive en protokol for en neonatal delvis dråbeformede hepatectomy. Proceduren indebærer passende animalske udvalg og forberedelse, kirurgiske felt forberedelse, kirurgi og nyttiggørelse. Optimering og tilpasning af hvert af disse trin kan være påkrævet til forskellige applikationer i protokollen.
Vi har grundigt udført og optimeret denne protokol på vildtype C57BL/6J unger (JAX 000664), men for at studere forskellige cellepopulationer og mekanismer for regenerering, vi også brugt forskellige transgene dyr herunder mus husly forskellige Cre og CreERT2 transgener og/eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, og Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombination med fluorescerende reportere, såsom Rainbow og mTmG systemer (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. vi fandt ingen grund til at ændre denne metode for forskellige mus stammer, som ingen forskel i overlevelse resultater eller regenerativ potentiale blev observeret.
Ud over at bruge forskellige animalske stammer, optrådte vi også delvis dråbeformede hepatectomies på neonatal mus behandlet med små molekyler, som 4-hydroxy-tamoxifen og 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU). Dimethylsulfoxid (DMSO) og ethanol blev anvendt som opløsningsmidler, da det konstateredes, at majs olie var en væsentlig årsag til morbiditet. Ellers fandt vi, at intraperitoneal indgift af små molekyler ikke påvirkede overlevelse eller regenerativ resultater. Vi forudser, at denne protokol vil blive tilpasset til brug med andre små molekyler til at afhøre forskellige aspekter af regenerering.
Neonatal mus operationer kan være teknisk udfordrende og kan kræve særlig ekspertise i animalsk håndtering og mikroskopiske dissektion. Husdyrhold ekspertise er nødvendig for at undgå maternel kannibalisme efter operationen og under øjeblikkelig restitutionsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med Foreningen for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC) og Stanford University's Administrative Panel for Laboratory Animal retningslinjer Pleje (APLAC), (protokolnummer #10266) og i USA eller den europæiske animalsk velfærd opføre, direktiv 2010/63/EU. Protokollen blev godkendt af Udvalget om etik af dyr eksperimenter af regeringen af Bayern i Tyskland, og modtaget tilladelsen ikke: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. animalsk forberedelse
- Forberede et tomt bur med passende sengetøj på en varmepude.
- Inden rørende dyr med handsker, gnid moderens sengetøj på handskerne.
- Fjerne alle hvalpe fra deres mor og sted ind i tom buret. Fjern nogle af moderens sengetøj og placere den i den tomme bur med hvalpene.
- Sted mor i en separat, ren, tør bur fra feltet kirurgisk.
- Don nye, rene sterile handsker før kirurgiske felt forberedelse.
2. kirurgiske felt forberedelse
- Ved hjælp af en 10-mL pipette, der tilsættes 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en 10-cm petriskål.
- Der afpipetteres 2 mL betadine eller tilsvarende anti-septisk løsning i 10cm petriskål.
- Placere et dissekere muligheder på det kirurgiske område. Tænd dissekere anvendelsesområde lampe og justere niveauet af lys til kirurgens komfort. En hvalp kan placeres i den kirurgiske felt nedenunder dissekere anvendelsesområde lampen. Tilstrækkelig lys kan bekræftes ved fravær af skygger på den ventrale overflade af pup.
- Forberede isofluran anæstesi kammer (Se Tabel af materialer) med en næse kegle. Salen bør rengøres uden beviser af urin eller afføring. Placer næsen kegle og tilhørende slanger omfattet dissekere i den kirurgiske felt. Aflede strømmen af ilt og isofluran udelukkende til næsen kegle.
- Forberede en postoperativ nyttiggørelse område med en varmepude sat til ca. 37 ° C. Den postoperative genopretning bør bestå af 4 stykker gaze anbragt oven på den hede afrivningsblok. Hvis det er muligt, gnid gaze puder i moderens strøelse, afføring og urin til at bevare moderens duft.
Bemærk: Det er uklogt at bruge en varmelampe, da dette gør det vanskeligt at kontrollere temperaturen. Forhøjede temperaturer vil resultere i dødsfald af neonatal mus. - Forberede og sterilisere alle kirurgiske instrumenter med en autoklave. Værktøjerne behov omfatter: micro-dissekere saks, mikro-dissekere pincet, gaze, hemostat og enhver 6-0 monofilamenter ikke-resorberbare sutur. Kirurgiske instrumenter kan være resterilzed med nogen glas perle sterilizer.
