Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.
Abstract
Para identificar o papel de uma subpopulação de neurônios no comportamento, é essencial para testar as consequências do bloqueio de sua atividade em animais vivos. Remoção a laser de neurônios é um método eficaz para essa finalidade quando os neurônios são etiquetados seletivamente com sondas fluorescentes. No presente estudo, são descritos os protocolos para laser retirando uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões e testes de suas consequências funcionais e comportamentais. Neste estudo, o comportamento de captura de presas em larvas de zebrafish é usado como um modelo de estudo. O circuito pretecto-hipotalâmico é conhecido por fundamentam esta presa visualmente orientado, captura o comportamento. Zebrafish pretectum foram retirado de laser, e atividade neuronal no lobo inferior do hipotálamo (ilha; o alvo da projeção pretectal) foi examinada. Comportamento de captura de presas após ablação pretectal também foi testado.
Introduction
Para entender como o comportamento surge da atividade neuronal no cérebro, é necessário identificar os circuitos neurais envolvidos na geração desse comportamento. Na fase larval, o zebrafish fornece um modelo animal ideal para estudar a função do cérebro associada com o comportamento porque seus cérebros pequenos, transparentes tornam possível investigar a atividade neuronal em uma resolução de celular em uma ampla área da cérebro enquanto observa o comportamento1. Imagem de atividade neuronal em neurônios específicos tornou-se possível graças a invenção dos indicadores geneticamente codificado cálcio (Ca) (GECIs), tais como GCaMP2. GCaMP zebrafish transgênico tem provado para ser útil para associar o circuito neural funcional com comportamento através da realização de imagem Ca em comportar-se de animais3.
Enquanto a imagem de Ca pode demonstrar correlações entre a atividade neuronal e comportamento, para mostrar a causalidade, supressão da atividade neuronal e testar sua consequence(s) sobre o comportamento são passos importantes. Existem várias maneiras de conseguir isso: uso de mutação genética que altera os circuitos neurais específicos4, expressão de neurotoxinas em neurônios específicos5,6, uso de ferramentas de optogenetic como halorhodopsin7, e do laser ablação de neurônios alvo8,9. Ablação a laser é particularmente adequada para eliminar a atividade em um número relativamente pequeno de neurônios específicos. Facilita a eliminação irreversível da atividade neuronal, matando os neurônios avaliar consequências comportamentais.
Um comportamento interessante que pode ser observado na fase larval no zebrafish é a captura de presas (Figura 1A). Esse comportamento visualmente guiadas, objetivo-dirigido fornece um sistema experimental favorável para o estudo da acuidade visual10, transformação visuomotoras11,12,13, percepção visual e reconhecimento de objetos14,15,16,17,18e tomada de decisão19. Como presa é reconhecida por predadores e como a deteção da rapina leva a presa captura o comportamento tem sido uma questão central na neuroetologia20. Neste artigo, enfocamos o papel do circuito pretecto-hipotalâmico formado por projeções de um núcleo no pretectum (núcleo pretectalis superficial pars magnocellularis, daqui por diante, conhecido simplesmente como o pretectum) para a ilha. Ablação a laser do pretectum foi mostrado para reduzir a atividade de captura de presas e abolir a atividade neuronal na ilha que está associada com o de percepção visual presa21. Aqui, os protocolos para a realização de laser ablação e teste seu efeito usando imagens de Ca2 + e gravação comportamental no zebrafish larvas são descritas.
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Protocol
1. ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões Laser
Nota: Se os usuários planejam realizar ablação seguinte imagem de Ca, use o UAShspzGCaMP6s linha21. Se os usuários planejam realizar gravação comportamental após ablação, use a linha de UAS:EGFP, como a ablação das células EGFP-positivo é mais fácil de realizar do que de células GCaMP6s-expressando.
- Começar por preparar o acasalamento de uma linha de Gal4 que rotula neurônios específicos a ser estudado e UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Não se esqueça de usar o fundo de nácar para ambos os pais, para que o nácar homozigotos podem ser obtidos.
Nota: Homozigotos de nácar não contenham nenhum melanóforos na superfície do corpo (Figura 1B). No presente estudo, uma gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 (que rotula o pretectum) e outro Gal4 linha hspGFFDMC76A (que rotula a ilha) são usados21. - No dia seguinte da instalação do acasalamento, recolher os ovos de peixe-zebra e criá-los para a fase larval, no ponto em que os neurônios de interesse irão expressar repórteres fluorescentes.
- Monte a larva de zebrafish em 2% baixo ponto de fusão-agarose (Figura 1B).
