Summary
Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.
Abstract
Fagocitosi gioca un ruolo chiave nella difesa dell'ospite, così come nella manutenzione e nello sviluppo del tessuto e coinvolge rapidi, mediata dal recettore riarrangiamenti del citoscheletro per catturare, avvolgono e fagocitare particelle di grandi dimensioni. Sebbene siano stati identificati recettori fagocitici, vie di segnalazione a valle ed effettori, come Rho GTPasi, il rimodellamento del citoscheletro dinamico di specifici eventi fagocitici ricevitore-mediata rimangono poco chiari. Quarant'anni fa, due distinti meccanismi di fagocitosi, esemplificato dal fcy ricevitore (FcγR) - e complemento recettore (CR) - mediato di fagocitosi, sono stati identificati usando la microscopia elettronica a scansione. Associazione dell'immunoglobulina G (IgG)-opsonized particelle a FcγRs innesca la protrusione delle estensioni di membrana sottile, che inizialmente formano una cosiddetta Coppa fagocitica intorno la particella prima che diventa completamente racchiusa e ritirato all'interno della cella. Al contrario, particelle di complemento opsonized sembrano affondare in fagocita seguito associazione a complemento dei recettori. Queste due modalità di fagocitosi, formazione di Coppa fagocitica e affondamento nel, sono diventati affermati nella letteratura. Tuttavia, le distinzioni tra le due modalità sono diventato offuscate dai rapporti che fagocitosi mediata dal recettore complemento possono indurre varie protrusioni di membrana. Con la disponibilità di tecniche di imaging ad alta risoluzione, sono necessari test di fagocitosi che consentono la visualizzazione 3D (tre dimensioni) in tempo reale di come specifici recettori fagocitici mediare l'assorbimento di particelle individuali. Più comunemente utilizzati approcci per lo studio della fagocitosi, come end-point saggi, perdere l'opportunità di capire cosa sta succedendo all'interfaccia delle particelle e fagociti. Qui descriviamo fagocitiche saggi, usando la microscopia confocal disco Time-lapse filatura, che consentono di immagini 3D di singoli eventi fagocitici. In più, descriviamo le analisi a inequivocabilmente immagine fcy recettore - o a completare la fagocitosi mediata dal recettore.
Introduction
Vent'anni prima osservazione di Metchnikoff delle cellule fagocitiche mesenchima nelle larve di stelle marine, nel 1882 e lo sviluppo successivo della sua teoria della fagocitosi1, Ernest Haeckel descritto, nel 1862, il engulfment delle particelle insolubili tintura di sangue cellule di fimbris Thetis (Tethys fimbria), una specie di predatori sea slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Ha descritto in modo esplicito protrusioni di membrana che avvolge le particelle, che sono stati successivamente ripreso nel citoplasma e accumulate intorno al nucleo delle cellule. Più di 100 anni più successivamente, uno studio pionieristico di Kaplan ha suggerito che c'erano morfologicamente distinte almeno due meccanismi di fagocitosi,2. Kaplan ha mostrato mediante microscopia elettronica a scansione che il mouse peritoneale macrofagi ingerito un IgG-opsonized pecora rossa del globulo utilizzando estensioni di membrana sottile che ha raggiunto e strettamente avvolto la particella, inizialmente dando luogo a un tazza-come struttura. Coppa fagocitica formazione necessaria polimerizzazione dell'actina, poiché è stata abolita dalla cellula-permeabile tossina fungina citocalasina B, nota per bloccare l'actina dinamiche3. Al contrario, globuli rossi delle pecore opsonized con complemento sembrava sprofondare direttamente il macrofago senza la generazione di estensioni della membrana, anche se, in alcune immagini, Increspature di membrana possono essere visto in prossimità immediata delle particelle d'abbassamento. A differenza di formazione tazza fagocitica, complemento recettore-mediata affondamento era insensibile al trattamento di citocalasina B2. Negli esperimenti descritti da Kaplan, complemento opsonizzazione è stata eseguita incubando immunoglobulina M (IgM) con etichetta pecore globuli rossi con il siero da topi complemento C5-carenti, che aggira il hemolysis dal terminale complemento C5-dipendente completano il complesso.
