Summary
כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור כריתה חלקית של האונה השמאלית הכבד בעכברים neonatal (יום 0). פרוטוקול חדש זה מתאים ללמוד פציעת כבד חריפה ותגובה פציעה בהגדרת neonatal.
Abstract
התחדשות האיברים מורפולוגי בעקבות איבוד רקמות חריפה נפוצה בקרב בעלי חוליות נמוכים יותר, אבל הוא לעיתים נדירות בחיי כמחנכת יונקים. למבוגרים התחדשות הכבד לאחר 70% hepatectomy חלקית תוצאות היפרטרופיה hepatocyte עם כמה שכפול באונות הנותרים שיקום של פעילות חילוף החומרים, אבל עם אובדן קבוע של אדריכלות ומורפולוגיה של האונה פצועים. כאן, אנו מפרטים שיטה כירורגית חדשה ב neonate זה משאיר סביבה הפיזיולוגיות להצטיינות התחדשות. מודל זה כולל כריתה של האונה השמאלית השיא, משטר ניהול שמרנית עוקבות, חסרה את הצורך מצדו של כלי כבד הגדולות או פגיעה כימית, עוזב סביבה הפיזיולוגיות בו התחדשות עלולה להתרחש. אנו להרחיב את פרוטוקול זה כדי כריתות על ילדותי עכברים (P7-14), שבמהלכו הכבד נפגע המעברים של התחדשות האיברים לצמיחה לפיצוי על ידי היפרטרופיה. פרוטוקול שהוצגו, קצר 30 דקות מספק מסגרת כדי ללמוד על מנגנוני התחדשות שלה ירידה גיל-הקשורים ביונקים, אפיון בשם גזע כבדית או אבות.
Introduction
כבר חשבה את היכולת להתחדש איבר, או לשחזר צורה ותפקוד, ללכת לאיבוד בעיקר לאורך זמן אבולוציונית. פוטנציאל הרגנרציה של הכבד יונקים בוגרים לאחר פגיעה חריפה כימיים או פיזיים נמצאה לערב גיוס כל hepatocytes הנותרים וכתוצאה מכך גלים של היפרטרופיה כמה סיבובים של חלוקת התא, וכתוצאה מכך אך פונקציונלי איברים שונים מבחינה ארכיטקטונית1,2,3,4,5. לאחרונה, מחקרים החלו לאפיין את התגובה הרגנרציה של איברים יונקים neonatal לפגיעה בתוך השבוע הראשון של החיים-6,-7,-8. מחקרים אלה הראו כי כאשר נפגע במהלך הפיתוח neonatal, איברים יונקים מסוימים להגיב עם התחדשות מורפולוגי במקום לתת פיצוי הצמיחה או פיברוזיס7,8.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חידוש עולמי מבנה ותפקוד מתרחשת במהלך7,התקופה neonatal6,מוקדמת8. פגיעה בכבד הוקמה פרוטוקולים כרוכה פגיעה כימית או מנהלה של אתנול9,10,11, פרצטמול12,13,14,15 , tetrachloride פחמן16,17,18,19, 70% hepatectomy חלקי4,20,21או הסרה של השמאל, אונות החציוני. ניהול כימי מובילה למוות תא hepatocyte, אבל לעתים קרובות משאיר מיקרו-מאקרו-מבנים שלמים. התחדשות מורפולוגיות לא יכול להילמד ברצון בהקשר זה, כפי הארכיטקטורה הכוללת הכבד לא יצורים שנכחדו. Hepatectomy חלקית 70% כרוך מצדו בתפר של כלי מרכזי, אשר יש צורך לעצור את הדימום, אבל משאיר סביבה שאינם הפיזיולוגיות עם הפרעה קבועה של להערכת. יתר על כן, שיטה זו שימש רק על מכרסמים למבוגרים, היישום שלה כדי neonates טכנית קשה מאוד. עם זאת, פיתחנו שיטת עבודה שבו יוסר 20-30% השיא של האונה השמאלית של עכבר P0 היילוד (איור 1A-1B). שיטה זו בניתוח השמרני, פולשנית, לא באופן טכני מאתגר, ומוביל ברוטו אובדן של מורפולוגיה בלי מצדו של להערכת, השארת מקום התחדשות להתרחש. פרוטוקול צעד אחר צעד וכתוצאה מכך, המתוארים להלן, מאפשרת לכל חוקר לביצוע של hepatectomy lobular חלקית על עכברים neonatal ללימוד בתרבית של התחדשות neonatal בשלבים המוקדמים של החיים אחרי לידה. בשיטה זו יש גם יישומים ברורים השוואתי רפואה רגנרטיבית וביולוגיה תאי גזע, זה יכול לשמש בכבד במהלך ובשלבים מאוחרים יותר של החיים.