- Comece por preparar a solução de agarose 2%: dissolver 2 g de pó de baixo ponto de fusão de agarose em 100 mL de água do sistema (ou seja, a água usada para manter o zebrafish adulto em um sistema de água circulante)22 ou E3 água23, trazendo a água para o ponto em um microondas de ebulição e misturar vigorosamente.
- O estoque de baixo ponto de fusão de agarose 2% no microondas até ferver. Despeje o 3,5-4,0 mL do agarose para a tampa de um prato de Petri de 6 cm. Espere até que a agarose esfria para que está quente ao toque antes de prosseguir.
- Em seguida, coloque uma única larva (não anestesiada nesta etapa) no agarose. Manter a posição e orientação da larva de ajuste para que fique na posição vertical, usando uma agulha de dissecação (Figura 1C), até que a agarose solidifica para assegurar o correcto posicionamento da larva.
Nota: A larva vai continuar a nadar ao redor enquanto se solidifica a agarose. - Uma vez que a larva é posicionada, permita 5 min para o agarose solidificar completamente.
- Verta o agarose, 5 mL de solução metanosulfonato (0,4% a 1 x concentração de trabalho).
Nota: Para evitar movimentos por larvas durante ablação a laser, as larvas devem ser mantidas anestesiadas durante todo o procedimento de ablação.
- Ablação a larva usando a função clareador em um sistema de microscopia de dois fotões laser.
- Coloque a larva de agarose-incorporado sob um microscópio de exploração do laser de dois fotões e iniciar o sistema de microscopia.
- Inicie o software de aquisição de imagem e clique no botão "On" na guia "Laser" para ligar o laser (Figura 1D). Esperar que o "Status" do laser para mudar de "Ocupado" para "Modo bloqueado".
- Na guia "Canais", definir o comprimento de onda do laser em 880 nm (potência máxima: aproximadamente 2.300 mW) para ablação de EGFP, ou a 800 nm (potência máxima: aproximadamente 2.600 mW) para ablação de GCaMP.
- Selecione o X 20 da lente objetiva movendo manualmente o revólver de lente. Clique na guia "Localizar", clique em "GFP" para alterar as vias ópticas e olhar diretamente a fluorescência pelo olho.
- Localize o cérebro de zebrafish larval no centro da vista; Clique na guia "Aquisição" de voltar para a microscopia de dois fotões.
- Como um registro da condição 'antes de ablação', pegue uma imagem de z-pilha com o 20 X da lente objetiva a digitalização-velocidade (para evitar dano de calor). Depois compare as imagens tomadas antes e depois de experiências de ablação(Figura 2). Para obter um z-pilha, clique em "Z-pilha" para selecionar a opção z-pilha e expandir o Tab. definir o limite inferior (clique em "Definir primeiramente" botão") após a focagem do lado ventral do cérebro larval e definir o limite superior (clique no botão"Set Last") após enfocando a a maioria-superfície dorsal do cérebro. Em seguida, clique no botão "Iniciar o experimento" para executar a aquisição de imagens de z-pilha.
- Selecione o X 63 da lente objetiva movendo manualmente o revólver de lente.
- Clique na guia "Localizar" para alternar para a microscopia epi-fluorescente, localize as células para ser retirado no centro de vista a olho nu e, em seguida, clique na guia "Aquisição" voltar para microscopia de varredura a laser.
- Na guia "Modo de aquisição", defina o "tamanho do quadro" a 256 x 256. Clique em "Live" e observar os neurônios de interesse.
- A partir do lado dorsal mais, encontre um plano focal na qual as células para ser retirado estão em foco.
- Marca uma pequena área circular tamanho de cerca de um terço da célula de diâmetro em cada neurônio como uma região de interesse (ROI) usando a função de "Regiões".
- Defina a velocidade de varredura para 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 µm x 134.42 µm), que corresponde a um tempo de interrupção do laser de aproximadamente 200 µs/pixel, ou 200 µs/0.5 µm. Também, definir 4 repetições (' ciclo de iteração: 4'). Alternativamente, otimize o número de iterações e velocidade de digitalização para que suficiente ablação é alcançada.
- Execute a função de 'Branqueamento' para ablação, em combinação com a 'série temporal (2 ciclos)' para a amostra (antes e depois da ablação) e «Regiões» (para definir o ROIs) ou funções equivalentes no software utilizado (Figura 1D) de imagem.
- Comparando-se a primeira imagem (antes da ablação) e a segunda imagem (após ablação) da série de tempo ciclo, certifique-se que após o clareamento, a fluorescência nas diminuições de células alvo às observadas no nível do plano de fundo (Figura 2B).