Le due modalità di fagocitosi, formazione di Coppa fagocitica e affondamento in, identificate da Kaplan sono diventati opinione consolidata nel campo4,5,6,7,8,9 . Tuttavia, le immagini ad altissima risoluzione utilizzata nello studio originale di Kaplan2, come pure uno studio simile di Munthe-Kaas et al. 10, forniscono solo istantanee di eventi fagocitici. In una recente revisione, Rougerie et al. 11 ha sottolineato che differenze morfologiche tra la fagocitosi mediata da FcγR e CR restano ancora da chiarire, e, inoltre, Increspature di membrana sono stati osservati durante complemento recettore-mediata delle particelle assorbimento2. Formazione immagine di cellule vive di singoli eventi fagocitici che vanno dalla cattura delle particelle alla interiorizzazione, combinato con geneticamente modificato modelli murini, potrebbe notevolmente migliorare la nostra comprensione di come i fagociti catturano e ingeriscono particelle. Un approccio potrebbe essere utilizzare microscopia a forza atomica veloce (AFM) che permette la formazione immagine topografica (10 – 20 nm) ad altissima risoluzione delle cellule viventi. Recentemente, è stato sviluppato un veloce sistema AFM12 , che è adatto per superfici di cellule imaging rapidamente con basso rumore. Questa tecnica ha il vantaggio che parametri ad alta risoluzione, topografico e meccanica di vivere cellule possono essere misurate a brevi intervalli (secondi), a differenza di microscopia elettronica, che rende necessaria la fissazione e il punto critico di essiccazione di cellule. Un altro approccio è time-lapse microscopia confocale 3D, che è ampiamente disponibile, anche se fototossicità e candeggio sono fattori limitanti durante le registrazioni. Questo approccio è estremamente versatile e permette di sezionamento con elevata risoluzione spaziale ottico e consente straordinaria flessibilità nell'etichettatura con una serie impressionante di sonde fluorescenti, tra cui proteine fluorescenti geneticamente codificate. Qui descriviamo saggi di fagocitosi usando la microscopia confocal di disco di time-lapse filatura che consentono ad alta risoluzione spazio-temporale di specifici eventi fagocitici ricevitore-mediata.
Protocol
I protocolli di seguono le linee guida del nostro comitato etico locale ricerca umana, così come le linee guida di cura degli animali.
1. isolamento dei macrofagi peritoneali del topo residente
- Sacrificare il mouse (3 – 4 mesi di età (entrambi i sessi); ad es. Ceppo C57BL/6) utilizzando un sovradosaggio dell'isoflurano anestetico volatile (> 5% in aria) o biossido di carbonio13, seguita da dislocazione cervicale. Induzione dell'anestesia può essere facilmente valutata da perdita di raddrizzamento riflesso14, nonché dalla perdita del riflesso di ritiro della zampa.
- Dopo la pulizia il ventre del mouse con 80% di etanolo in acqua, praticare un'incisione della pelle del midline ed esporre la parete addominale sottostante.
- Posizionare un catetere di plastica 24-G nella peritonium e lavaggio della cavità con soluzione salina 2 x 4,5 mL di Hank ghiacciata attenuata (HBSS), senza Ca2 + e Mg2 +tramite una siringa di plastica da 5 mL. Durante l'iniezione, lasciare residuo circa 0,5 mL HBSS (5 – 4,5 mL (iniettato) = 0,5 mL) nella siringa nel caso dei tessuti viene aspirato nella punta del catetere e ha bisogno di essere espulsi. Trasferire la sospensione aspirata in un tubo di turno-fondo in polipropilene 14 mL e centrifugare a 300 x g per 6,5 min a temperatura ambiente.
Nota: La punta del catetere in plastica è smussato, che, rispetto ad un ago, minimizza infortunio al contenuto addominale. In genere, segue delicato massaggio addominale, 8 mL di sospensione cellulare peritoneale può essere estratto dalla cavità peritoneale. - Eliminare il supernatante e risospendere le cellule peritoneali in medium di RPMI 1640 senza bicarbonato di 1 mL contenente 20 mM Hepes, 10% inattivati siero fetale bovino e antibiotici, quali penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (100 µ g/mL), preparato da Diluire 100 x penicillina/streptomicina 1: 100. Questo in genere dà una concentrazione di circa 6 x 106 cellule/mL.
Nota: Circa il 30% delle cellule peritoneali isolati sono macrofagi, mentre le altre cellule (più piccole) sono linfociti, principalmente linfociti B.
2. semina delle cellule peritoneali nel canale scorre
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Dopo la sospensione cellulare su e giù per ridurre l'agglutinamento di pipettaggio, pipettare 100 sospensione µ l nel canale preriempito (volume, 100 µ l) di una diapositiva di canale rivestite di fibronectina (un canale di 100 µ l ha le dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza): 50 x 5 mm 0,4 mm).
- Prefill della camera aggiungendo medium RPMI 1640 (Hepes) siero-completato di 1 mL per uno dei due bacini della diapositiva canale, inclinando il vetrino e poi aspirando il mezzo dal serbatoio a valle (Figura 1).
- Le bolle d'aria rimuovere indesiderati, o lunghe strisce di aria, nel canale di aggiunta di 1 – 2 mL di terreno a uno dei due bacini, strettamente applicando un tappo del serbatoio e poi pompare fuori l'aria attraverso una pressione ritmica pollice sul tappo e, ove necessario, inclinando la diapositiva. Dopo l'espulsione di aria, inclinare il vetrino con il serbatoio scoperchiato (e che contiene il Media) verso il basso prima di togliere il tappo per evitare che l'aria risucchiata nuovamente dentro il canale.
- Prefill della camera aggiungendo medium RPMI 1640 (Hepes) siero-completato di 1 mL per uno dei due bacini della diapositiva canale, inclinando il vetrino e poi aspirando il mezzo dal serbatoio a valle (Figura 1).