3. delvis dråbeformede Hepatectomy
- Bedøver pup ved at placere det i næsen kegle på sin tilbage og forsigtigt taping sine fødder og hænder på plads. Hvalpen skal modtage 5% isofluran i ilt.
- Tillad pup hen til sidde i 5 min eller indtil tilstrækkeligt bedøvede, som kan kontrolleres af en tå knivspids test.
- Indsprøjtes 5 mg/kg af carprofen subcutant forud for indsnit.
Bemærk: Hele operationen bør tage længere end 30 min. dårligere resultater kan observeres i nyfødte, der er under fuld narkose i over 30 min. Tag forholdsregler for at minimere længden af kirurgi gennem grundig felt forberedelse og fugtning af huden inden lukning at minimere sutur induceret hud tårer.
- Forsigtigt rense ud den bageste bugvæggen med en lille gaze pad våd med betadine. Tillad betadine tørre i 1 min.
- Gøre en venstre midt clavicula 0,5 cm incision umiddelbart under brystkassen med mikro-dissekere saks og pincet. Forsigtigt adskille huden ved hjælp af pincet og gøre en anden dybere snit ind i bughulen (Se figur 1 c, venstre og center)
- Forsigtigt anvende sideværts pres fra begge sider af maven ved hjælp af bagsiden, stumpe ender af den mikro-dissekere saks og pincet til at tvinge apex af venstre lap ud af bughulen. Venstre lap venstre apex bør let visualiseret (figur 1 c, højre).
-
Fra apex, amputere og vejer mængden af væv fjernes.
- Ved hjælp af mikro-dissektion saks, forsigtigt amputere den ønskede mængde væv fra apex af venstre lap.
- Sted den amputerede væv ind i en 1,5 mL rør fyldt med PBS. Vejer det amputerede væv ved hjælp af en Analysevægt (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Læg et stykke gaze eller papir på balancen og Tara det. Derefter placere den amputerede væv på papir eller gaze og måle dens masse. - Fix det amputerede område i 2% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur i 1 time og sted i optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte over tøris for frossen sektion analyse. Analysere frosne sektioner af skæring 7-10 µm sektioner ved hjælp af enhver standard kryostaten.
- Ved hjælp af en rullede stykke gaze, forsigtigt erstatte venstre lap i bughulen. Efterlade Gaze i hulrummet indtil blødningen standser.
- Fjerne gaze og våde operationsstedet og det omkringliggende område med gaze gennemblødt med PBS.
- Luk operationsstedet med 6-0 monofilamenter, ikke-resorberbare suturer med en kører søm. Bughinden og huden bør lukkes separat.
Bemærk: Forsigtigt at fugte huden med gaze gennemblødt med PBS kan minimere sutur induceret tårer. - Forsigtigt, men grundigt rense pup med gaze gennemblødt med PBS og sikre ingen blod eller betadine resterne. Roll gennemblødt gauze afrivningsblok og forsigtigt krat over såret tegn til at rense ud nogen blod eller betadine.
Bemærk: Dette er især vigtigt, da moderen kan kannibalisere hvalpene, hvis de er renset utilstrækkeligt. - Fjerne pup fra næsen kegle og placere den på området recovery, der omfatter gaze puder udsat for moderens afføring og urin. Når hvalpen bedres, erstatte pup i den tomme bur med moderens sengetøj.
Bemærk: Brug ikke en varmelampe. Brugen af en varmelampe kan forårsage den nyfødte til at overophede. - Gentag fremgangsmåden på det ønskede antal unger. Selv om alle hvalpene kan bruges, er det generelt tilrådeligt at lade et par unger ikke drives på erstattes med de betjente unger.
- Erstatte alle unger samtidigt med deres mor sengetøj i moderens bur.
4. genvinding og analyse
-
Følge op på mus dagligt.
- Kontroller, at såret er lukket og fjerne eventuelle døde unger, hvis den findes.
- Hvis såret genåbner, forberede de kirurgiske websted og opsving område som tidligere beskrevet, og Gentag trin 3.8 til 3.12.