המחקרים פציעת כבד חריפה הנפוצים ביותר הם נזק בהשפעת כימיקלים, קטיעה הכבד למבוגרים או 70% hepatectomy חלקית. נזק כימי לעתים קרובות כרוך הניהול תוך ורידי, בקרום הבטן או אוראלי של פרצטמול, tetrachloride פחמן או אתנול, מודל פגיעה קלה יחסית, לא פולשנית. כפי שכבר שוחחנו, גורמת נזק כימי מוות של תאים hepatocyte, אבל לעתים קרובות עלים משתית parenchyma מבנים שלמים, ומקשה על טענות על התחדשות מורפולוגיות. נזק כימי לעיתים קרובות מרכזי על כלי הכבד, שהופך אותו טכניקה שימושית ללמוד באתר תא ספציפי פציעה, אבל גם מקשה לחקור, ברמת כל האיבר, אוכלוסיות אחרות זה יכול להיות ממוקם רחוק יותר מכלי, זה ייתכן לתרום התחדשות. למרות מגבלות אלו, נזק כימי נשאר עדיין מודל שימושי ורלוונטי מאוד מבחינה פיזיולוגית פציעה.
למבוגרים 70% hepatectomy חלקית כרוכה הסרת האונות החציוני ושמאלה בעקבות מצדו של להערכת הכבד. מאפיין היטב בתגובה hepatectomy: הכבד הקטוע 14 ימים פוסט 70% hepatectomy חלקית מפתחת ארכיטקטורת בגסות שונה מזו של האונה ניזוק המקורי, כמו hepatocytes של האונות המזונבת וימינה הנותרים עוברים היפרטרופיה, כמה. סיבובים של חלוקת התא4,5. זה מפצה לאיבוד מסת ותפקוד, אך נכשל להתחדש שתי האונות הקטוע, ולכן אינו מהווה תחליף מורפולוגיה ברוטו. כתוצאה מכך, התגובה פציעה hepatectomy חלקי 70% שימושי ללמוד מנגנוני פיצוי צמיחה התחדשות מוגבלת.
כאן, באופן מלא נתאר עבור hepatectomy lobular חלקית neonatal פרוטוקול. ההליך כרוך הבחירה בעלי חיים המתאים, הכנה, הכנה דימומים, ניתוח ושחזור. אופטימיזציה והתאמה של כל אחד מהצעדים הללו ייתכן שתידרש עבור יישומים שונים של הפרוטוקול.
לנו יש בהרחבה לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה פראי סוג C57BL/6J הגורים (ג'אקס 000664), לעומת זאת, במחקר אוכלוסיות תאים שונים ומנגנונים של התחדשות, השתמשנו גם חיות הטרנסגניים שונות לרבות עכברים מחסה Cre שונים, CreERT2 transgenes ו/או טוק-in (ג'אקסAxin2CreERT2 018867, ו Sox9CreERT2 ג'אקס 018829) בשילוב עם כתבים פלורסנט, כגון מערכות הקשת ו- mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. מצאנו אין צורך לשנות מתודולוגיה זו עבור זנים העכבר שונים, כאשר אין הבדלים תוצאות ההישרדות או פוטנציאל הרגנרציה נצפו.