- Se a fluorescência está ainda presente após ablação, aumente o número de iterações.
- Em seguida, mova o plano focal ligeiramente mais profundo (isto é, para o lado ventral) e escolha o próximo plano focal onde aparecem células un-ablated.
- Execute a função de branqueamento como descrito acima (passo 1,9). Repita estes passos até que todas as células na estrutura neural de interesse tem sido retiradas.
- Depois de passar por todos os planos focais cobrindo as estruturas neurais para ser retirado, verificar as células para fluorescência abolida. Se algumas células encontram-se ainda ser fluorescentes devido à insuficiente ablação, laser-irradiá-los novamente como descrito acima.
- Se a larva precisa ser recuperado de agarose após a irradiação do laser, não tente forçá-lo fora o agarose, porque isso pode danificar a larva. Em vez disso, cuidadosamente fazer pequenos cortes no agarose em torno da larva perpendicularmente à superfície do seu corpo. Em seguida, aguarde a larva a nadar fora de agarose por conta própria, quando o efeito da anestesia.
- Prossiga para a próxima larva para ablação ou realizar experimentos de controle usando outra população de neurônios que são não envolvido no comportamento sob investigação.
Nota: Aqui, como um controle, os neurônios do bulbo olfatório em UAS:EGFP; larvas de gSAIzGFFM119B foram do laser-retirado usando o mesmo protocolo descrito acima (Figura 2A, direito). - Permita várias horas ou 1 dia para recuperação, antes de prosseguir para Ca imagem latente (secção 2) ou gravação comportamental (secção 3). Durante este tempo de recuperação, verificar a saúde larval (ou seja, natação espontânea normal, sem aparente dano de calor em torno da área retirada, etc.) e remover as larvas mostrar sinais de problemas de saúde.
2. cálcio Imaging para gravar atividade Neuronal presa-evocada em larvas Zebrafish Pretectum-retirado
- Para preparar uma câmara de gravação, colocar uma junta de câmara de hibridação secure-selo sobre uma lâmina de vidro, com o lado adesivo no vidro e remova o selo de top.
Nota: Isso cria uma câmara pequena gravação que é 9 mm de diâmetro e 0,8 mm de profundidade (Figura 3A). - Em seguida, coloque uma malha de nylon (tamanho da abertura: 32 µm) em um tubo de 50 mL que tem o fundo aberto. Use a tampa para anexar a malha no tubo (Figura 3B).
- Prepare os paramécios (que é a presa para ser usado como o estímulo visual para larva).
Nota: Preparar a cultura de Paramecium (etapas 2.3.1 e 2.3.2) previamente.- Obter cultura de protozoários semente de fontes comerciais ou de centros acadêmicos de bio-recursos24 antecipadamente.
- Cultura o paramécio por vários dias em água contendo palha de arroz esterilizada e uma pastilha de levedura de cerveja seca22 (Figura 3C).
- Despeje a paramécio cultura por 2 crivos sucessivamente (um com uma abertura de 150 µm, seguida por outra com uma abertura de 75 µm) para remover restos de cultura.
- Colete paramécios na passagem da etapa anterior em uma malha de nylon (abertura 13-µm).
- Ressuspender o paramécios sobre a malha de nylon para um copo de vidro usando uma garrafa de água do sistema (Figura 3-D).
- Enxágue a malha (Figura 3B) no sistema de água de 2 x (Figura 3E).
Nota: A finalidade desta etapa é remover qualquer possível odorantes e tastants contidos em meio de cultura de paramecium , como o objetivo do presente estudo é observar visualmente orientada a atividade neuronal. - Coloque uma larva de zebrafish na solução tricaina para anestesiar.
- Monte uma única larva em 2% baixo ponto de fusão do agarose.
- Em primeiro lugar, 2% baixo ponto de fusão do agarose no microondas e adicionar volume 1/10 de 10 x concentrada tricaina para o agarose.
- Coloque uma gota da agarose contendo tricaina câmara de gravação(Figura 3).
- Depois de confirmar a agarose não está muito quente, coloque a larva anestesiada (da etapa 2.5) em agarose, remover imediatamente qualquer excesso agarose para que a superfície da agarose parece ligeiramente convexa.
- Rapidamente, Oriente a larva em uma posição vertical com uma agulha de dissecação (Figura 1C).
Nota: Estes procedimentos devem ser concluídos dentro de alguns segundos antes da agarose solidifica. - Quando a larva está corretamente posicionada, permita 5 min para o agarose solidificar completamente. Em seguida, despeje uma gota de solução de x tricaine 1 no agarose.