- Incubare il vetrino di canale, seminato con cellule, in una camera umida per 2 h a 37 ° C in assenza di CO2 (CO2 non è necessaria poiché l' HCO3-sistema tampone di co2 è sostituito dal Hepes). Le diapositive di canale possono essere convenientemente collocate su una rastrelliera, che contiene otto vetrini. In genere, 6 – 8 vetrini sono preparati da un mouse, anche se fino a 10 o più è possibile.
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Rimuovere il rack e scambiare il medium RPMI 1640 (Hepes) in ogni diapositiva per media bicarbonato contenente RPMI 1640, completato con 10% siero bovino fetale, come pure la penicillina/streptomicina.
- Inclinare la diapositiva e aspirate medie in primo luogo dal serbatoio inferiore e quindi dal serbatoio superiore. Successivamente, aggiungere 1 mL di terreno nuovo per uno dei bacini, inclinare il mezzo scivolo e aspirato dal serbatoio a valle, dopo esso ha attraversato il canale.
- Dopo questo passaggio di lavaggio (cambio di media), riempire la diapositiva di canale aggiungendo 1 mL di terreno a uno dei serbatoi.
Nota: Passaggi utilizzando diapositive canale di lavaggio è molto semplice ed efficace in termini di soluzione cambio e rimuovere le cellule non-aderenti. Si noti che il medium RPMI 1640 (bicarbonato) è normalmente pre-incubato con 5% CO2 durante la notte per assicurare un equilibrio termico e pH.
- Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2. Esperimenti sul giorno seguente.
3. isolamento di globuli rossi umani
- Il giorno 2 (secondo giorno di esperimenti; dopo incubazione overnight dei macrofagi peritoneali isolati), raccogliere il sangue venoso periferico di 1 – 2 mL da un donatore sano, in una provetta eparinata. Trasferire 1 mL in una provetta da microcentrifuga di fondo tondo 2,0 mL (polipropilene), centrifugare a 300 x g per 5 min a 18 ° C (impostazione empirica) e rimuovere il surnatante (plasma e buffy-coat).
- Delicatamente aspirare 100 µ l di globuli rossi sedimentati e mescolare questo volume 1:1 con modificate medium RPMI 1640 (Hepes) (descritto di seguito) in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL di fondo tondo. Etichettare la provetta "1:1".
Nota: Il medium RPMI 1640 (Hepes) utilizzato il giorno 2 (per saggi) dopo aver isolato cellule contiene, oltre al siero bovino fetale inattivati 10%, penicillina (100 unità/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e 1 mM (2-mercaptopropionyl) glicina di N (per ridurre fototossicità). Qui di seguito, questo mezzo si riferisce come "modificate" medium RPMI 1640 (Hepes). - Dispensare 4 µ l della sospensione diluita 1:1 del globulo rosso in 2 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes), pre-pipettati in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL (ripetere questo passaggio, cioè preparare 2 tubi). Etichettare ogni provetta "4: 2000". Posizionare i tubi "1:1" e "4: 2000" su ghiaccio.
4. etichettatura della membrana plasmatica del macrofago
- Rimuovere le diapositive di canale seminato dall'incubatrice di CO2 e scambiare il medium RPMI 1640 (bicarbonato) in ogni diapositiva per medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Successivamente, inserire le celle in una camera umida a 37 ° C in assenza di CO2.
Nota: Dopo incubazione durante la notte e il lavaggio, la maggior parte dei linfociti vengono rimossi dal canale. La maggior parte delle cellule aderenti restanti sono i macrofagi, che possono essere identificati morfologicamente o di immunofluorescenza usando l'anticorpo anti-F4/80. Circa il 95% dei residenti macrofagi peritoneali del topo sono F4/80 positivo. - Diluire con etichetta fluorescente verde anti-topo F4/80 anticorpo (conservato a 4 ° C) 01:40 in medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Prendere una diapositiva, inclinarlo e dispensare (goccia a goccia) 100 µ l della miscela dell'anticorpo nell'apertura del canale 100 µ l della diapositiva (Vedi Figura 1). Mezzo di aspirato che fluisce nel serbatoio a valle. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C (ambiente umidificato, senza CO2). Durante il periodo di incubazione, etichettare i globuli rossi umani (Vedi sezione 5).
Nota: Come accennato sopra, CO2 non è necessaria poiché l' HCO3-sistema tampone di co2 è sostituito dal Hepes. - Dopo 20 min tempo di incubazione (durante il quale globuli rossi umani sono macchiati e opsonized), lavare la diapositiva aggiungendo 1 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes) ad uno dei serbatoi e aspirando il mezzo dopo esso ha attraversato il canale, nei paraggi inclinando il vetrino. Aggiungere 1 mL di terreno per lo stoccaggio a breve termine o procedere ad un esperimento (cioè, il pipettaggio in particelle (opsonized globuli rossi) e fagocitosi di imaging mediante microscopia confocale a disco Time-lapse filatura).