בנוסף לשימוש זנים בעלי חיים שונים, אנחנו גם לבצע hepatectomies lobular חלקית על neonatal עכברים שטופלו מולקולות קטנות, כגון 4-הידרוקסי-טמוקסיפן ו- 5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine (אדו). דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואתנול שימשו ממיסים, כפי נמצא שכי שמן תירס היה מטרה משמעותית של תחלואה. אחרת מצאנו כי הממשל בקרום הבטן של מולקולות קטנות לא השפיע על הישרדות או תוצאות משובי. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מותאם לשימוש עם מולקולות קטנות אחרות לחקור היבטים שונים של התחדשות.
העכבר neonatal ניתוחים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, מחייבות מומחיות מיוחדת לטיפול בבעלי חיים, ניתוח מיקרוסקופי. גידול בעלי חיים מומחיות יש צורך להימנע קניבליזם אימהית בעקבות הניתוח, במהלך תקופת ההחלמה מיידית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המנחים שנקבעו על ידי האגודה מגוונת פאנל ניהול הסמכה של מעבדה חיה אכפת הבינלאומי (AAALAC) ואת אוניברסיטת סטנפורד על חיות מעבדה טיפול (APLAC), (פרוטוקול מס ' #10266), ארצות הברית, או חוק האירופית בעלי חיים רווחה, דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי. הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של ממשלת בוואריה, גרמניה, וקיבל את ההרשאה לא: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. הכנה בעלי חיים
- הכן של כלוב ריק עם מצעים המתאימים על כרית החימום.
- לפני מגע חיות עם כפפות, לשפשף המצעים של האם אל הכפפות.
- הסר כל הגורים שלהם אמא ומקום לתוך הכלוב ריק. להסיר חלק מצעים של האם ולמקם אותו בכלוב ריק עם הגורים.
- מקם את האמא בכלוב נפרד, נקי, יבש מהשדה כירורגי.
- דון כפפות חדש, נקי סטרילי לפני ההכנה דימומים.
2. דימומים הכנה
- באמצעות פיפטה של 10-mL, להוסיף 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) צלחת פטרי 10-ס מ.
- פיפטה 2 מ של פתרון ואנטיספטיות betadine או שווה ערך הפטרי ס מ-10.
- במקום טווח ויבתר על השדה הכירורגי. להפעיל לנתח היקף המנורה ולהתאים את רמת האור כדי לנחם את המנתח. גור ניתן להציב בשטח כירורגית מתחת למנורה היקף ויבתר. אור נאותה יכול להיות מאושרות על ידי העדר של צללים על המשטח הגחון של הכלבלב.
- הכינו את תא הרדמה איזופלוריין (ראה טבלה של חומרים) עם קונוס האף. החדר צריך לנקות ללא עדות שתן או צואה. מקם את האף חרוט ואת צינורות המשויך מתחת למיקרוסקופ ויבתר בשטח כירורגית. להטות את זרימת החמצן ואת איזופלוריין אך ורק כדי קונוס האף.
- הכנת אזור ההחלמה שלאחר הניתוח עם כרית חימום להגדיר כ 37 מעלות צלזיוס. ההחלמה לאחר הניתוח צריכה להכיל 4 חתיכות של גזה הממוקמת מעל כרית החימום. במידת האפשר, לשפשף תחבושות גזה מצעים של האם, צואה, שתן כדי לשמר את הריח של האם.
הערה: זה לא נבונה להשתמש מנורת חימום, כמו זה מקשה לשלוט בטמפרטורה. טמפרטורות גבוהות תגרום למותם של עכברים neonatal. - להכין ולחטא את כל מכשירי ניתוח עם החיטוי. הכלים הדרושים כוללים: מספריים לנתח מיקרו מלקחיים לנתח מיקרו, גזה, עוצר דימום, תפרים נספגים monofilament כל 6-0. מכשירי ניתוח יכול להיות resterilzed עם כל מעקר חרוז זכוכית.
