Summary
Qui, presentiamo un nuovo metodo per la resezione parziale del lobo epatico di sinistra in topi neonatali (giorno 0). Questo nuovo protocollo è adatto per lo studio delle lesioni epatiche acute e risposta di lesione in ambito neonatale.
Abstract
Rigenerazione dell'organo morfologico dopo perdita acuta del tessuto è comune tra i vertebrati inferiori, ma è osservata raramente nella vita postnatale dei mammiferi. Adulto rigenerazione del fegato dopo epatectomia parziale 70% provoca l'ipertrofia degli epatociti con qualche replica nei restanti lobi con ripristino di attività metabolica, ma con perdita permanente della morfologia e della architettura di lobo ferito. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo metodo chirurgico nel neonato che lascia un ambiente fisiologico favorevole alla rigenerazione. Questo modello comporta amputazione di all'apice del lobo di sinistra e di un regime di successiva amministrazione conservatrice e manca la necessità per la legatura dei vasi principali del fegato o ferita chimica, lasciando un ambiente fisiologico in cui può verificarsi la rigenerazione. Estendiamo questo protocollo per amputazioni su topi giovani (P7-14), durante il quale il fegato danneggiato passa da rigenerazione dell'organo a crescita compensatoria di ipertrofia. Il protocollo presentato, breve 30 min fornisce un framework per lo studio dei meccanismi di rigenerazione, il suo declino età-collegato nei mammiferi e la caratterizzazione dei presunti staminali epatiche o progenitori.
Introduction
La capacità di rigenerare un organo, o per ripristinare la forma e funzione, è stata pensata per essere per lo più perso nel tempo evolutivo. La capacità rigenerativa del fegato dei mammiferi adulto dopo lesione acuta chimico o fisico è stato trovato per coinvolgere la mobilitazione di tutti gli epatociti rimanenti conseguente onde dell'ipertrofia e alcuni cicli di divisione cellulare, risultante in un funzionale ma architettonicamente differenti dell'organo1,2,3,4,5. Recentemente, gli studi hanno cominciato a caratterizzare la risposta rigenerativa degli organi dei mammiferi neonatale alla ferita entro la prima settimana di vita6,7,8. Questi studi hanno dimostrato che quando ferito durante lo sviluppo neonatale, determinati organi mammiferi rispondano con rigenerazione morfologica invece compensativo crescita o fibrosi di7,8.
Recenti studi hanno dimostrato che la rigenerazione della struttura globale e la funzione si verifica durante l'iniziale periodo neonatale6,7,8. Protocolli stabiliti al fegato coinvolgere ferita chimica o la somministrazione di etanolo9,10,11, acetaminofene12,13,14,15 , tetracloruro di carbonio16,17,18,19, 70% hepatectomy parziale4,20,21o la rimozione di sinistra e lobi mediani. Chimica amministrazione conduce alla morte delle cellule dell'epatocita, ma spesso lascia micro - e macro-strutture intatte. Rigenerazione morfologica non può essere facilmente studiati in questo contesto, come l'architettura epatica nel complesso non è stato cancellato. L'epatectomia parziale 70% comporta la legatura sutura dei vasi principali, che è necessaria per fermare l'emorragia, ma lascia un ambiente non-fisiologica con rottura permanente del sistema vascolare. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato solo sui roditori adulti, e la sua applicazione ai neonati tecnicamente è estremamente difficile. Con questo in mente, abbiamo sviluppato un metodo in cui 20-30% dell'apice del lobo di sinistra è stata rimossa in un neonato mouse P0 (Figura 1A-1B). Questo metodo è chirurgicamente conservatore, minimamente invasiva, non tecnicamente impegnativi e conduce al lordo di perdita della morfologia senza legatura della vascolarizzazione, lasciando spazio per la rigenerazione si verifichi. Il risultante protocollo passo dopo passo, descritto di seguito, consente qualsiasi ricercatore eseguire un hepatectomy parziale lobular su topi neonatali per lo studio dei mammiferi rigenerazione neonatale nelle prime fasi di vita post-natale. Questo metodo ha anche applicazioni chiare agli studi comparativi in medicina rigenerativa e biologia delle cellule staminali, come può essere utilizzato nel fegato durante le fasi successive della vita.