- Indsprøjtes 5 mg/kg af carpofen subcutant 24 og 48 h proceduren.
- Følg hvalpene i 56 dage eller mere.
- Euthanize dyrene efter den ønskede mængde af postoperative dage af kuldioxid (CO2) eksponering og cervikal dislokation.
- Placere mus i induktion / eutanasi kammer og tænde CO2 indtil mus stoppe vejrtrækningen.
- Sikre eutanasi af cervikal dislokation. Tryk ned på den dorsale hals af musen ved hjælp af forgrunden-finger og tommelfinger og bruger anden hånden, trække ned på halen.
-
Fjerne den hele leveren blokoverførslen og vejer det.
- Forsigtigt adskille hver lap og vejes separat.
Bemærk: Fjerne leveren af omhyggelige dissektion af mellemgulvet og hepatisk og portal-fartøjer. Adskille lapper fra hinanden ved omhyggeligt dissekere hver lap på sin proksimale vedhæftet fil.
- Forsigtigt adskille hver lap og vejes separat.
- Bestemme omfanget af regenerering ved at sammenligne massen af den amputerede venstre lap til massen af hele leveren. En uskadt venstre lap er ca 30% af hele leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A detaljer en generelle tidslinje for den neonatale delvis dråbeformede hepatectomy (skematisk i figur 1B), og den forventede længde af tid til at vente indtil regenerering er observeret. Subtile regenerering af venstre lap kan være observerede 7-14 dage post kirurgi. Fuld regenerering var ofte observeret efter 56 dage efter operationen. Mus skal viser ingen tegn på fysiologisk abnormiteter efter operationen.
Mus gennemgår delvis dråbeformede hepatectomies fik lov til at genoprette til 2, 7, 14, 35, og 56 dage. Hæmatoxylin og eosin (H & E) af tilskadekomne venstre lapper fra disse mus efter opsving er vist i figur 2. Især efter 56 dage, kan amputerede venstre lap Se skelnes fra kontrol, uskadt fliger. Operationer udført på P14 juvenile mus blev gjort til sammenligning og lov til at inddrive for 7, 14, og 56 dage efter kirurgi (Figur S1).
For at karakterisere neonatal regenerering, 45 mus undergik delvis dråbeformede hepatectomy på dag 0 og masser af alle deres lapper blev taget 56 dage efter kirurgi. Massen af den skadede venstre lap undergik en større ændring i masse i forhold til de andre uskadt median, højre, og spiegelske lapper (figur 3A) og uskadt kontrolelementer, nærmer sig massen af en uskadt venstre lap på P56. Dette indikerer at regenerering følgende neonatal leverskader er lokaliseret til venstre lap. Operationer udført på P14 juvenile mus blev udført for sammenligning, som viste nedsat regenerering i venstre lap og øget kompensation fra de uskadt lapper (figur 3B), der angiver, at efter 14 dage, den skade reaktion på akut resektion skiftede fra lap specifikke regenerering til globale kompensation. Yderligere karakterisering blev gjort ved farvning områder af den venstre lap fra tilskadekomne mus på postoperative dag 56 med trådformede actin (f-actin) til at visualisere cellemembraner (figur 4A). Områder distale og proksimale til området skade sammenlignet med uskadt kontrol og voksen lapper 14 dage efter 70% delvis hepatectomies. Hepatocytter fandtes for at have lignende områder som uskadt kontrolelementer, omkring 1,5-2 x mindre end voksne mus under regenerering efter klassisk 70% delvis hepatectomy (figur 4B). Dette tyder på, at hypertrofi ikke spiller en rolle i revitalisering. Endelig, neonatal mus blev sprøjtet med 0,025 mg af 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) i 90% PBS og 10% ethanol og 1, 3, 5, 7 og 14 dage efter operationen. Antallet af EdU positive celler blev talt fra mus lov til at inddrive for 7 dage efter operationen (figur 4 c). En betydelig stigning i antallet af EdU positive celler blev fundet i den tilskadekomne/regenererende venstre lap i forhold til uskadt kontrol, med angivelse af at celledelingen bidrager til neonatal regenerering.