5. la membrana plasmatica dei globuli rossi umani di etichettatura
- Iniziare l'etichettatura dei globuli rossi umani immediatamente dopo incubazione di una diapositiva di macrofagi con verde fluorescente contrassegnati dell'anticorpo anti-F4/80 (dopo sezione 4.2). Dopo miscelazione delicata, prendere 400 µ l da uno dei tubi "4: 2000" (Vedi sezione 3.3) e dispensarlo in una provetta da microcentrifuga 2,0 mL (fondo tondo). Lasciare il tempo per la sospensione a caldo intorno ai 37 ° c (Vedi paragrafo seguente). Aggiungete la macchia rosso-arancio fluorescente della membrana plasmatica di 0,4 µ l (aliquote conservate a-20 ° C) e incubare a 37 ° C per 5 min.
Nota: Un blocco di alluminio riscaldata, collocato all'interno della cappa a flusso laminare, è utile per minimizzare la perdita di calore durante la preparazione di diapositive. Tubi possono essere posizionati in pozzetti di foro di blocco riscaldante e un separato, o piastra in alluminio integrata, riscaldata può servire come uno spazio di lavoro. - Dopo il periodo di incubazione di 5 min, preparare la prima fase di lavaggio aggiungendo 1600 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio (per riempire il tubo del microcentrifuge 2,0 mL).
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a 18 ° C (impostazione empirica). Un compatto pellet rosso dovrebbe essere visibile sul muro (cioè, fuori centro) nella parte inferiore del tubo. Ruotare il tubo in modo che il pellet sia rivolto verso l'alto e togliete con cautela tutte del surnatante, successivamente (a due passi), utilizzando un puntale di 1 – 1,5 mL.
- Dopo avere aspirato il surnatante, aggiungere 2.000 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio, mix (per risospendere le cellule) e ripetere i passaggi precedenti di aspirazione di centrifugazione e surnatante.
- Risospendere il pellet (della membrana plasmatica macchiato e 2x lavato globuli rossi) con 400 µ l di medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Etichettare la provetta PMS (abbreviazione per la macchia di membrana plasmatica).
Nota: In alternativa, il succinimidyl ester di un derivato di pH sensibili rodamina, che diventa più fortemente fluorescente a pH acido, potrebbero essere utilizzati per etichettare i globuli rossi umani. In questo caso, l'intensità di fluorescenza inoltre serve come una misura di maturazione del fagosoma dopo particelle hanno state interiorizzate.
6. opsonizzazione (etichettatura) dei globuli rossi umani con Mouse l'immunoglobulina G (IgG)
- Aggiungere 1 µ l del mouse (IgG2b) monoclonale (clone HIR2) anti-umani CD235a anticorpo (1 mg/mL) (conservato a-20 ° C) nella provetta etichettata PMS (Vedi sezioni 5.2 – 5.5), contenente la membrana plasmatica macchiato globuli rossi umani sospesi nel mezzo di 400 µ l. CD235a (noto anche come glycophorin A) è un sialoglycoprotein lineage-specifici di membrana degli eritrociti.
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Incubare a 37 ° C per 8 min. nota che Opsonizzazione dei globuli rossi umani con IgG cause agglutinazione (cella ragruppare). Sebbene agglutinazione può servire come un indicatore visivo di opsonizzazione, non è auspicabile per l'imaging di singoli effetti fagocitici. A eludere agglutinazione, ripetutamente mescolare la sospensione cellulare (ogni 1 min) utilizzando, ad esempio, una variabile pipetta 20-200 µ l volume impostato a 200 µ l.
- Verso la fine del periodo d'incubazione di 8 min, se desiderato, lavare il vetrino del macrofago, incubato con verde fluorescente etichettato dell'anticorpo anti-F4/80, con 1 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes). Garantire che entrambi serbatoi della diapositiva canale siano privi di media dopo le operazioni di lavaggio.
7. la fagocitosi della membrana plasmatica di imaging macchiato e IgG rivestite globuli rossi umani
- Dopo l'incubazione di 8 min con l'anticorpo anti-CD235a (sezione 6.2), pipettare 100 sospensione µ l contenente la membrana plasmatica-macchiato e IgG-opsonized globuli rossi umani nel canale di una diapositiva che contiene i macrofagi etichettati con verde fluorescente anti-F4 / 80 dell'anticorpo (passaggio 4). Così, rossi fluorescente, IgG-opsonized globuli rossi umani vengono aggiunti al verde fluorescente fagociti (macrofagi).
- Non appena sono stati aggiunti i globuli rossi umani, montare la diapositiva di canale su un microscopio confocale di filatura disco (con l'incubatrice di fase impostato a 37 ° C) per l'imaging, ad esempio, tramite un 60 X / 1,49 obiettivo di immersione in olio. Avviare imaging più presto, dato che le particelle iniziano a stabilirsi entro 1 min.