- Remover o agarose em torno da cabeça da larva zebrafish e abrir espaço para o paramécio nadar usando uma faca cirúrgica. Para fazer isso, primeiro, fazer alguns cortes pequenos no agarose (Figura 3F). Em seguida, remova cuidadosamente o excesso agarose deitando suavemente sistema de água na câmara.
Nota: Neste passo, a tricaina será lavada para fora. - Em seguida, colocar um paramécio na câmara de gravação para servir como um estímulo visual.
Nota: Quando o paramécio nada perto da cabeça da larva zebrafish, ele evocará uma resposta neuronal (Figura 3G). - Lugar da câmara de gravação sob um microscópio de fluorescência-epi equipado com uma câmera CMOS científica (Figura 3-H) e selecione um 2.5 X da lente objetiva (Figura 3eu).
- Colete as gravações de lapso de tempo dos sinais de fluorescência de GCaMP.
- Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada.
- Clique em "Painel de sequência" e selecione "Gravar disco" no painel. Na seção Configurações de digitalização, defina a "contagem de Frame" para 900 ou qualquer outro número de quadro total desejado.
Nota: Se estiver disponível, use o software de gravação de lapso de tempo com um módulo (aqui, "disco rígido gravar") que permite a gravação eficiente dos dados para um disco rígido. - No painel de "Captura", defina o tempo de exposição em 30-ms (ou seja, 33,3 fps) e Binning 2 x 2.
- No microscópio controlando painel de toque, escolha um filtro definido para as boas práticas agrícolas, como o GCaMP tem semelhante espectros de excitação/emissão de GFP.
- Clique em "Live" no painel de captura para localizar a larva na visualização da câmera e foco (Figura 4A) e em seguida clique em "Parar de viver" e clique no botão "Iniciar". Salve o filme em .cxd ou qualquer outro formato que contém informações sobre a condição de aquisição.
- Após as gravações, analise os sinais fluorescentes GCaMP6s (sinais de Ca), obtendo valores de pixel média para o ROI definida em uma estrutura cerebral no filme lapso de tempo usando o software livre Fiji25.
Nota: Fiji é uma versão do ImageJ com muitos útil plug-in está pré-instalado e pode ler arquivos de imagem de formato .cxd com os Bio-formatos plug-in. - Se a larva move-se ligeiramente durante a gravação, realize registro de imagem executando o plug-in TurboReg26 em Fiji. No menu, selecione 'Plugins', 'Registo' e 'TurboReg'.
- Considere como analisar os dados de acordo com o objetivo do estudo. A seguir é um exemplo.
- Calcule o F/F0 (intensidade de fluorescência em cada momento, dividida pela intensidade da fluorescência em repouso, ou antes de qualquer transeunte Ca ocorreu) como segue:
- ROIs ateou o pretectum ou a ilha, usando o Gerenciador de ROI: no menu, selecione "Analisar," "Ferramentas", "Gerente de ROI" e "Add" à lista do ROIs(Figura 4).
- Calcular os valores de pixel média para o ROIs (IE., intensidades de fluorescência de GCaMP6s), selecionando o painel ROI Manager: "Mais" "Multi medida" e "Okey". Salve os resultados como um arquivo de planilha.
- Como os sinais são barulhentos, média os sinais para 11-pontos de tempo (média móvel) usando um aplicativo que pode lidar com dados de planilha.
- Dividir F (intensidades de fluorescência ao longo do tempo) por F0 (intensidade de fluorescência a nível basal) para calcular a intensidade de fluorescência normalizados. Como um exemplo de visualização de dados, alterações na intensidade de fluorescência GCaMP6s normalizada no pretectum e a ilha são codificados por cores e mapeados em trajetórias o paramécio (Figura 4B - D).
3. avaliação de consequências comportamentais após ablação a Laser
- Criar um sistema de gravação comportamental que consiste de um estereoscópio equipado com uma câmera de vídeo. Use uma câmera com um imagem adequada aquisição software, comercial ou sob medido (Figura 5A).
- Otimize a condição de iluminação para que o paramécio pode ser detectado por processamento de imagem. Por exemplo, use um anel branco diodo emissor de luz com um espaçador (Figura 5B).
Nota: A distância e o ângulo, o LED afeta a aparência da amostra (isto é, brilhante no fundo escuro ou escuro no fundo brilhante) e são, portanto, fundamental para o processamento de imagem de sucesso. Determine a melhor altura do espaçador (Figura 5-C). - Coloque uma larva de peixe-zebra (recuperada do experimento de ablação a laser descrito na secção 1) em uma câmara de gravação comportamental (que foi anexada a um slide de vidro) com o selo top original removido (Figura 5-D).