Figur 1: delvis dråbeformede Hepatectomy oversigt. (A) En generel skematisk og tidslinje for den delvise dråbeformede hepatectomy er vist med neonatal lever resektion gjort på P0. Analyser blev udført på P7, P14, P35 eller P56. Resektion blev også forsøgt på P7 og P14. (B) en skematisk af omfanget af resektion af venstre lap er vist, afgrænser 20 og 30% resektion. (Dette tal er blevet ændret fra Tsai et al.) 6. (C) billeder fra neonatal operationer viser: højre sidet midten af clavicula indsnit (venstre, center) og eksponering af den venstre lap apex (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Regeneration efter delvis dråbeformede Hepatectomy. Mus gennemgår delvis dråbeformede hepatectomies på P0 blev fulgt til 2, 7, 14, 35 og 56 dage. Leverne var fast og plettet med H & E, og omfanget af regenerering af den venstre apex blev bemærket. Pilene angiver områder hvor regenerering opstod i P0 mus. Skalalinjen er 1 cm. Dette tal blev ændret fra Tsai et al. 6 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Regeneration pr. Lobe efter delvis dråbeformede Hepatectomy. (A) mus undergår delvis dråbeformede hepatectomies på P0 blev analyseret på 7, 35 og 56 dage post-operatively. Mus blev aflivet og masserne på alle lapper fra tilskadekomne mus (rød) blev taget og i forhold til alder matchede masserne af uskadt kontrol (rød). (B) Mus gennemgår delvis dråbeformede hepatectomies på P14 blev analyseret på 7, 35 og 56 dage post-operatively. Masserne på alle lapper fra tilskadekomne mus (rød) blev taget og i forhold til masserne af uskadt kontrol (rød). * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0.0005, NS = ikke betydelig. Det regnede er blevet ændret fra Tsai et al. 6 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: karakterisering af regenerering Post Hepatectomy. (A) mus undergår delvis dråbeformede hepatectomies på P0 blev analyseret 56 dage efter resektion og farves til F-actin. Billeder vises af pletter fra områder proksimale og distale til området for amputation, samt fra den alder-matchede uskadt kontrol, og voksne mus 14 dage efter 70% delvis hepatectomy. Skala barer er 100 µm. (B) områder af hepatocytter efter skade på områder proksimale eller distale til webstedet resektion sammenlignet med områder af hepatocytter fra uskadt kontrol og voksen 70% delvis hepatectomies.* = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0.0005, *** = p < 0,00005, NS = ikke betydelig. (C) mus gennemgår dråbeformede hepatectomies på P0 blev behandlet med EdU og blev analyseret 7 dage efter resektion. EdU+ celler i venstre lap er vist. (Skalalinjen, 100 µm). (D) kvantificering af EdU+ celler i mus behandlet med EdU 7 og 14 dage efter delvis dråbeformede hepatectomy i forhold til kontrol. Værdierne er middel ± SEM. Det regnede blevet ændret fra Tsai et al. 6 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: ufuldstændige regenerering af Juvenile mus. Mus gennemgår delvis dråbeformede hepatectomies på P14 blev fulgt i 7, 35 og 56 dage. Leverne var fast og plettet med H & E og omfanget af regenerering af den venstre apex blev bemærket. Pilene angiver områder hvor regenerering opstod i P0 mus. Skalalinjen er 1 cm. Det regnede var ændret fra Tsai et al. 6 Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akut hepatisk skade er traditionelt blevet undersøgt ved hjælp af kemiske (acetaminophen, ethanol, tetrachlormethan), eller kirurgisk modeller (70% delvis hepatectomy). Den regenerative svar efter 70% delvis hepatectomy har været præget for at inddrage globale hepatocyt hypertrofi og flere runder af celledeling4,5. For at stoppe hemorrhaging, er denne model dog begrænset, da de store fartøjer skal være forbundet forlader en unormal miljø for regenerering. Mange undersøgelser har derfor ansat andre mindre invasive modeller af akut skade gennem kemiske skader, forlader den grove arkitektur i sted for regenerering at forekomme. For nylig, Porrello et al. og Chang et al. har vist en markant forskellige neonatal regenerativ svar efter akut skade i hjertet, ciffer tips og ører7,8. Deres resultater parallelle præsenteres konklusioner at leveren også undergår en særskilt regenerativ fænomen i neonatal liv6. Med flere lignende fund i vigtige organer er regenerering i de tidlige stadier af postnatal udvikling et nye felt med potentielle konsekvenser for stamcelleforskning biologi.