Nota: Utilizzando perline fluorescenti con un diametro di 100 nm, abbiamo misurato, dall'analisi del punto di diffusione funzioni, risoluzioni di x-y di x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm del laser) e x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm del laser). Tuttavia, per ridurre photobleaching e fototossicità durante il time-lapse imaging 3D delle cellule viventi, abbiamo compromesso risoluzione spaziale utilizzando 2 x 2 binning. Binning aumenta la sensibilità (migliora il rapporto segnale-rumore) e la frequenza di fotogrammi consentita, ma a scapito della risoluzione spaziale. - Utilizzare una perfetta messa a fuoco (o simili) sistema per evitare la deriva di messa a fuoco durante le registrazioni. Dopo aver attivato il sistema di messa a fuoco perfetta, utilizzare il controllo offset per messa a fuoco su sporgenze lamellipodial macrofago immediatamente sopra il vetrino coprioggetti (Vedi nota sotto) della diapositiva canale. Questo livello di messa a fuoco corrisponde a Z = 0 µm. Ottieni Z-stack da µm-1 a + 16 µm a 0,8 µm passi, che ammonta a 22 Z-fette. Z-stack può, ad esempio, essere ottenuto ad un tasso di 1 pila (per ogni canale) ogni 15 s per un totale di 16 min.
Nota: Lunghi periodi di registrazione soffrono di perdite di qualità dell'immagine, principalmente a causa di photobleaching. Z-stack vengono acquisiti per ciascuno dei due canali: i macrofagi sono Imaging utilizzando un laser di 488 nm (canale verde) e globuli rossi umani sono Imaging utilizzando un laser di 561 nm (canale rosso). Utilizzando questo approccio, diverse visualizzazioni dei macrofagi che ingeriscono IgG-opsonized globuli rossi umani timepoints diversi possono essere ottenuti (ad esempio, Vedi Figura 2).
Nota: Le impostazioni tipiche del sistema (con 2 x 2 binning) sono: canale verde (20,5% laser (50 mW; 488 nm) di potenza, sensibilità 101 (intervallo da 0 a 255) e tempo di esposizione di 200 ms); canale rosso (10,5% laser (50 mW; 561 nm) di potenza, sensibilità 101 (gamma, 0-255) e 98 ms tempo di esposizione).
Nota: Parte inferiore della diapositiva canale è un polimero con un coprioggetto in vetro #1.5 e le stesse proprietà ottiche di vetro dello stesso spessore, ma, in particolare, il materiale ha il vantaggio di permeabilità ai gas.
8. la fagocitosi di membrana plasmatica macchiato e rivestite con complemento globuli rossi umani di imaging
- Complemento-opsonize membrana plasmatica macchiato e IgG-opsonized umano globuli rossi allo stesso modo le sezioni 5 e 6, tranne che, invece di pipettaggio 4 µ l della sospensione diluita 1:1 del globulo rosso in mezzo RPMI 1640 (Hepes) di 2 mL per volta, come descritto nella sezione 3.3, Dispensare 4 µ l in medium RPMI 1640 (Hepes) 1 mL per volta e di conseguenza etichettare la provetta 4:1, 000. Così, i globuli rossi umani sono 2 volte più concentrato.
- Procedere con i passaggi nelle sezioni 4 e 5, ma partendo con il 4:1,000 piuttosto che lo stock di 4:2,000 diluito di globuli rossi umani (4:1, 000 e 4:2,000 riferirsi per le diluizioni successive degli inizialmente 1:1 diluiti globuli rossi umani descritti nelle sezioni 3.1 e 3.2).
- Sacrificare un mouse null C5 (ad es., B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) per inalazione isoflurane (> 5% in aria) seguita dalla decapitazione e raccogliere il sangue. Abbiamo solitamente gocciolare circa 0,8 mL di sangue in una provetta di plastica 14 mL a fondo tondo subito dopo la decapitazione e l'inalazione isoflurane.
- Dopo 1 h, quando il sangue è coagulato completamente, trasferire il liquido residuo in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Successivamente, attentamente prelevare il siero giallastro. In genere, recuperiamo almeno 200 µ l di C5 null siero. Mettere il siero null C5 sul ghiaccio.
- Dopo un'incubazione di 4 min della membrana plasmatica macchiato globuli rossi umani con IgG, aggiungere un altro 1 µ l di anticorpo anti-CD235a (dando 2 x concentrato) e poi prendere 50 µ l di sospensione cellulare e mescolare in un tubo del microcentrifuge separata 2,0 mL contenente 50 µ l C5 null siero. Continuare a mescolare più volte (ogni 1 min) pipettando su e giù, come in sezione 6.2, per altri 4 min. Così, dopo questo passaggio, i globuli rossi umani sono stati incubati con l'anticorpo anti-CD235a per un totale di 8 min.
Nota: Il periodo di incubazione di 4 min con siero null C5 è sufficiente per attivare la cascata del complemento classica e opsonize i globuli rossi umani con C3b, che viene scisso dalla fattore ho iC3b.
9. conferma di IgG - e C3b-Opsonizzazione dei globuli rossi umani
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Confermare Opsonizzazione dei globuli rossi umani con anticorpo di topo anti-CD235a IgG (IgG2b; Vedi sezione 6.1) incubando le cellule con anti-topo (secondario) anticorpo IgG di capra coniugata con un fluoroforo verde o rosso fluorescente.
