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Bioengineering

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Einzellige Sequenzierung zeigt genotypischen Heterogenität in biologischen Systemen, aber aktuelle Technologien fehlen des Durchsatzes für die Tiefe Profilierung der Zusammensetzung und Funktion notwendig. Hier beschreiben wir einen mikrofluidischen Workflow für die Sequenzierung > 50.000 einzellige Genome aus verschiedenen Zell-Populationen.

Abstract

Sequenziertechnologien haben einen Paradigmenwechsel von Masse, einzellige Auflösung als Reaktion auf eine sich entwickelnde Verständnis der Rolle der zellulären Heterogenität in biologischen Systemen unterzogen. Jedoch wurde einzellige Sequenzierung von großen Populationen durch Einschränkungen bei der Verarbeitung von Genome für die Sequenzierung behindert. In diesem Beitrag beschreiben wir einer Methode für einzellige Genom-Sequenzierung (SiC-Seq) die Tröpfchen Mikrofluidik verwendet, um zu isolieren, zu verstärken und Barcode der Genome einzelner Zellen. Zelle die Kapselung in mikrogele ermöglicht es, die unterteilte Reinigung und Tagmentation der DNA, während eine mikrofluidischen Fusion effizient jedes Genom mit einem einzigartigen einzellige Oligonukleotid-Barcode Paare erlaubt > 50.000 Einzelzellen sequenziert werden pro Durchlauf. Die Sequenzierungsdaten ist per Barcode Generieren von Gruppen von liest aus Einzelzellen demultiplexed. Als eine Hochdurchsatz- und Low-Bias Methode der einzelligen Sequenzierung wird SiC-Seq ein breiteres Spektrum von genomischen Studium richtet sich an unterschiedliche Zellpopulationen ermöglichen.

Introduction

Das Genom dient als eine Blaupause der zelluläre Identität und Funktion, mit der Gesamtheit des Organismus Potenzial Codierung ist. Ein Verständnis der zellulären Biologie an der Genom-Ebene kann die beobachteten phänotypische Vielfalt innerhalb heterogener Zell-Populationen erklären. Diese Heterogenität ist offensichtlich in biologischen Systemen und hat breite Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Krankheit. Zum Beispiel sind Genvarianten Kopie Zahl unter den Tumorzellen, die Entwicklung und Ausbreitung von Krebs1,2verbunden. Bei bakteriellen Infektionen Pathogenitätsinseln vorhanden in einem kleinen Bruchteil der Genome horizontal übertragen werden können und führen zu der Verbreitung von Antibiotika-resistente Bakterien3,4. Eine primäre Herausforderung bei der Untersuchung der Genome der Ebene der einzelligen ist die geringe Mengen an DNA zur Verfügung sowie die Notwendigkeit, Tausende von Zellen zu analysieren, die ganze Vielfalt der Genotypen zu probieren. Aus diesen Gründen haben Einschränkungen in experimentelle Durchsatz die Wirksamkeit der einzelligen Studien, Vorspannen Ergebnisse in Richtung der am häufigsten vorkommenden Zellen verhindert. Einzellige ISOLIERUNGSTECHNIKEN wie Flow sortieren,5,6, optische Pinzette7, Einbettung in loser Schüttung Gele8und Mikrofluidik9 sind in der Lage hunderte von Zellen für die Sequenzierung; Dies ist jedoch nur einen kleinen Bruchteil von den meisten Proben. Eine Methode für einzellige Genom-Sequenzierung mit wesentlich höheren Durchsatz würde erlauben, tiefer und umfassender Profilierung der Zell-Populationen, damit Aufklärung die Rolle der genotypischen Vielfalt innerhalb dieser Gemeinschaften.

Droplet Mikrofluidik ermöglicht die Hochdurchsatz-Manipulation von Zellen und biologische Reagenzien innerhalb von Millionen von Picoliter-Skala Reaktoren. Heute, Microdroplet, die Technologien verwendet wurden, um differentielle Expression-Muster zwischen den Zellen von heterogenen Gewebe10,11,12, studieren tief Sequenz lange Moleküle13,14 ,15und Verhalten Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChiP-Seq) Analysen auf Einzelzellen16. In der Tat sind Microdroplets hohem Durchsatz, unterteilte Operationen, so dass sie offen für Anwendungen in einzellige Genomics. Die Entwicklung dieser Technologie stellt jedoch seinen eigenen einzigartigen technologischen Herausforderungen. Zellen müssen lysiert, gereinigt und mit minimalen Bias, um einheitlich Probe Zellpopulationen verstärkt werden. Außerdem, im Gegensatz zu Polyadenylated mRNA Transkripte in Säugerzellen gibt es keine vergleichbare Molekulare Motiv im Genom, die Erfassung von der Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern. Aus diesen Gründen wurde die Sequenzierung des Genoms einzellige in Microdroplet Plattformen schwer umzusetzen.