Gli studi di lesioni epatiche acute più comuni sono danni indotti chimicamente, l'amputazione del fegato adulto o hepatectomy parziale 70%. Danni chimici spesso prevede la somministrazione per via endovenosa, orale o intraperitoneale di paracetamolo, tetracloruro di carbonio o etanolo ed sono un modello relativamente semplice e non invasiva di lesioni. Come precedentemente discusso, danni chimici risultati nella morte cellulare dell'epatocita, ma spesso foglie dello stroma e parenchima strutture intatte, rendendo difficile fare affermazioni circa morfologiche rigenerazione. Danni chimici spesso è incentrata su vasi epatici, che lo rende una tecnica utile per studiare il sito e ferita cellula-specifico, ma rende anche difficile interrogare, a livello di intero organo, altre popolazioni che possono essere situati più lontano di vasi e che possono contribuire alla rigenerazione. Nonostante queste limitazioni, danni chimici rimangono ancora un modello utile e altamente fisiologicamente rilevante pregiudizio.
Adulti 70% hepatectomy parziale comporta la rimozione dei lobi sinistro e mediani dopo la legatura del sistema vascolare epatica. La risposta all'epatectomia è stata caratterizzata bene: il fegato amputato 14 giorni post 70% hepatectomy parziale si sviluppa un'architettura grossolanamente diversa da quello del lobo originale intatto, come gli epatociti di lobi di destra e Caudati rimanenti sottoposti a ipertrofia e un paio di giri di divisione cellulare4,5. Questo rende perso massa e funzione, ma non riesce a rigenerare i due lobi amputati e pertanto non sostituisce lordo morfologia. Di conseguenza, la risposta di lesione all'epatectomia parziale 70% è utile per lo studio dei meccanismi di crescita compensatoria con rigenerazione limitata.
Qui, descriviamo completamente un protocollo per un neonatale hepatectomy parziale lobulare. La procedura prevede la selezione di animali appropriati e preparazione, preparazione del campo chirurgico, chirurgia e recupero. Ottimizzazione e adattamento di ognuno di questi passaggi possono essere necessari per le diverse applicazioni del protocollo.
Abbiamo ampiamente eseguita e ottimizzato questo protocollo su cuccioli di tipo selvatico C57BL/6J (JAX 000664), tuttavia, per studiare i meccanismi di rigenerazione e di diverse popolazioni cellulari, abbiamo anche usato vari animali transgenici, compreso i topi che harboring Cre vari e CreERT2 transgeni e/o knock-in (JAXAxin2CreERT2 018867, e JAX Sox9CreERT2 018829) in combinazione con reporter fluorescenti, come i sistemi di Rainbow e mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. abbiamo non trovato nessuna necessità di cambiare questa metodologia per ceppi di topi diversi, come sono state osservate differenze nella sopravvivenza o potenziale rigenerativo.
Oltre all'utilizzo di diversi ceppi di animali, abbiamo anche effettuato parziale hepatectomies lobular su neonatali topi trattati con piccole molecole, quali 4-idrossi-tamoxifen e 5-Etinil-2 '-deoxyuridine (EdU). Solfossido dimetilico (DMSO) e l'etanolo sono stati utilizzati come solventi, come è stato trovato che l'olio di mais era una causa significativa della morbosità. Abbiamo trovato altrimenti che la somministrazione intraperitoneale di piccole molecole non ha colpito esiti rigenerative o sopravvivenza. Prevediamo che questo protocollo sarà adattato per l'uso con altre piccole molecole per interrogare i vari aspetti della rigenerazione.
Interventi chirurgici del mouse neonatale possono essere tecnicamente impegnativi e possono richiedere particolari competenze nella gestione degli animali e dissezione microscopica. Agricoltura animale ed è necessaria per evitare cannibalismo materna dopo l'intervento e durante il periodo di recupero immediato.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in stretta conformità con le linee guida stabilite dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) e dell'Università di Stanford pannello amministrativo su animali di laboratorio Cura (APLAC), (numero di protocollo #10266) e negli Stati Uniti, o l'europeo Animal Welfare Act, direttiva 2010/63/UE. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di animale esperimenti del governo della Baviera, Germania e ha ricevuto il permesso No: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. animale preparazione
- Preparare una gabbia vuota con biancheria da letto appropriato su un rilievo di riscaldamento.