- Aggiungere anticorpo di IgG anti-CD235a mouse 1 µ l e 1 µ l fluorescente contrassegnati anticorpo secondario anti-topo ad una sospensione di 400 µ l di globuli rossi umani e incubare a 37 ° C per 8 min. Successivamente, lavare due volte (come in sezioni 5.2 – 5,5).
- Risospendere il pellet cellulare con 400 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio e pipetta 100 µ l della sospensione in un canale slide (Vedi Figura 1) per l'imaging di fluorescenza confocale.
Nota: Le celle saranno ciuffo (agglutina) dopo il lavaggio e risospensione, ma di lavaggio è necessario ridurre la fluorescenza di fondo dovuto l'anticorpo secondario non associato.
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Confermare l'opsonizzazione dei globuli rossi umani, pre-etichettata con IgG di topo e incubato con il siero del mouse null C5, con C3b/iC3b utilizzando, ad esempio, anticorpo di topo anti-topo C3b/iC3b/C3c e un anticorpo secondario, ad esempio, anticorpo di IgG di capra anti-topo coniugata per un fluoroforo verde fluorescente.
- Ripetere i passaggi nella sezione 8 usando i globuli rossi umani non colorati.
- Aggiungere 0,25 µ l fluorescente con etichetta anti-anticorpo C3b/iC3b/C3c alla miscela 100 µ l (50 µ l con etichetta IgG globuli rossi umani + 50 µ l C5 null mouse siero) e incubare a 37 ° C per 8 min.
- Lavare due volte, risospendere il pellet in 100 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio e pipetta la sospensione in un canale slide (Vedi figura 1) per l'imaging di fluorescenza confocale.
Representative Results
Un diagramma schematico della diapositiva canale utilizzato per l'imaging della fagocitosi mediante microscopia confocale filatura time-lapse è illustrato nella Figura 1. Globuli rossi umani (hRBCs) sono macchiati con il marcatore di membrana del plasma fluorescente rosso CellMask Orange, considerando che i macrofagi peritoneali residenti isolato mouse (Ms) sono etichettati con verde fluorescente Alexa Fluor 488-anti-F4/80 anticorpo coniugato ( Figura 2), che serve sia come un'etichetta di membrana plasmatica come un indicatore specifico dei macrofagi del topo. Globuli rossi umani può essere opsonized con mouse IgG (mIgG) o mouse IgM (mIgM), incubando le cellule con l'anticorpo anti-CD235a IgG (o IgM) (CD235a, noto anche come glicoforina A, è una proteina espressa specificamente su globuli rossi umani). Time-lapse imaging 3D dei macrofagi fluorescenti verdi ha presentato con rossi fluorescente globuli rossi umani permette la visualizzazione di eventi fagocitica di singola particella (Figura 2). Stretta osservazione di singoli eventi fagocitici consente dettagli di cattura delle particelle e l'ingestione di essere delineato. Ad esempio, la cattura di un mIgG-opsonized globulo rosso umano di un macrofago filopodium, una sottile, barretta-come proiezione, può essere osservata (Figura 3A; veda inoltre Horsthemke et al. 15). Inoltre, la spremitura di un globulo rosso umano durante la formazione fagocitica tazza può essere osservata (Figura 3A). Dopo l'introduzione del siero fresco del mouse, mIgG-opsonized, o globuli rossi umani, mIgM-opsonized innescare la cascata di classico del complemento, che culmina nella formazione di un complesso di attacco di membrana emolitica. La cinetica del hemolysis complemento-mediata può essere misurata da imaging cellule doppia colorazione con CellMask Orange e calceina. Verde fluorescente calceina citosolico fuoriesce rapidamente dalle cellule durante emolisi (Figura 3B).