3. חלקית Hepatectomy Lobular
- עזים ומתנגד הכלבלב זה, האף חרוט על שלה בחזרה ובעדינות מקליטה את הרגליים והידיים, במקום להניח. הגורים אמורים לקבל איזופלוריין 5% חמצן.
- לאפשר הכלבלב לשבת במשך 5 דקות או עד שלמאחה מרדימים, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקת קורט הבוהן.
- להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carprofen subcutaneously לפני החיתוך.
הערה: כל הניתוח לא דרושות יותר מאשר תוצאות עניים 30 דקות עלולים להיות שנצפו ב- neonates הנמצאות תחת הרדמה כללית במשך יותר מ 30 דקות. לנקוט אמצעי זהירות כדי לצמצם את משך הניתוח דרך הכנה יסודית שדה, הרטבה של העור לפני הסגר כדי למזער את התפר המושרה העור דמעות.
- לנקות בעדינות הבטן מהקיר האחורי עם כרית קטנה גאזה רטוב עם betadine. לאפשר את הבטאדין לייבוש על 1 דקות.
- עושים חתך אמצע-בריחי השמאלי 0.5 ס מיד מתחת הצלעות עם מספריים לנתח מיקרו, מלקחיים. בעדינות להפריד את העור באמצעות מלקחיים, עושים חתך עמוק השני לתוך חלל הצפק (ראה איור 1C, מרכז ושמאלה)
- בעדינות לרוחב ללחוץ משני צידי הבטן באמצעות חזרה, מסתיים בוטה של לנתח מיקרו מספריים, מלקחיים כדי לאלץ את השיא של האונה השמאלית מתוך חלל הצפק. השיא השמאלי של האונה השמאלית צריך להיות מטמיעים בקלות (איור 1C, נכון).
-
מהקודקוד, לקטוע ולשקול את כמות רקמת יוסרו.
- בעדינות בעזרת המספריים ניתוח מיקרו, לקטוע את הכמות הרצויה של רקמות מן השיא של האונה השמאלית.
- המקום הרקמה הקטוע לתוך צינור 1.5-mL מלא PBS. שוקל הרקמה הקטוע באמצעות איזון האנליטי (ראה טבלה של חומרים).
הערה: מניחים חתיכת גזה או נייר על האיזון, להקרע זה. ואז למקם את הרקמה הקטוע גזה או נייר ולמדוד את המסה. - לתקן אזור הקטוע ב- 2% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 1 h ומקום טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) המורכב על קרח יבש לניתוח באזור הקפואים. לנתח את סעיפים קפוא על ידי חיתוך 7-10 מיקרומטר למקטעים באמצעות כל cryostat רגיל.
- בעדינות באמצעות פיסת גזה מגולגלת, להחליף האונה השמאלית לתוך חלל הצפק. להשאיר את הגזה בחלל עד התחנות דימום.
- הסר את הגזה, רטוב באתר כירורגית והסביבה עם גזה ספוגה PBS.
- לסגור את האתר כירורגית עם 6-0 monofilament, תפרים נספגים עם תפר פועל. צפק ו העור צריך להיות סגור בנפרד.
הערה: הרטבת בעדינות את העור עם גזה ספוגה PBS עשוי למזער תפר המושרה דמעות. - בעדינות אך ביסודיות לנקות את הגור עם גזה ספוגה PBS וודאו כי לא נשאר בדם או betadine. לגלגל את פד גזה ספוגים, לשפשף בעדינות מעל השלט הפצע כדי לנקות דם או betadine כלשהם.