Tidlig dødelighed fra neonatal delvis dråbeformede hepatectomies kommer ofte fra utilstrækkelig opsving, større blødning eller maternel omsorgssvigt. Som nævnt tidligere, anvendelse af en højere intensitet varmekilde som en varmelampe til nyttiggørelse, kan føre til døden efter en operation. Neonatal mus er afhængige af deres mor for i det mindste de første to uger af livet. På samme tid, vil moderen ofte forsømmer og eller kannibalisere sin unge, hvis hun registrerer en abnormitet (såsom duften af blod eller andre kemikalier)24,25. Det er derfor meget vigtigt, at nyfødte er rengjort grundigt post-operatively og gnides med mødres strøelse til at maskere enhver offensive dufte. Hvis disse spørgsmål er tilstrækkeligt behandlet, kan overlevelse nå op til 100%. Hvis moderen kannibalisme bliver et problem, kan hvalpene placeres i et bur med en rugemor med nogle af hendes egne unger. Hvis dette er tilfældet, skal du benytte rugemors sengetøj i de forrige trin.
Resektion af 20-30% af neonatal venstre lap og efterfølgende regenerering er sandsynligvis ikke forbundet med kun den venstre lap. I øjeblikket, denne metode er kun blevet testet til venstre, som udsætter medianen og flere bageste højre og spiegelske lapper vil nødvendiggøre en større laparotomi, hvilket resulterer i en højere risiko for blødning og indirekte, en højere risiko for maternel kannibalisme for den nyfødte. Men om mekanismerne af neonatal regenerering er heterogene i leveren er et vigtigt spørgsmål, og derfor boer der foretages kirurgisk justeringer til denne protokol til at afhøre de andre hepatisk fliger.
Resultaterne fra disse neonatal hepatectomy undersøgelser har vist en gang periode (P0-P7) som regenerering er stand til at opstå. Lignende hepatisk resektion har gjort på juvenile mus (P7, P10, P14) og fører ikke til fuldstændig regenerering med demonstreret ar og fibrose, markerer et klart område hvor amputation opstod. Selv om skade svar i juvenile mus efter delvis dråbeformede hepatectomy ikke var i fokus i en indledende undersøgelse, uoverensstemmelse i regenerativ potentiale mellem neonatal og juvenil mus, og tabet af evnen til at rekonstruere orgel og væv arkitektur, vil være afgørende for forståelsen af hvad mekanisme stamceller eller stamceller celle neonatal regenerering opstår.
Vi har tidligere vist at neonatal folier lever ikke kun vises på samme i arkitektur og struktur, men er også skelnes af funktion. Immunfluorescens pletter for funktionelle hepatiske enzymer såsom glutamin syntetase (GS), carbamoylphosphate syntetase (CPS) og cytokrom p450 2E1 viser en tilsvarende fordeling inden for folier områder sammenlignet med uskadt fliger. Sekundære regenerativ potentialet i en regenereret nyfødte er imidlertid ikke blevet testet. Som neonatal mus tilladelse til nyttiggørelse til 56 dage er fysiologisk skelnes fra uskadt kontrol, er det sandsynligt, at den klassiske regenerativ svar efter voksen 70% delvis hepatectomy ville forekomme. Men denne lever regenerering er ofte begrænset af hepatocyt udmattelse, og seriel hepatectomies efter delvis dråbeformede hepatectomies vil derfor være en vigtig undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi takker P. Chu til udførelse af H & E og histologi; og C. Wang og A. McCarty til nyttige diskussioner. Forskning blev støttet gennem finansiering fra Virginia og D. K. Ludwig Fund for kræftforskning; National Heart, Lung, og Blood Institute (R01HL058770 og U01HL099999); og California Institute for regenerativ medicin (RC1 00354) tilskud til I.W. Y.R. blev støttet af den Human Frontier Science Program karriere udvikling Award (CDA00017), tyske Research Foundation (RI 2787/1), Siebel stamcelle Institute, og de Thomas og Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. blev støttet af NIH (T32GM007365), den nationale forskning Service Award (1F30DK108561), og Paul og Daisy Soros Fellowship for nye amerikanere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L.
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