Figura 1: gestione di diapositive canale rivestite su fibronectina. Diapositiva di canale (A) A è costituito da due serbatoi collegati da un canale con le dimensioni 50 x 5 mm 0,4 mm canale: le diapositive sono inizialmente predosate applicare 1-2 mL di terreno di uno dei due bacini e inclinando il vetrino. Tappi (B) possono essere inseriti i serbatoi prima dell'incubazione. I tappi possono essere utilizzati per pompare fuori le bolle d'aria indesiderate prima della semina il canale con le cellule. Canale 100 µ l (C) l'aria priva di bolle può essere riempito pipettando direttamente medio nella bocca di un canale. Questo passaggio viene utilizzato, ad esempio, ai macrofagi di seme in una diapositiva o per aggiungere gfluorophore (verde fluorescente)-anticorpo coniugato anti-F4/80, che serve come un'etichetta di membrana, come pure un indicatore del macrofago del mouse. (D) dopo la dispensazione di particelle, quali opsonized eritrociti umani, in un canale seminato con fluorescente macchiato macrofagi, la diapositiva può essere posizionata sul palco di un microscopio invertito e microscopia confocale di time-lapse filatura disco può essere eseguita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Time-lapse imaging 3D della fagocitosi. Diagramma schematico (A), mostrando l'opsonizzazione della membrana plasmatica macchiata (rosso fluorescente) globuli rossi umani (hRBCs) con anticorpo di topo (m) anti-CD235a immunoglobulina G (mIgG) e la presentazione di hRBCs con etichetta ai macrofagi di topo (Ms), con l'etichetta (verde fluorescente) con l'anticorpo anti-F4/80 fluorophore-coniugato fluorescente verde. (B) Time-lapse immagini (XZ visualizzazioni), ottenute mediante microscopia confocale disco, Risultati Coppa fagocitica formazione e ingestione di hRBCs mIgG-opsonized di filatura. Barra della scala = 10 µm. (C) ricostruzioni 3D mostrando i macrofagi che ingeriscono mIgG-opsonized hRBCs. Visualizzazioni XZ corrispondenti (per 3 i punti temporali) sono mostrati in rappresentano spaziature griglia B. 5.07 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: acquisizione di una particella di un filopodium. Time-lapse immagini, ottenute facendo girare la microscopia confocale disco, mostrando un macrofago del mouse cattura un topo di G dell'immunoglobulina (mIgG)-opsonized globulo rosso umano (hRBC) tramite un filopodium (frecce nel pannello superiore), una proiezione di barretta-come. Si noti che il globulo rosso perde la sua crenations presto durante la formazione di Coppa fagocitica. Inoltre, la Coppa fagocitica sembra spremere il globulo rosso avvolto (indicato dalle frecce nel pannello inferiore). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La stragrande maggioranza dei saggi di fagocitosi, soprattutto end-point e saggi di alto-rendimento, non fornire una visualizzazione di come le particelle sono effettivamente catturate, avvolto e ingerite. Studi pionieristici di Munthe-Kaas et al. 10 e Kaplan2 nel 1970 ha suggerito che sorprendentemente diverse riorganizzazioni del citoscheletro sono stati coinvolti nella fagocitosi di IgG-opsonized contro complemento-opsonized particelle (globuli rossi delle pecore). Qui descriviamo saggi di fagocitosi usando la microscopia confocal di filatura disco che permettono la formazione immagine ad alta risoluzione, in tempo reale dei singoli eventi fagocitici. Fagocita il nostro modello è il macrofago peritoneale residente del mouse, che può essere isolata con gestione minima, e usiamo i globuli rossi umani appena isolate come particelle. Tuttavia, i test di fagocitosi potrebbero essere applicati ad altri fagociti, quali macrofagi derivanti dal midollo osseo del topo o neutrofili, linee cellulari di topo del macrofago, macrofagi monocito-derivati umani o i neutrofili del sangue periferico umano. Nel caso di fagociti umani o neutrofili del mouse, alternativa fluorescente anticorpi marcati con sarebbe necessaria, ad esempio fluorescente identificati anti-CD14 anticorpi (monociti/macrofagi umani)16 o anticorpi anti-Gr-1 (Ly - 6 G) (mouse neutrofili).
Unopsonized globuli rossi umani, come globuli rossi di pecora tradizionalmente utilizzati, sono inerti nel senso che queste cellule sono non (o, almeno, molto raramente) ingerite dai macrofagi peritoneali del topo. In questo modo, in contrasto con perle di polistirolo, attività di basso fondo. Globuli rossi umani può essere convenientemente opsonized con immunoglobuline utilizzando anticorpi monoclonali di topo IgG o IgM contro CD235a (glycophorin A), un marker specifico di umani eritrociti (globuli rossi) e di precursori eritroidi17, 18. nelle analisi parallele, anti-topo fluorescente contrassegnati IgG o IgM anticorpi secondari possono essere applicati per confermare opsonizzazione. Le classi di anticorpi IgG e IgM sono emoagglutinine, sostanze (anticorpi) che causano globuli rossi per agglutinare. Per evitare di agglutinazione, mescoliamo a intermittenza la sospensione cellulare durante il periodo di incubazione di 8 min con l'anticorpo anti-CD235a, e poi aggiungiamo la sospensione mista direttamente a una diapositiva di canale macrofago-contenenti (rivestite di fibronectina diapositiva) senza una fase di lavaggio . Fasi di lavaggio coinvolgono sedimentazione dei globuli rossi per centrifugazione, che promuove fortemente agglutinazione. Prima opsonizing globuli rossi umani, etichettiamo la membrana plasmatica con una sonda fluorescente lipofilica di arancione/rosso. Questa sonda è brillantemente fluorescente all'inizio di time-lapse registrazioni, ma il segnale svanisce gradualmente, probabilmente in gran parte dovuto photobleaching19. Inoltre, i macrofagi e il rivestimento di fibronectina della diapositiva può diventare debolmente arancione/rosso fluorescente durante le registrazioni. Questo problema è presumibilmente a causa di un lavaggio insufficiente di globuli rossi umani dopo l'etichettatura. Invece di utilizzare un marcatore di membrana plasmatica fluorescente lipofilico, globuli rossi umani potrebbe essere etichettati con un derivato di rodamina pH sensibili usando suo ammina reattiva succinimidyl ester15,20. Questo ha il vantaggio di permettere la visualizzazione di maturazione del fagosoma poiché l'intensità di fluorescenza aumenta con la diminuzione di pH15,20, ma questo approccio ha lo svantaggio che i preparati reattivi estere sono attualmente costosi e instabile dopo la ricostituzione in mezzo acquoso.