- Prima di toccare gli animali con i guanti, strofinare assestamento della madre sui guanti.
- Rimuovere tutti i cuccioli dalla loro madre e posto nella gabbia vuota. Rimuovere alcuni di biancheria da letto della madre e metterlo nella gabbia vuota con i cuccioli.
- Posto la madre in una gabbia separata, pulita e asciutta, lontano dal campo chirurgico.
- Don nuovi guanti sterili puliti prima della preparazione del campo chirurgico.
2. preparazione del campo chirurgica
- Utilizzando una pipetta 10 mL, aggiungere 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) per un piatto di Petri di 10 cm.
- Pipettare 2 mL di soluzione di betadine o equivalente anti-settico in di Petri di 10cm.
- Posto un ambito dissezione sul campo operatorio. Accendere la lampada di ambito di dissezione e regolare il livello di luce al comfort del chirurgo. Un cucciolo è collocabile nel campo chirurgico sotto la lampada di ambito per dissezione. Luce adeguata può essere confermata dall'assenza di ombre sulla superficie ventrale del cucciolo.
- Preparare la camera di anestesia di isoflurane (Vedi Tabella materiali) con un cono di naso. La camera deve essere pulita senza prova di urina o feci. Inserire il cono di naso e tubi associato nell'ambito di dissezione nel campo chirurgico. Deviare il flusso di ossigeno e isoflurano unicamente per il cono di naso.
- Preparare un'area di recupero post-operatorio con un rilievo di riscaldamento impostato a circa 37 ° C. Il recupero post-operatorio deve essere composto da 4 pezzi di garza posizionato sopra il dissipatore di calore. Se possibile, strofinare garze in biancheria, feci e urina per conservarne il profumo della madre della madre.
Nota: È mal consigliato di utilizzare una lampada di calore, come questo rende più difficile controllare la temperatura. Temperature elevate provocherà la morte di topi neonatali. - Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un'autoclave. Gli strumenti necessari sono: forbici micro-dissezione, micro-dissezione forcipe, garza, pinza emostatica e qualsiasi sutura non assorbibile monofilamento di 6-0. Strumenti chirurgici possono essere resterilzed con qualsiasi sterilizzatore di perlina di vetro.
3. lobulare epatectomia
- Anestetizzare il pup inserendola tra l'ogiva sulla sua taping indietro e delicatamente i piedi e le mani a posto. Il cucciolo dovrebbe ricevere 5% isoflurane in ossigeno.
- Consentire il pup di sedersi per 5 minuti o fino a quando non adeguatamente anestetizzato, che può essere verificato con una prova di pizzico di punta.
- Iniettare 5 mg/kg di carprofen per via sottocutanea prima dell'incisione.
Nota: L'intera operazione dovrebbe prendere non più di 30 minuti i risultati più difficili possono essere osservati in neonati che sono sotto anestesia generale per oltre 30 min. Prendere precauzioni per ridurre al minimo la lunghezza della chirurgia attraverso una preparazione approfondita e bagnatura della pelle prima della chiusura per ridurre al minimo suturare lacerazioni della pelle indotto.
- Pulire delicatamente la parete addominale posteriore con una piccola garza bagnata con betadine. Consentire il betadine asciugare per 1 min.
- Fare un'incisione di cm 0,5 emiclavicolare sinistra immediatamente di sotto della gabbia toracica con le micro-dissezione Forbici e pinze. Delicatamente la pelle usando il forcipe di separare e praticare una seconda incisione più profonda nella cavità peritoneale (Vedi Figura 1, sinistra e centro)
- Applicare una leggera pressione laterale da entrambi i lati dell'addome utilizzando la schiena, le estremità smussate del micro-dissezione Forbici e pinze per forzare l'apice del lobo di sinistra fuori della cavità peritoneale. L'apex di sinistra del lobo sinistro dovrebbe essere facilmente visualizzati (Figura 1, destra).
-
Dall'apice, amputare e pesare la quantità di tessuto da rimuovere.