Dabei bieten wir ein detailliertes Protokoll unseres bereits berichtet einzellige mikrofluidischen Ansatzes in der Lage, der Sequenzierung der Genome von Zehntausenden von Zellen in einem einzigen Experiment17. Mit dieser Technologie, genannt SiC-Seq Bakterienzellen in Mikron-Skala Hydrogele gekapselt und individuell lysiert, Tagmented, und fusionierte mit einer Microdroplet, enthält einen einzigartige Oligonukleotid-Barcode, der auf die Zelle genomischer DNA über gespleißt wird eine einzigen Überschneidungen Erweiterung Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Hydrogele dienen als isolierte Container in denen hohen Molekulargewicht genomischer DNA sterisch ummantelt ist, ermöglicht kleinere Moleküle wie Wasch- und lytischen Enzymen Zugang zu reinigen DNA vor Barcoding18. Dieses Protokoll verarbeitet > 50.000 Einzelzellen in einer Angelegenheit von Stunden, wodurch eine Barcode-Bibliothek für die Sequenzierung bereit. Nach der Sequenzierung sind die liest demultiplexed entsprechend ihrer einzellige Barcode Reihenfolge, was in einem Dataset besteht aus Millionen von liest, jeder mit einem zellulären Index.

Protocol

(1) mikrofluidischen Gerät Fertigung

  1. Vorbereiten der mikrofluidischen Maske Designs mit Computer aided Design (CAD) Software (als vorgesehen. DWG; siehe Zusätzliche Dateien). Haben Sie diese Entwürfe durch den Verkäufer mit einer 10 µm Auflösung auf einer Leiterplatte Folie gedruckt.
    Hinweis: Für mehrschichtige mikrofluidischen Geräte enthalten die entsprechenden Masken Ausrichtungsmarken.
  2. Für jedes Gerät den SU-8 master-Form (Abbildung 1A) wie folgt zu fabrizieren.
    1. Bereiten Sie einen 3 - In-Durchmesser-Silizium-Wafer durch Gießen etwa 1 mL der SU-8 3025 Photoresist auf die Mitte des Wafers. Sichern der Wafer auf der Spin Coater Futter durch die Anwendung der sog.
    2. Siehe Tabelle 1 für eine Auflistung der Schichtdicken und Geschwindigkeiten für jedes Gerät zu drehen. Für alle Geräte, beginnen die Spin-Beschichtung mit 30 s bei 500 u/min, gefolgt von 30 s mit der angegebenen Geschwindigkeit.
    3. Entfernen Sie die SU-8-Silizium-Wafer aus Spin Coater und weiche Backen auf einer Herdplatte setzen auf 135 ° C für 30 min. kann den Wafer nach dem Backen auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    4. Die SU-8-Silizium-Wafer mit der entsprechenden mikrofluidischen Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm UV-LED 3 Minuten lang aussetzen.
    5. Backen Sie nach der Belichtung hart die Wafer auf eine Herdplatte auf 135 ° C für 1 min festgelegt. Ermöglichen Sie nach diesem Backen Schritt die Wafer auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    6. Überspringen Sie für eine einschichtige mikrofluidischen Gerät Schritt 1.2.7. Wiederholen Sie für eine vielschichtige mikrofluidischen Gerät die Schritte 1.2.1 - 1.2.5 für die zweite Schicht der Fotolack (Abbildung 1 b).
    7. Im Anschluss an die ersten harten Backen für eine einlagige Gerät (oder der zweiten harten Backen für eine vielschichtige Gerät) entwickeln Sie die Wafer durch Eintauchen in ein Bad aus Propylenglykol Monomethyl Äther Acetat (PGMEA) für 30 min.
    8. Verwenden Sie nach der Wafer-Entwicklung eine Spritzflasche mit PGMEA auf um den Wafer zu spülen. Dann abspülen des Wafers mit einer Spritzflasche mit Isopropanol vor Inverkehrbringen eine Herdplatte 135 ° C für 1 min trocknen lassen.
    9. Legen Sie die Wafer (im folgenden als Master bezeichnet) in einer Petrischale für den Guss mit Polydimethylsiloxan (PDMS).
  3. Fahren Sie mit dem Master in Schritt 1.2 vorbereitet mit die Gerät-Fertigung mit einem PDMS-Casting durchführen.
    1. Bereiten Sie die PDMS durch die Kombination einer Silikons-Basis mit einem härter in einem 11:1-Verhältnis von Masse. Mischen Sie die Silikon-Basis und Härtemittel mit einem Stock rühren von hand.
    2. Entgasen Sie die PDMS, indem es in eine entgasungskammer und Anlegen eines Vakuums. Ermöglichen die PDMS zu entgasen, bis die Luftblasen nicht mehr sichtbar sind (in der Regel 30 min).
    3. Gießen Sie vorsichtig entgast PDMS über dem Meister, zu einer endgültigen PDMS-Schichtdicke von ca. 5 mm. Degas PDMS erneut, um das Entfernen von Luftblasen zu gewährleisten.
    4. Backen Sie nach der Entgasung der PDMS und der Meister bei 80 ° C 80 min..
    5. Sorgfältig Verbrauchsteuern der ausgehärteten PDMS-Platte vom gebackenen Meister mit einer Rasierklinge. Sicherstellen Sie, dass alle Kürzungen auf die Silizium-Wafer.
      Hinweis: Kürzungen aus der Silizium-Wafer können eine Lippe verhindern eine gleichmäßige Verklebung führen.
    6. Stanzen Sie die ein- und Ausläufe mit einem 0,75 mm-Biopsie-Punch. Entfernen Sie Staub und streunende PDMS mit einer Verpackungsklebeband auf der Feature-Seite des Gerätes.
    7. Vor dem Plasma behandelt das Gerät reinigen Sie einen Objektträger 50 x 75 mm mit Isopropanol abspülen und trocknen.
    8. Legen Sie für die Plasmabehandlung die PDMS Platte und Glas Folie in den Plasma-Bonder mit den Merkmalen nach oben. Führen Sie die Plasmabehandlung mit 1 Mbar O2 Plasma für 1 min. Bond das Gerät auf das Glas schieben bringt die ausgesetzt oder aufgedeckt, zusammen Seiten.
    9. Im Anschluss an die Plasmabehandlung Backen Sie das Gerät bei 80 ° C für 40 Minuten.
    10. Schließlich Spritzen Sie Glas Oberflächenbehandlung Flüssigkeit in einer der Buchten mikrofluidische Kanäle hydrophobe rendern. Stellen Sie sicher, alle Kanäle sind mit der Lösung völlig überflutet und wiederholen Sie die Injektion für jedes Dropmaker. Backen Sie die behandelten Gerät bei 80 ° C für 10 min überschüssiges Lösungsmittel verdunsten.