- Coletar 50 paramécios da cultura (etapa 2.3.5) utilizando uma micropipeta e colocá-los na câmara de gravação.
- Coloque uma lamela em cima da câmara de gravação. Colocar uma pequena gota de água sobre o deslizamento da tampa antes de colocar sobre a superfície da água da câmara para evitar a introdução de ar na câmara de gravação.
Nota: Nesta etapa, um pouco de água com paramécios transbordará da câmara de gravação. O número de protozoários na câmara de gravação será aproximadamente 30-40. - Coloque a câmara de gravação (que contém uma larva e protozoários) no sistema de iluminação (Figura 5-D).
- Inicie a gravação de lapso de tempo em 10 fps para 11 min (6.600 frames).
- (Opcional) Para cada larva que foi testado por comportamento, observar a fluorescência das áreas do laser-retirado por microscopia fluorescente para confirmar a eficácia da-ablação a laser (ou seja, ausência ou significativamente reduzidas fluorescentes, números de células em a área do laser irradiados).
Nota: Mesmo após a irradiação, algumas células fluorescentes ainda podem ser observadas devido à posterior início Gal4 da expressão do gene em células diferenciadas após ablação27. - Depois de gravar o comportamento da larva, para compensar a falta de uniformidade em segundo plano, realizar uma divisão de pixel por pixel de cada quadro por uma imagem média em Fiji: clique em 'Processo', 'Calculadora de imagem', ' operação: dividir ', 32-bit resultado (float)', e ' Okey '. Para tornar uma imagem média, clique em 'Imagem', 'Pilhas', 'Z-projeto', 'Intensidade média' e 'Okey' (Figura 5E, F).
- Contagem do número de protozoários deixou na câmara clicando 'Analisar', 'Analisar partículas', definir um intervalo de área que cobre todos os paramécios, verificando a caixa de seleção 'Mostrar: máscaras' e clicando em 'Okey'. A opção 'Show: máscaras' irá fornecer uma imagem extraída paramécios (Figura 5G), com uma lista do número de partículas (paramécios) em cada quadro.
- Plotar o número de protozoários esquerda na câmara de gravação ao longo do tempo. Porque as estimativas do número de protozoários são barulhentas, recomendamos executar uma média móvel em cada ponto em um intervalo de 600 frames (1 min) na planilha.
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Representative Results
Os neurônios específicos foram geneticamente rotulados com EGFP ou GCaMP6s, cuja expressão foram expulsos em linhas Gal4. Um gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 foi usado para rotular um núcleo na área pretectal (núcleo pretectal superficial de magnocelular) e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Outra linha de Gal4, hspGFFDMC76A, era usada para rotular a ilha. Nós do laser-retirado os neurônios pretectal bilateralmente (Figura 2 painel esquerdo) e também retirado os neurônios no bulbo olfatório bilateralmente como um controle (Figura 2 painel direito), em larvas de peixe-zebra de um gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 que foram acasaladas com peixe de repórter de UAS:EGFP. Os resultados mostram que o laser de dois fotões pode ablate células alvo, deixando células adjacentes ou neuritos afetados (Figura 2B).
Os neurônios pretectal projetam seus axônios em direção a ilha ipsilaterally. Aqui, nós investigamos sua conectividade funcional utilizando imagens de Ca. Atividade neuronal nesta região pode ser observada como sinais de Ca com uma sonda de Ca GCaMP6s(Figura 4),cuja expressão foi guiado por um Gal4 linha gSAIzGFFM119B (Figura 4B) ou outro Gal4 linha hspGFFDMC76A (Figura 4 C). as setas coloridas (Figura 4) mostram direções de natação e trajetórias do paramécio, bem como sinal de Ca Color-coded-alterações na área do cérebro especificado, que foram evocados pela visão da natação paramécio (Figura 4B-D). Tanto o pretectum (Figura 4B) e a atividade neuronal ilha (Figura 4C) mostrou a presença proximal de rapina, sugerindo que as duas atividades neuronais são conduzidas visualmente.