הערה: זה חשוב במיוחד כמו האם ייתכן משמידה את הגורים אם הם מנוקים כראוי. - להסיר את הכלבלב קונוס האף ומניחים אותו על האזור השחזור הכולל את תחבושות גזה, חשופים צואה ושתן של האם. ברגע הכלבלב מתאושש, החלף את הגור בכלוב ריק עם המצעים של האם.
הערה: אין להשתמש מנורת חימום. השימוש של מנורת חימום יכול לגרום את neonate להתחמם יתר על המידה. - חזור על הפעולות על המספר הרצוי של הגורים. למרות כל הגורים ניתן להשתמש, זה בדרך כלל רצוי להשאיר מספר הגורים לא ניתחתי להחליפו יחד עם הגורים המופעלים.
- החלף כל הגורים בו זמנית מצעים של אמם בכלוב של האם.
4. שחזור וניתוח
-
מעקב על העכברים מדי יום.
- בדוק הפצע נותר סגור ולהסיר כל הגורים מתים, אם קיים.
- אם הפצע יפתח, להכין את האזור הכירורגי של האתר ושחזור בעבר המתואר, חזור על צעדים 3.8 ל 3.12.
- להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carpofen subcutaneously 24 ו 48 h בעקבות ההליך.
- בצע הגורים 56 ימים או יותר.
- המתת חסד החיות לאחר הסכום הרצוי של ימים לאחר הניתוח על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) נקע בצוואר הרחם.
- הכנס עכברים אינדוקציה / המתת חסד קאמרית, הפעל את ה-CO2 עד עכברים מפסיק לנשום.
- ודא המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. לוחץ על הצוואר הגבי של העכבר באמצעות ביטוי-אצבע האגודל, בעזרת היד השנייה, למשוך למטה על הזנב.
-
הסר את כל הכבד en bloc , שוקל אותה.
- בזהירות להפריד בין האונה כל ולשקול בנפרד.
הערה: להסיר את הכבד על ידי ניתוח זהיר של כלי הסרעפת ואת ולשננו פורטל. הפרד בין האונות אחד מהשני על ידי בזהירות לנתח כל אונה-מצורף proximal שלה.
- בזהירות להפריד בין האונה כל ולשקול בנפרד.
- לקבוע את מידת ההתחדשות על ידי השוואה בין המסה של האונה השמאלית הקטוע למסה של הכבד כל. האונה השמאלית שציווית הוא כ-30% כל הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מפרט כללי ציר זמן של neonatal חלקית lobular hepatectomy (סכמטי של איור 1B), ואת אורך זמן לחכות עד התחדשות נצפית הצפוי. התחדשות עדין של האונה השמאלית יכול להיות שנצפו 7-14 ימים שלאחר ניתוח. התחדשות מלא לעתים קרובות נצפתה לאחר 56 ימים לתגובה. עכברים צריך להראות סימנים של ליקויים הפיזיולוגיות לאחר הניתוח.
עכברים שעברו חלקית hepatectomies lobular הורשו שחזור עבור 2, 7, 14, 35 ו 56 ימים. Hematoxylin אאוזין (H & E) של האונות שמאל פצוע מן אלו עכברים אחרי התאוששות מוצגים באיור2. ראוי לציין, לאחר 56 ימים, האונה השמאלית הקטוע אולי נראה להבחין מגניחותיה שליטה, האונות שציווית. ניתוחים על P14 עכברים ילדותי היו נעשה לשם השוואה, מותר להתאושש במשך 7, 14, ו 56 ימים פוסט ניתוח (איור S1).