2. die Verkapselung von Zellen in Agarose Mikrogele

Hinweis: Siehe Abbildung 2A.

  1. Bereiten Sie 1 mL 3 % w/V niedrig schmelzende Temperatur Agarose 1 x Puffer Tris-EDTA (TE). Halten Sie die Agarose-Lösung auf eine 90 ° C Hitze Block bis unmittelbar vor der Spritze laden.
  2. Bereiten Sie die Zellsuspension.
    Hinweis: Dieses Protokoll und die damit verbundenen mikrofluidischen Geräte wurden validiert mit bakteriellen Zellen aus einer gefrorenen Lager oder frische Zubereitung zu arbeiten. Säugerzellen, je nach Zelltyp, erfordern eine Anpassung der mikrofluidischen Kanal Dimensionen größeren Zellgrößen unterzubringen.
    1. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    2. Zählen der Zellen in einem Hemocytometer oder durch Strömung zu sortieren. Bereiten Sie 25 µm mikrogele mit einer Zelle Kapselung-zielrate von 1: 10 1 mL Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 2,4 x 107 Zellen/mL.
    3. Die Zellen Spin-down bei 3.000 x g für 3 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL 17 % V/V Dichte Gradienten Medium (siehe Tabelle der Materialien) mit PBS-Puffer. Halten Sie es auf Eis, bis die Spritze laden.
  3. Laden Sie eine 3-mL-Spritze mit fluorierten Öl (HFE) mit einer 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG) Tensid zu, mit einer 27 G Nadel passen Sie und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.
    Hinweis: Passen alle Spritzen mit einer 27 G Nadel für die Mikrofluidik Schritte in diesem Protokoll. Um das Risiko von unbeabsichtigten stechen lassen Sie Kappen auf allen Nadeln bis Pumpenbetrieb beginnt.
  4. Laden Sie die Zellsuspension und flüssige Agarose in 1 mL Spritzen, passen Sie beide mit 27-Gauge Nadeln und legen Sie diese in Spritzenpumpen.
  5. Halten Sie die Agarose-Spritze und die Pumpe mit einer kleinen Raum-Heizung zu verhindern, dass die Agarose Gelbildung in der Spritze und Zulauf Schlauch warm. Der Warmlufterzeuger auf HIGH gesetzt und positionieren Sie es so, dass die Heizfläche ca. 10 cm entfernt von der Spritze ist. Sicherzustellen Sie, dass die Temperatur gemessen an der Spritze ca. 80 ° C.
    Hinweis: Benutzer werden empfohlen, die Heizung bei der empfohlene Abstand von den pumpenden Apparat zur Verringerung des Risikos von Sachschäden, einschließlich Schmelzen des Schlauches zu pflegen.
  6. 25 µm Microgel Tropfen mit dem Co-Flow Dropmaking Gerät zu generieren.
    Hinweis: Siehe Abbildung 3A für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose.
    1. Schließen Sie die Spritze Nadeln an der mikrofluidischen Gerät Buchten mit Stücken von Polyethylen (PE) Schläuche. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen.
    2. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in eine 15 mL sammelröhrchen.
    3. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 800 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG; 200 µL/h für die Zellsuspension mit PBS-Puffer; und 200 µL/h für 3 % w/V Agarose.
  7. Legen Sie nach der Dropmaking dem Sammelrohr bei 4 ° C für 30 min um die komplette Gelierung der Agarose zu gewährleisten.