- Usando le forbici micro-dissezione, delicatamente amputare la quantità desiderata di tessuto dall'apice del lobo di sinistra.
- Posizionare il tessuto amputato in una provetta da 1,5 mL riempita con PBS. Pesare il tessuto amputato utilizzando una bilancia analitica (Vedi Tabella materiali).
Nota: Posizionare un pezzo di garza o carta sulla bilancia e Tara si. Collocare il tessuto amputato sulla garza o carta, quindi misurare la sua massa. - Difficoltà della zona amputata in paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente per 1 h e posto in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto sopra ghiaccio secco per analisi sezione congelata. Analizzare le sezioni congelate di sezioni di taglio 7-10 µm utilizzando qualsiasi standard criostato.
- Utilizzando un pezzo arrotolato di garza, sostituire delicatamente il lobo di sinistra nella cavità peritoneale. Lasciare la garza nella cavità fino a quando l'emorragia si ferma.
- Rimuovere la garza e bagnato il sito chirurgico e l'area circostante con una garza imbevuta con PBS.
- Chiudere il sito chirurgico con il 6-0 monofilamento, suture non assorbibili con una filza. Il peritoneo e la pelle dovrebbe essere chiuso separatamente.
Nota: Bagnare delicatamente la pelle con una garza imbevuta con PBS può minimizzare la sutura indotto da lacrime. - Delicatamente ma accuratamente pulire il cucciolo con una garza imbevuta con PBS e non garantire nessun remains di sangue o betadine. La compressa di garza imbevuta di rotolo e pulire delicatamente sopra il segno della ferita di pulire qualsiasi sangue o betadine.
Nota: Questo è particolarmente importante in quanto la madre potrebbe cannibalizzare i cuccioli se vengono pulite adeguatamente. - Rimuovere il pup dal cono di naso e posizionarlo sulla zona di recupero che include i rilievi di garza esposti alla madre feci e nelle urine. Una volta che il cucciolo recupera, sostituire il cucciolo in gabbia vuota con biancheria da letto della madre.
Nota: Non utilizzare una lampada di calore. L'uso di una lampada di calore può causare il neonato a surriscaldarsi. - Ripetere la procedura sul numero desiderato di cuccioli. Anche se tutti i cuccioli possono essere utilizzati, è generalmente consigliabile lasciare pochi cuccioli non operati per essere sostituito insieme i cuccioli azionati.
- Sostituire tutti i cuccioli contemporaneamente con biancheria da letto della loro madre nella gabbia della madre.
4. il recupero e l'analisi
-
Follow-up sui topi al giorno.
- Controllare che la ferita rimane chiusa e rimuovere qualsiasi cuccioli morti, se presente.
- Se la ferita si riapre, preparare l'area chirurgica del sito e recupero come precedentemente descritti e ripetere i passaggi 3.8 a 3.12.
- Iniettare 5 mg/kg di carpofen per via sottocutanea 24 e 48 h dopo la procedura.
- Seguire i cuccioli per 56 giorni o più.
- Eutanasia degli animali dopo la quantità desiderata di giorni post-operatori di anidride carbonica (CO2) esposizione e dislocazione cervicale.
- Posizionare il mouse nell'induzione / camera di eutanasia e accendere il CO2 fino a topi smettere di respirare.
- Garantire l'eutanasia di dislocazione cervicale. Spingere verso il basso sul collo dorsale del mouse utilizzando la ribalta-dito e il pollice e con l'altra mano, tirare verso il basso sulla coda.
-
Rimuovere l'intero fegato in blocco e pesarlo.
- Attentamente separare ogni lobo e pesare separatamente.
Nota: Rimuovere il fegato da un'attenta dissezione dei vasi a membrana ed epatico e portale. Separa i lobi da altro dissecando attentamente ogni lobo al suo attaccamento prossimale.
- Attentamente separare ogni lobo e pesare separatamente.
- Determinare la portata di rigenerazione confrontando la massa del lobo di sinistra amputata alla massa del fegato intero. Un lobo di sinistra illeso è circa il 30% del fegato intero.