כדי לאפיין התחדשות neonatal, עכברים 45 עבר חלקית hepatectomy lobular ביום 0 ורשום ההמונים כל האונות שלהם נלקחו 56 ימים ניתוח. המסה של האונה השמאלית פצוע עברה שינוי עלייה במסה לעומת חציון שציווית, נכון, האחר, האונות המזונבת (איור 3A) ו פקדים שציווית, מתקרב המסה של האונה השמאלית שציווית ב P56. אפשרות זו מציינת את התחדשות הבאים פגיעה בכבד neonatal הוא מקומי כדי האונה השמאלית. ניתוחים על P14 עכברים לנוער נעשו לשם השוואה, אשר הראו ירידה התחדשות האונה השמאלית, פיצוי מוגבר של האונות שציווית (איור 3B), המציין לפי 14 ימים, התגובה פגיעה חריפה כריתה החליפו של התחדשות ספציפי באונה פיצוי גלובלי. אפיון נוסף נעשה על ידי צביעת אזורים של האונה השמאלית של עכברים נפצעו ביום שלאחר הניתוח 56 עם אקטין filamentous (f-אקטין) כדי להמחיש את קרום התא (איור 4A). אזורי דיסטלי ו- proximal לאזור הפגיעה הושוו פקדים שציווית, האונות למבוגרים 14 ימים לאחר 70% hepatectomies חלקית. Hepatocytes נמצאו אזורים דומים כפקדי שציווית, על 1.5-2 x עכברים בוגרים פחות בתהליך התחדשות בעקבות קלאסית 70% חלקית hepatectomy (איור 4B). הדבר מצביע על היפרטרופיה זה לא משחק תפקיד של התחדשות. לבסוף, עכברים neonatal הוזרקו 0.025 מ ג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) ב- 90% PBS ו-10% אתנול, 1, 3, 5, 7, ו- 14 ימים לאחר הניתוח. מספר התאים חיובי אדו נספרו של עכברים מותר להתאושש במשך 7 ימים לאחר ניתוח (איור 4C). עלייה משמעותית מספר התאים חיובי אדו נמצאו באונה נפגע/רגנרציה השמאלי בהשוואה פקדים שציווית, המציין כי התפשטות תאים תורמת לחידוש neonatal.
איור 1: סקירה חלקית Hepatectomy Lobular. (א) מפרטים טכניים כללי וציר של hepatectomy lobular חלקית מוצג עם כריתה הכבד neonatal הנעשית P0. ניתוחים נעשו-P7, P14, P35 או P56. כריתות נשפטו גם P7 ו P14. (B) A תרשים סכמטי של היקף כריתה של האונה השמאלית מוצג, התוחם כריתות 20 ו- 30%. (איור זה השתנה מ. Tsai et al.) 6. (ג) תמונות מניתוחים neonatal מציג: ימין צדדית החתך האמצע-בריחי (משמאל, במרכז) וחשיפה של האונה השמאלית השיא (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: התחדשות בעקבות Hepatectomy Lobular חלקית. עכברים שעברו hepatectomies lobular חלקית-P0 עקבו במשך 2, 7, 14, 35 ו 56 ימים. הכבדים היו קבועים, מוכתם H & E, היקף התחדשות של השיא שמאלה צוין. החיצים מציינות אזורים שבו אירעה התחדשות בעכברים P0. סולם בר הוא 1 ס מ. איור זה היה שונה. Tsai et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: התחדשות לכל האונה בעקבות Hepatectomy Lobular חלקית. עכברים (א) העובר hepatectomies lobular חלקית-P0 נותחו 7, 35 ו 56 ימים וכאב לאחר הניתוח. עכברים היו מורדמים, המוני אונות כל מן הפצועים עכברים (אדום) היו לקחו, לעומת גיל מתאימים המוני שציווית שליטה (אדום). (B) עכברים שעברו hepatectomies lobular חלקית-P14 נותחו 7, 35 ו 56 ימים וכאב לאחר הניתוח. המוני אונות כל מן הפצועים עכברים (אדום) היו לקחו, לעומת ההמונים השליטה שציווית (אדום). * = p < 0.05, * * = p < 0.005, * * * = p < 0.0005, NS = לא משמעותי. . אל תדאגי שונתה מ. Tsai et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אפיון