IgG-opsonized globuli rossi umani sono ingerite tramite FcγRs, che può essere confermata mediante macrofagi peritoneali isolati da NOTAM21 o Fcer1g- / - (Fcer1g) topi. I macrofagi NOTAM associare IgG-opsonized globuli rossi umani, ma mancano ITAM (immunoreceptor motivo l'attivazione basata su tirosina) - mediata segnalazione richiesta per indurre la fagocitosi, mentre i macrofagi Fcer1g knockout non esprimono superficie FcγRs. IgG - o IgM-opsonized globuli rossi umani può essere inoltre opsonized con C3b (che viene scisso a iC3b) incubando le cellule con siero fresco isolato da un mouse null complemento C5 (selvaggio-tipo siero provoca emolisi). Opsonine IgG e IgM attivano la cascata del complemento classico, che conduce alla formazione di pori (complessi di attacco di membrana) e lisi cellulare. In topi privi di complemento C5, la cascata del complemento procede a complemento C3 clivaggio, ma C5 convertasi mancano il substrato necessario per catalizzare la via terminale. Abbiamo sviluppato le analisi semplice per misurare la cinetica della cascata del complemento. In breve, i globuli rossi umani può essere co-etichettati con un rosso fluorescente, marcatore di membrana plasmatica e il fluoroforo verde fluorescente, citosolico. Formazione del complesso di attacco della membrana, formata da componenti del complemento C5-C9, il fluoroforo citosolico è rapidamente (in secondi) perso dal cytosol. Visualizzazione della funzione attuatore (citolisi) della cascata del complemento ha indicato che il tempo di incubazione di 4 min è sufficiente per C3b/iC3b Opsonizzazione dei globuli rossi umani. Nelle analisi parallele, C3b/iC3b rivestimento di globuli rossi umani può essere facilmente valutata dopo l'applicazione di una miscela di anti-topo C3b e identificato fluorescente anticorpi secondari. In questo caso, è necessaria una fase di lavaggio per rimuovere gli anticorpi fluorescenti non legati. Anche se la fase di lavaggio coinvolge cella sedimentaion mediante centrifugazione, che promuove l'agglutinazione, Opsonizzazione successo possa essere prontamente valutati mediante microscopia confocale. Fagocitosi mediata dal recettore di complemento possono essere ripreso da entrambi l'applicazione IgG- / iC3b-opsonized umano globuli rossi ad NOTAM o Fcer1g- / - macrofagi o introducendo IgM- / iC3b-opsonized umano globuli rossi ai macrofagi di selvaggio-tipo. IgM-opsonized globuli rossi non vengono riconosciuti dall'ITAM contenenti FcγRs (FcγRI, FcγRIII e FcγRIV) necessaria per la fagocitosi delle particelle di IgG-opsonized22.
Per realizzare l'immagine fagocitica eventi, la membrana plasmatica dei macrofagi possono essere etichettati con anticorpo anti-F4/80 coniugato fluoroforo fluorescente verde, che serve anche come indicatore specifico dei macrofagi del topo. Globuli rossi umani può essere renderizzati rosso fluorescente tramite incubazione con un pennarello rosso/arancio fluorescente della membrana plasmatica, come discusso in precedenza. Questo marcatore di membrana plasmatica lipofilico evita potenziali effetti confondenti delle etichette a base di anticorpi. Rossi fluorescente globuli rossi umani, con o senza opsonizzazione, può essere dispensati direttamente nel canale di 100 µ l di una diapositiva di canale ed imaged time-lapse 3D tramite un 60x / 1,49 olio immersione (o simili) obiettivo eseguita utilizzando la 488 nm e 561 nm laser linee , rispettivamente, di un microscopio confocale (o simile) del disco di filatura. È tentato di ottimizzare il sistema per imaging ad alta risoluzione, ma l'acquisizione di ripetute Z-stack oltre 16 min o così può causare fototossicità e considerevole photobleaching. Abbiamo scelto di utilizzare il 2 x 2 binning per promuovere buoni rapporti segnale-rumore e consentire riduzioni in intensità di eccitazione e/o tempi di esposizione, ma a scapito della risoluzione ottica. Inoltre, per ridurre la fototossicità, aggiungiamo un organismo saprofago delle specie reattive dell'ossigeno al mezzo. Negli studi futuri, l'analisi potrebbero essere modificate per la fagocitosi dei globuli rossi umani apoptotica di immagine. Applicazione di un Ca2 + ionoforo del, ad esempio A23187, utilizzabile per indurre la fosfatidilserina esternalizzazione23, un "eat me" segnale e segno distintivo del precoce apoptosi24,25.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni HA 3271/4-1 e HA 3271/4-2 dalla DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) e la concessione FF-2016-05 da EXC 1003 (Cluster di eccellenza 1003), cellule in movimento (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
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