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Representative Results
Figura 1A i dettagli di una tempistica generale di neonatale epatectomia lobulare (schematica in Figura 1B) e della durata prevista di tempo di attesa fino a quando la rigenerazione è osservata. Sottile rigenerazione del lobo sinistro può essere osservato 7-14 giorni dopo l'intervento chirurgico. Rigenerazione completa è stata osservata spesso dopo 56 giorni dopo l'intervento. Topi dovrebbero non mostrano segni di anomalie fisiologiche dopo la chirurgia.
Topi sottoposti a parziale hepatectomies lobular permisero di recuperare per 2, 7, 14, 35 e 56 giorni. Ematossilina ed eosina (H & E) dei lobi sinistro feriti da questi topi dopo il recupero sono mostrati nella Figura 2. In particolare, dopo 56 giorni, lobo di sinistra amputato può apparire indistinguibile dal controllo, lobi illesi. Interventi chirurgici fatto su P14 topi giovani erano fatto per confronto e ha permesso di recuperare per 7, 14 e 56 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura S1).
Per caratterizzare la rigenerazione neonatale, 45 topi ha subito hepatectomy parziale lobular al giorno 0 e le masse di tutte loro lobi sono stati scattati 56 giorni dopo l'intervento. La massa del lobo di sinistra ferito ha subito un cambiamento maggiore in massa rispetto agli altri mediana illeso, bene e lobi Caudati (Figura 3A) e controlli illesi, avvicinando la massa di un lobo di sinistra illeso al P56. Questo indica che rigenerazione seguente al fegato neonatale è localizzato al lobo di sinistra. Interventi chirurgici fatto su P14 topi giovani sono state fatte per il confronto, che ha mostrato una riduzione di rigenerazione nel lobo di sinistra e una maggiore compensazione dai lobi illesi (Figura 3B), che indica che da 14 giorni, la risposta di lesione a resezione acuta passato dalla rigenerazione specifico lobo a compensazione globale. Ulteriore caratterizzazione è stato fatto dalla macchiatura aree del lobo di sinistra dai topi feriti al giorno postoperatorio 56 con actina filamentosa (f-actina) per visualizzare le membrane cellulari (Figura 4A). Aree distale e prossimale alla zona della ferita erano rispetto ai controlli illesi e lobi adulti 14 giorni successivi al 70% hepatectomies parziale. Gli epatociti sono stati trovati per avere aree simili controlli illesi, circa 1,5-2 x topi meno di adulti in fase di rigenerazione che segue 70% classica epatectomia parziale (Figura 4B). Ciò suggerisce che l'ipertrofia non svolge un ruolo nella rigenerazione. Infine, topi neonatali sono stati iniettati con 0,025 mg di 5-Etinil-2'-deoxyuridine (EdU) nel 90% di PBS e 10% di etanolo e 1, 3, 5, 7 e 14 giorni dopo la chirurgia. Il numero di cellule positive EdU sono stato contato da topi ha permessi di recuperare per 7 giorni dopo la chirurgia (Figura 4). Un aumento significativo del numero di cellule positive EdU sono stati trovati nel lobo sinistro ferito/rigenerante quando confrontati ai comandi illesi, che indicano che la proliferazione delle cellule contribuisce alla rigenerazione neonatale.