של התחדשות פוסט Hepatectomy. עכברים (א) העובר hepatectomies lobular חלקית-P0 היו ניתח 56 ימים לאחר כריתה, מוכתם F-אקטין. תמונות מוצגות כתמים מאזורים לקרע, לאזור של קטיעה, כמו גם החל תואם גיל פקדים שציווית, ומתוך עכברים בוגרים 14 ימים לאחר 70% hepatectomy חלקית. סולם ברים הם 100 מיקרומטר. (B) תחומי hepatocytes בעקבות פגיעה ב אזורים קרובים או דיסטלי לאתר כריתה לעומת תחומי hepatocytes פקדים שציווית, למבוגרים 70% hepatectomies.* חלקית = p < 0.05, * * = p < 0.005, * * * = p < 0.0005, * * * = p < 0.00005, NS = לא משמעותי. (ג) עכברים שעברו hepatectomies lobular-P0 שטופלו אדו, נותחו 7 ימים לאחר כריתה. אדו+ תאים באונה השמאלית מוצגים. (סולם בר, 100 מיקרומטר). (ד) כימות של אדו+ תאי עכברים שטופלו אדו 7 ו-14 ימים בעקבות חלקית hepatectomy lobular לעומת שולט. ערכים הם אמצעי ± ב- SEM. . אל תדאגי כבר שינה מ. Tsai et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור S1: התחדשות לא שלם של עכברים לנוער- עכברים שעברו hepatectomies lobular חלקית-P14 עקבו במשך ימים 7, 35 ו- 56. הכבדים היו קבועים, מוכתם H & E, היקף התחדשות של השיא שמאלה צוין. החיצים מציינות אזורים שבו אירעה התחדשות בעכברים P0. סולם בר הוא 1 ס מ. . אל תדאגי שונתה מ. Tsai et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פגיעה כבדית חריפה באופן מסורתי נחקרה באמצעות חומר כימי (פרצטמול, אתנול, פחם tetrachloride), או מודלים כירורגי (70% hepatectomy חלקית). התגובה הרגנרציה לאחר 70% hepatectomy חלקי מאפיין לערב היפרטרופיה hepatocyte הכללית, מספר סיבובים של חלוקת התא4,5. לעצירת דימום, עם זאת, מודל זה היא מוגבלת, שכן כלי מרכזי חייב להיות מאתרים עוזב סביבה חריג עבור התחדשות. מחקרים רבים ולכן המועסקים דגמים אחרים פחות פולשני של פגיעה חריפה דרך נזק כימי, עוזב את הארכיטקטורה מגעיל במקום עבור התחדשות להתרחש. לאחרונה, Porrello. et al. , צ'אנג. et al. הראו תגובה משובי neonatal שונה במידה ניכרת לאחר פגיעה חריפה הלב, ספרות עצות ולאחר האוזניים7,8. במקביל התוצאות שלהם הציגה מסקנות הכבד עובר גם תופעה משובי ברורים החיים neonatal6. עם מספר ממצאים דומים באיברים העיקריים, התחדשות בשלבים המוקדמים של פיתוח אחרי לידה הוא שדה המתעוררים עם השלכות אפשריות של ביולוגיית תאי הגזע.
תמותה מוקדמת מ- neonatal חלקית hepatectomies lobular נובע לעיתים קרובות לקוי ההחלמה, בדימום או הזנחה אימהית. כאמור, השימוש של מקור חום בעוצמה גבוהה יותר כגון מנורת חימום עבור שחזור, עלול להוביל למוות לאחר ניתוח. עכברים neonatal תלויות אמא שלהם בשביל לפחות השבועיים הראשונים של החיים. במקביל, האם לעיתים קרובות מזניחים או משמידה הצעירים שלה אם היא חשה24,חריגות (כגון הניחוח של דם או חומרים כימיים אחרים)25. לכן זה מאוד חשוב כי neonate ניקה ביסודיות וכאב לאחר הניתוח, שפשף עם מצעים אימהי להסוות ריחות התקפית כלשהי. אם בעיות אלה מטופלות כראוי, הישרדות יכול להגיע עד ל 100%. אם קניבליזם אימהי הופך להיות בעיה, ניתן להציב את הגורים לתוך כלוב עם פונדקאית עם חלק הגורים שלה. אם זה המקרה, להשתמש במצעים של האם הפונדקאית בשלבים הקודמים.