Usando as larvas de Gal4 GCaMP6s duplas (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), nós retirado o Ca pretectal neurônios unilateralmente e mais executados de imagem para observar a atividade neuronal no pretectum e a ilha em larvas ablated. O pretectum esquerdo que foi retirado de laser mostrou residual para nenhuma atividade neuronal (Figura 4D, canto superior esquerdo), sugerindo que a ablação a laser-foi bem sucedida. No entanto, a ilha ipsilateral mostrou atividade neuronal drasticamente reduzida (Figura 4D inferior esquerdo), sugerindo que a entrada principal para a ilha vem a pretectum ipsilateral. Em contraste, a ilha do outro lado da laser-ablated pretectum (Figura 4D inferior direito) mostrou atividade neuronal comparável à atividade neuronal no pretectum ipsilateral (Figura 4D, canto superior direito), que sugere-se que a ilha está recebendo insumos do pretectum certo.
A escolha de qual ensaio comportamental para usar em um experimento depende da função (ões) possível dos neurônios sob investigação. Aqui, mostramos um exemplo de um ensaio de captura de presas após ablação de um núcleo pretectal que foi identificado como um detector de rapina21. Usando o sistema de iluminação, mostrado na Figura 5A-D, o número de paramécio em câmara de gravação pode ser contado por (Figura 5E-G) de processamento de imagem. Automatizado de extração de olhos, e o cálculo das posições do olho (ou seja, alterações nos ângulos dos olhos) também pode ser possível, porque os olhos da larva zebrafish aparecem mais escuros do que o plano de fundo nesta condição de iluminação (Figura 5H ).
Resultados do experimento mostram que bilateral-ablação da atividade pretectum abolido captura de presas (Fig. 5I, PT) enquanto não ablação de uma subpopulação de neurônios no bulbo olfatório (Figura 5eu, OB). Estes resultados, juntamente com as experiências mostradas na Figura 4, sugerem que o circuito pretecto-hipotalâmico é essencial no comportamento de captura de presas.
Figura 1 . Larvas de zebrafish. (A) cinco - velho dia (5 dias após fecundação (5-dpf)) zebrafish larva e sua presa, um paramécio. (B) 4-dpf nácar larva incorporado em 2% baixo ponto de fusão do agarose. Note que a tensão de nácar não possui pigmentos pretos no corpo enquanto o epithelium retinal do pigment está intacta. Barra de escala: 0,5 mm. (C) Dissecting agulha usada para orientar o zebrafish larvas em agarose. Barra de escala: 1 cm. (D) Screenshot do software usado em microscopia a dois fotões, mostrando os painéis de "Branqueamento", "Séries temporais" e "Regiões" que foram usados em ablação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões laser. (A) imagens fluorescentes de EGFP de 4-dpf zebrafish larvas antes e depois da ablação de neurônios. Vista superior e vista lateral de imagens 3D reconstruída z-pilha usando software de processamento de imagem. As imagens de z-pilha foram tiradas com uma lente de objetiva X 20. As áreas ablated (pretectum ou no bulbo olfatório) são circuladas em amarelo. Barra de escala: 100 µm. (B) exemplo de ablação a laser em um único plano focal usando a função de "Branqueamento". Áreas de laser irradiados (definido como ROIs) são mostradas em cores em cada célula. Barra de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Preparação de zebrafish larvas e protozoários para a imagem latente de Ca. Câmara de gravação (A). Um comercialmente disponíveis 9 mm de diâmetro x gaxeta de hibridação de 0,8 mm de profundidade com 8 câmaras foi utilizada como câmara de gravação. A junta foi colocada em uma lâmina de vidro e aderiu. O selo na parte superior da junta foi arrancado. (B) a malha de nylon (32 µm) usada para enxaguar os paramécios. A malha foi colocada em um tubo de 50 mL. (C) Paramecium cultura contendo palha de arroz e secar o fermento Pelotas. (D) Paramecium estoque solução preparada a partir da cultura mostrada na solução estoque de C. (E) Paramecium foi lavado com água do sistema duas vezes para remover possíveis sinais olfativos e gustativos no meio. (F) Paramecium incorporado na câmara de gravação. Para remover uma porção de agarose, vários cortes foram feitos. (G) gravação de câmara com uma larva de peixe-zebra e um paramécio. A maioria da agarose foi removida para permitir que o paramécio , a nadar. A cabeça da larva zebrafish é exposta. (H) microscópio fluorescente vertical usado em imagiologia de Ca. O microscópio é equipado com uma câmera CMOS científica. (eu) Zebrafish larva na câmara sob o microscópio com a excitação a luz na gravação. Com uma lente de objetiva X 2,5, a área iluminada é ligeiramente maior que o tamanho da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Ca de representante de imagem dados. (A) posição da pretectum e o lóbulo inferior do hipotálamo (ilha), circulado