Figura 1: Lobular Hepatectomy parziale panoramica. (A) Un schema generale e timeline dell'epatectomia lobular è mostrato con resezione del fegato neonatale fattoa a P0. Analisi sono state fatte a P7, P14, P35 o P56. Le resezioni erano anche provate a P7 e P14. (B) un disegno schematico dell'entità della resezione del lobo di sinistra è mostrato, che delimitano le resezioni di 20 e 30%. (Questa figura è stata modificata da Tsai et al.) 6. (C) immagini da interventi chirurgici neonatale risultati: destra parteggiato emiclavicolare incisione (sinistra, centro) e l'esposizione dell'apice del lobo di sinistra (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rigenerazione che segue epatectomia parziale Lobular. Topi sottoposti a parziale hepatectomies lobulare in P0 sono stati seguiti per 2, 7, 14, 35 e 56 giorni. Fegati erano fissi e macchiati con H & E, e nella misura di rigenerazione dell'apex di sinistra è stata notata. Le frecce indicano aree dove la rigenerazione si è verificato nei topi di P0. Barra della scala è di 1 cm. Questa figura è stata modificata da Tsai et al. 6 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rigenerazione al lobo segue epatectomia parziale Lobular. (A) topi sottoposti hepatectomies lobular parziale in P0 sono stati analizzati alle 7, 35 e 56 giorni postoperatorio. Topi sono stati eutanasizzati e masse di tutti i lobi da topi feriti (rossi) vennero prese e confrontate per età abbinate masse di controllo illeso (rosso). (B) Topi sottoposti a parziale hepatectomies lobulare a P14 sono stati analizzati alle 7, 35 e 56 giorni postoperatorio. Masse di tutti i lobi da topi feriti (rossi) sono stati prese e rispetto alle masse di illeso controllo (rosso). * = p < 0,05, * * = p < 0,005, * * * = p < 0.0005, NS = non significativo. Questo figurato è stato modificato da Tsai et al. 6 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: caratterizzazione di rigenerazione Post epatectomia. (A) topi sottoposti hepatectomies lobular parziale in P0 sono stati analizzati 56 giorni dopo resezione e macchiato per F-actina. Immagini vengono mostrate delle macchie da aree prossimali e distali alla zona dell'amputazione, anche a partire da comandi di pari età illesi e da topi adulti 14 giorni dopo l'epatectomia parziale 70%. Barre della scala sono 100 µm. (B) zone di epatociti segue la ferita alle aree prossimale o distale il sito di resezione erano rispetto alle aree degli epatociti da controlli illesi e adulto 70% parziale hepatectomies.* = p < 0,05, * * = p < 0,005, * * * = p < 0.0005, * * * = p < 0,00005, NS = non significativo. (C) topi sottoposti hepatectomies lobulare in P0 sono stati trattati con EdU e sono stati analizzati 7 giorni dopo resezione. Cellule di EdU+ nel lobo di sinistra sono indicate. (Barra di scala, 100 µm). (D) quantificazione di EdU+ cellule nei topi trattati con EdU 7 e 14 giorni dopo epatectomia lobulare rispetto ai controlli. I valori sono mezzi ± SEM Questo figurato stato è modificato da Tsai et al. 6 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: rigenerazione incompleta di topi giovani. Topi sottoposti a parziale hepatectomies lobulare a P14 sono stati seguiti per 7, 35 e 56 giorni. Fegati erano fissi e macchiati con H & E e nella misura di rigenerazione dell'apex di sinistra è stata notata. Le frecce indicano aree dove la rigenerazione si è verificato nei topi di P0. Barra della scala è di 1 cm. Questo figurato è stato modificato da Tsai et al. 6 Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Ferita epatica acuta è stata studiata tradizionalmente usando chimico (paracetamolo, etanolo, tetracloruro di carbonio), o modelli chirurgici (70% epatectomia parziale). La risposta rigenerativa dopo hepatectomy parziale 70% è stata caratterizzata per coinvolgere l'ipertrofia degli epatociti globale e più cicli di divisione cellulare4,5. Per fermare un'emorragia, tuttavia, questo modello è limitato, come i vasi maggiori devono essere legati lasciando un ambiente anormale per la rigenerazione. Molti studi hanno impiegato quindi altri modelli meno invasive della ferita acuta attraverso danni chimici, lasciando l'architettura lordo in luogo per la rigenerazione si verifichi. Recentemente, Porrello et al e Chang et al hanno dimostrato una risposta rigenerativa neonatale contrassegnato differente dopo lesione acuta in cuore, consigli di cifre e orecchie7,8. Loro parallelo di risultati ha presentato le conclusioni che il fegato subisce anche un fenomeno rigenerativo distinto nella vita neonatale6. Con risultati simili multipli negli organi importanti, rigenerazione nelle prime fasi di sviluppo post-natale è un settore emergente con implicazioni potenziali per biologia delle cellule staminali.