ההסרה של 20-30% של האונה השמאלית neonatal, התחדשות עוקבות סביר התברואתית לא רק האונה השמאלית. כיום, שיטה זו נבדק רק בצד השמאל, כפי שחשף את החציון ואת עוד האחורי האונות המזונבת וימינה יצריכו של פתיחת בטן גדולה יותר, וכתוצאה מכך סיכון גבוה יותר של דימום, בעקיפין, סיכון גבוה יותר של קניבליזם אימהית על neonate. אולם, המנגנון של התחדשות neonatal הטרוגנית בתוך הכבד היא שאלה חשובה יש לטפל, ולכן התאמות כירורגי פרוטוקול זה צריך להיעשות כדי לחקור את אונות הכבד אחרים.
התוצאות ממחקרים אלה neonatal hepatectomy הראו פרק זמן (P0-P7) שבמהלכו התחדשות היא היכולת להתרחש. כריתות הכבד דומים נעשו על עכברים לנוער (P7, P10, P14) ואת התוצאה אינה מלאה התחדשות עם צלקת והפגינו, פיברוזיס, סימון אזור. נקי שבו אירעה הכריתה. למרות התגובה פציעה בעכברים לנוער בעקבות hepatectomy lobular חלקית לא היה במוקד המחקר הראשונית, צעיר ומעודכן פוטנציאל הרגנרציה בין עכברים neonatal וילדותי, אובדן היכולת לשקם איברים ורקמות אדריכלות, תהיה חיונית להבנת על ידי תאי גזע או קדמון איזה מנגנון התחדשות neonatal מתרחשת.
בעבר הראו כי neonatal כבדי מחדש יופיעו באותה צורה של הארכיטקטורה והמבנה אלא גם הם נבדלים על ידי פונקציה. Immunofluorescence כתמי עבור פונקציונליות אנזימי הכבד כגון המעביר גלוטמין (GS) carbamoylphosphate המעביר (CPS), ציטוכרום p450 2E1 להראות בהתפלגות דומה בתוך תחומי regenerated בהשוואה אונות שציווית. עם זאת, הפוטנציאל משובי המשני של neonate מחדש לא נבדקו. כמו עכברים neonatal מותר להחלמה 56 ימים הם מבחינה פיזיולוגית להבחין מגניחותיה פקדים שציווית, סביר להניח כי התגובה משובי קלאסית בעקבות למבוגרים 70% hepatectomy חלקי יתרחש. עם זאת, התחדשות הכבד הזה לעיתים קרובות מוגבל על ידי מיצוי hepatocyte, לכן יהיה סדרתי hepatectomies בעקבות hepatectomies lobular חלקית מחקר חשוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים.
Acknowledgments
אנו מודים עמ' צ'ו לביצוע H & E והיסטולוגיה; וואנג ג. ו א מקארתי לדיונים מועיל. המחקר נתמך באמצעות מימון וירג'יניה ו ד K. לודוויג הקרן לחקר הסרטן; הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL058770 ו- U01HL099999); מכון קליפורניה מענקים רפואה רגנרטיבית (RC1 00354) I.W. Y.R. ונתמך על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הקריירה פיתוח בפרס (CDA00017), קרן מחקר גרמני (2787 RI/1), מכון תאי גזע של Siebel, ו תומאס, סטייסי Siebel קרן (1119368-104-GHBJI). J.M.T. נתמכה על ידי NIH (T32GM007365), בפרס שירות המחקר הלאומית (1F30DK108561), ואת פול דייזי סורוס מלגת האמריקאים החדשים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L.
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