em amarelo, em uma dupla hspGFFDMC76A Gal4; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebrafish larva. (B) alterações no pretectum Ca sinal (em média bilateralmente), cor-mapeado sobre as trajetórias de um paramécio em um gSAIzGFFM119B; Larva de UAShspzGCaMP6s. Barra de escala: 1 mm. (C) alterações no sinal ilha Ca (média de bilateralmente), cor-mapeado sobre as trajetórias de um paramécio em um hspGFFDMC76A; Larva de UAShspzGCaMP6s. Barra de escala: 1 mm. (D) alterações no pretectum e os sinais de ilha Ca cor-mapeado sobre as trajetórias de um paramécio em um hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; Larva de UAShspzGCaMP6s que foi submetida a dois fotões-ablação a laser de pretectum a esquerda. Barra de escala: 1 mm. Esta imagem foi reproduzida a partir do mesmo dados anteriormente publicado21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Presa a captura de dados do ensaio e representante em larvas do laser-retirado do zebrafish. Sistema de gravação comportamental (A). O microscópio foi equipado com uma câmera CMOS. Imagens foram adquiridas utilizando um script feito sob medido. (B) componentes do sistema de iluminação. Um papel de cor cinza, um difusor de vidro, anel branco LED luz, difusor, um espaçador sob medida (papelão) e difusor com um buraco no centro. (C) o sistema de iluminação montados das peças mostradas na câmara B. (D) de gravação para o ensaio de captura de presas. Uma câmara (diâmetro: 20 mm; profundidade: 2,5 mm) foi colocado em uma lâmina de vidro. O selo top original da câmara foi arrancado. Uma tampa de vidro foi colocada na câmara de gravação. (E) imagem crua de um quadro do filme gravado. (F) uma moldura dividida (pixel por pixel) por uma imagem média em um filme. Note que o fundo não-uniforme na iluminação pode ser compensado por este processamento de imagem. (G) Paramecia extraído um quadro usando a função de "Análise de partícula" nas Ilhas Fiji. (H) exemplo de imagem em Fiji com um limiar aplicada. Paramecia aparecem brilhantes, Considerando que os olhos da larva zebrafish aparecem escuros, e o fundo é cinza. Mudanças nas posições do olho (ou seja, ângulos em relação ao eixo do corpo) podem ser calculadas, se necessário. (eu) dados experimentais representativos de consumo paramécio em uma larva controle bulbo olfativo-retirado (OB) e uma larva pretectum-retirado (PT). Ablação pretectum significativamente reduzida habilidade de caça de presas enquanto bulbo olfactory ablação não afetá-lo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora os dois fotões do laser tem uma excelente resolução espacial para ablate especificamente neurônios individuais, cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis no tecido do cérebro devido ao calor. O passo mais importante no experimento de ablação é determinar a quantidade ideal de irradiação do laser. Irradiação de insuficiente não consegue matar os neurônios. Muita irradiação será calor-danos no tecido circundante, o que irá resultar em efeitos indesejáveis. A gama óptima de irradiação do laser (áreas do ROIs, o número de iterações e velocidade de digitalização) parece ser estreito. Alguns fatores afetam a eficiência da ablação.
Primeiro, usando proteínas diferentes repórter fluorescentes, as condições de ablação precisam ser otimizado para cada repórter. Expressão GCaMP é observada no citoplasma desprovido de núcleos. Em contraste, a fluorescência EGFP aparece em todo o interior da célula, que pode ser vantajoso para ablação eficiente e específica das células alvo, em comparação com GCaMP. O uso de GCaMP também é desvantajoso, como uma célula de GCaMP-expressando-retirado do laser pode apresentar aumento da fluorescência de intensidade devido à imediata afluxo maciço de Ca, em contraste com a intensidade de fluorescência diminuiu quando EGFP foi utilizado para ablação. Assim, a mudança na fluorescência não pode ser um indicador confiável da extensão da ablação com GCaMP. Em tais casos, pode ser necessário validar a ablação, observando a perda de células fluorescentes após um período específico. Ausência ou redução significativa dos sinais na área ablated Ca pode ser outro critério para ablação sucesso com GCaMP.
Em segundo lugar, a quantidade (ou seja, velocidade de digitalização, número de iteração de varreduras) de irradiação do laser necessária para ablação bem sucedida pode variar dependendo da profundidade da localização dos neurônios da superfície do cérebro. Aqueles situados profundamente dentro do cérebro em comparação com células localizadas perto da superfície, exigem mais irradiação do laser, assim, tornando mais difícil para retirá-los. Otimização para a quantidade de irradiação do laser deve ser determinada especificamente para cada subpopulação alvo de neurônios.