Mortalità precoce da neonatale hepatectomies lobular parziale viene spesso da recupero inadeguato, emorragia principale o negligenza materna. Come affermato in precedenza, l'uso di una fonte di calore di intensità superiore ad esempio una lampada di calore per il recupero, possono portare alla morte dopo la chirurgia. Topi neonatali sono dipendenti dalla loro madre per almeno le prime due settimane di vita. Allo stesso tempo, la madre spesso trascurare e o cannibalizzare i suoi piccoli se essa percepisce un'anomalia (come il profumo del sangue o altre sostanze chimiche)24,25. Pertanto è molto importante che il neonato viene pulito accuratamente postoperatorio e strofinato con biancheria da letto materna per mascherare eventuali profumi offensivi. Se questi problemi vengono risolti adeguatamente, sopravvivenza può raggiungere fino al 100%. Se materna cannibalismo diventa un problema, i cuccioli possono trovarsi in una gabbia con una madre surrogata con alcuni dei suoi propri cuccioli. Se questo è il caso, è possibile utilizzare biancheria da letto della madre surrogata nei passaggi precedenti.
La resezione del 20-30% del lobo di sinistra neonatale e successiva rigenerazione è probabile non inerenti alla solo lobo di sinistra. Attualmente, questo metodo è stato testato solo sulla sinistra, come esporre la mediana e più lobi posteriori di destra e Caudati richiederebbe una laparotomia più grande, risultante in un rischio maggiore di emorragia e, indirettamente, un rischio maggiore di cannibalismo materna per il neonato. Tuttavia, se i meccanismi di rigenerazione neonatale sono eterogenei all'interno del fegato sono una domanda importante da affrontare, e quindi chirurgica al presente protocollo adeguamenti per interrogare gli altri lobi epatici.
I risultati di questi studi hepatectomy neonatale hanno indicato un periodo di tempo (P0-P7) durante il quale la rigenerazione è in grado di verificarsi. Le resezioni epatiche simili sono state fatte sui topi giovanili (P7, P10, P14) e non provocare la completa rigenerazione con cicatrice dimostrata e fibrosi, uno spazio libero dove si è verificato l'amputazione di marcatura. Anche se la risposta di lesioni nei topi giovanile dopo hepatectomy parziale lobular non era l'obiettivo di uno studio iniziale, la discrepanza in potenziale rigenerativo tra topi neonatali e giovanili e la perdita della capacità di ricostituire organi e tessuti architettura, sarà fondamentale per capire di quali cellule staminali o progenitrici di meccanismo rigenerazione neonatale si verifica.
Precedentemente abbiamo dimostrato che neonatali fegati rigenerati non solo appariranno lo stesso in architettura e la struttura, ma anche sono indistinguibili dalla funzione. Macchie di immunofluorescenza per funzionale degli enzimi epatici come glutamina sintetasi (GS), carbamoil sintetasi (CPS) e citocromo p450 2E1 mostrano una distribuzione simile all'interno di aree rigenerate rispetto ai lobi illesi. Tuttavia, il potenziale rigenerativo secondario di un neonato rigenerato non è stato testato. Come topi neonatali ammessi al recupero per 56 giorni sono fisiologicamente indistinguibili dai controlli illesi, è probabile che si sarebbe verificata la classica risposta rigenerativa segue adulto epatectomia parziale di 70%. Tuttavia, questo processo di rigenerazione epatica è spesso limitata ad esaurimento dell'epatocita, e quindi hepatectomies seriale seguendo hepatectomies lobular parziale sarebbe un importante studio.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Acknowledgments
Ringraziamo P. Chu per l'esecuzione di H & E e l'istologia; e Wang C. e r. McCarty per utili discussioni. Ricerca è stata sostenuta tramite finanziamento dalla Virginia e D. K. Ludwig Fund per ricerca sul cancro; il cuore nazionale, polmone e l'Istituto di sangue (R01HL058770 e U01HL099999); e il California Institute di medicina rigenerativa (RC1 00354) sovvenzioni al I.W. Y.R. è stato sostenuto da Human Frontier Science programma Career Development Award (CDA00017), la Fondazione di ricerca tedesca (RI 2787/1), l'Istituto di cellule staminali di Siebel e la Thomas e Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. è stato sostenuto dal NIH (T32GM007365), il premio di servizio di ricerca nazionale (1F30DK108561), Paul e Daisy Soros Fellowship per nuovi americani.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
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