Em terceiro lugar, foi observado empiricamente que definindo um número de ROIs em uma área pequena em uma varredura frequentemente calor-danificado o tecido ao redor das células também (julgado pelo aparecimento de bolhas na área do laser irradiados), Considerando que visando uma célula sozinha, ou escassamente ROIs distribuídos em uma varredura sob a mesma condição não tiveram efeitos prejudiciais. No presente estudo, branqueamento foi aplicado apenas em uma pequena região (cerca de um terço do tamanho do corpo celular) para evitar danos aos tecidos fora das células alvo. Normalmente, as células de 5-10 foram orientadas para cada plano focal (4-8 aviões para cobrir toda a área pretectal).
Além de otimizar a quantidade de irradiação do laser, extensa validação de ablação a laser, realizando experimentos de controle é crítica. Um experimento de controle pode incluir a remoção a laser de outra subpopulação de células que são susceptíveis de ser envolvido no comportamento a ser estudado. Os neurônios do bulbo olfatório rotulados na mesma linha Gal4 serviram como controle no presente estudo (Figura 2A, certo e Figura 5eu). No entanto, pelo motivo descrito acima, não há grupos de neurônios podem servir como um controle ideal. Cada subpopulação de neurônios difere dos outros em relação a sua posição no cérebro, densidade celular, nível de expressão do transgene repórter fluorescente, a taxa de proliferação e o timing da expressão do transgene repórter. Estas diferenças tornam impossível usar a mesma configuração exata para ablação (a função de 'Branqueamento') em experimentos de controle. Assim, diferentes tipos de experimentos de controle devem ser também considerados, como medições da resposta optocinético, comportamento visual28e atividade basal em locomoção21 para assegurar o efeito específico da ablação.
Em nossa experiência, ablação de dezenas de células pretectal bilateralmente, leva cerca de 1 h (a partir de incorporação em agarose, usando um microscópio de dois fotões, para recuperar do agarose após ablação de ablação). Até 8 larvas por dia (por exemplo, 4 larvas para experimental e 4 para controle) pode ser retirado; Portanto, um par de conjuntos de experiências pode ser necessária para assegurar que haja suficiente larvas para um grupo experimental (por exemplo, n = 12) e para um grupo de controle (por exemplo, n = 12). Além disso, é desejável permitir metade um dia ou um dia para as larvas se recuperar de ablação (por exemplo, ablação a laser em 4-dpf, seguido por uma gravação comportamental no 5-dpf, ou ablação da manhã seguido de imagiologia de Ca à tarde). Durante este tempo de recuperação, qualquer mal procurando larvas devem ser excluídas do estudo.
O protocolo usado para analisar os dados obtidos depende completamente do objetivo do estudo. O presente estudo enfoca as relações entre o local do paramécio no campo visual e atividade neuronal no pretectum e a ilha. Considerando a decadência lenta (~ segundos) do GCaMP6s sinais29, apenas o tempo de aumento, mas não a diminuição, do GCaMP6s sinais correlaciona-se com a localização do paramécio. Os sinais de Ca podem ser altos, mesmo quando o paramécio se afastar. Portanto, incluímos apenas aumento da fluorescência de intensidade de GCaMP6s da apresentação de dados. Este tipo de análise exige muitas vezes feito por scripts escritos com linguagens de programação específicas ou linguagens de macro. Os scripts usados neste artigo estão disponíveis mediante pedido.
A condição contida (ou seja, incorporado no agarose) pode ser estressante para as larvas de peixe-zebra em certa medida; no entanto, nós não observaram aparente atividade neuronal induzida por estresse ou comportamento nesta condição, quando comparado com a condição de livres21,22. Larvas de zebrafish agarose-incorporado podem sobreviver pelo menos 24 h, (provavelmente mais) sem nenhum problema aparente. Paramecium-Ca conduzida sinaliza no pretectum e a ilha na condição restrita foram semelhantes às observadas em larvas livres21. Zebrafish visual comportamento pode ser controlado pelo ritmo circadiano. Portanto, realizamos experimentos comportamentais de início de tarde da noite. Tipo selvagem e larvas controle consumiram um número significativo de paramécios durante este tempo de gravação.
Os ensaios funcionais e comportamentais descritos aqui utilizam o equipamento mais comumente disponível que pode ser encontrados em muitos laboratórios ou pode ser facilmente configurado, e assim deve ter grandes aplicações em diferentes campos da ciência comportamental.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.
Acknowledgments
Estes estudos foram financiados por subvenções recebidas do MEXT, JSPS KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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