3. brechen und waschen die Agarose-Mikrogele

  1. Entfernen Sie die untere Schicht des Öls aus dem Sammelrohr mit einer 3 mL Spritze, ausgestattet mit einer 20 G-Nadel, kümmert sich nicht um die oberste Schicht der Agarose Tröpfchen zu stören.
  2. Brechen Sie die Emulsionen mit Perfluorooctanol (PFO).
    1. Die Agarose-Tropfen 1 mL 10 % V/V PFO in HFE hinzufügen. Pipettieren diese Lösung oben und unten für 1 min gründlich die Emulsionen beschichtet.
      Hinweis: Für die Microgel waschen Schritte, pipettieren der Lösungen mit 1.000 µL Spitze. Die Microgel Suspension sollte homogen und frei von Klumpen nach pipettieren sie angezeigt werden.
    2. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 1 min um die Agarose-mikrogele zu sammeln. Entfernen Sie den PFO/HFE Überstand durch Aspiration; die mikrogele sind jetzt frei von ihrer Tensid-Schicht und klar erscheint.
  3. Gewaschen Sie mikrogele mit einem Tensid in Hexan werden.
    Achtung: Hexan ist eine flüchtige organische Lösungsmittel, und die Wäsche im Schritt 3.3 in einem Abzug durchgeführt werden.
    1. Fügen Sie 2 mL 1 % V/V Sorbitan Monooleate nichtionische Tenside (siehe Tabelle der Materialien) in Hexan, die Agarose-mikrogele. Pipettieren nach oben und unten 10 X mischen, gewährleistet die vollständige Trennung der Microgel pellet.
    2. Drehen Sie das Rohr auf 1.000 x g für 1 min um die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die Tensid/Hexan Lösung zu entfernen.
    3. Wiederholen Sie die Tensid/Hexan zu waschen.
  4. Waschen Sie die mikrogele in einem wässrigen Puffer für jede verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen.
    1. Fügen Sie 5 mL TET Puffer [0,1 % V/V Octylphenol Nonylphenolethoxylat nichtionische Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) in 1 X TE] mit dem konischen Rohr. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    2. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 2 min die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die TET-Puffer zu entfernen.
    3. Wiederholen Sie TET Waschen 2 X.
    4. Das konische Rohr 5 mL 1 X TE-Puffer hinzufügen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    5. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 2 min die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die TE-Puffer zu entfernen.
    6. Wiederholen Sie die TE zu waschen.
  5. Überprüfen der Zelle Kapselung in mikrogele unter dem Mikroskop bei 400 X Vergrößerung durch Färbung einer 10 µL aliquoten Gele mit 1 X Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Mikrogele erscheint deutlich unter dem transparenten Kanal während der Zelle, die DNA wird unter den GFP-Kanal (497/520 nm Anregung/Emission Wellenlängen) fluoreszieren. Eine Überlagerung der transparenten und fluoreszierende Kanäle zeigen die Zellen in der mikrogele, wie in Abbildung 4A.

4. die Lyse der Zellen in Agarose über lytischen Enzymen

  1. Bereiten Sie 1 mL eine lytische Enzym-cocktail mit 800 µL TE-Puffer (1 X) 2 µL der Hefe lytische Enzym (5 U/µL bestand, Letzte 10 U/mL), 30 µL Dithiothreitol (1 M Lager, Letzte 30 mM), 60 mg Lysozym (lyophilisierte Pulver), 15 µL EDTA (0,5 M Lager Letzte 7,5 mM), 2 µL des Mutanolysin (100 U/µL bestand, endgültige 200 U/mL), 2 µL Lysostaphin (10 U/µL bestand, 20 U/mL final) und 30 µL NaCl (1 M bestand, Letzte 30 mM).
  2. Fügen Sie zusätzliche TE um das Volumen zu 1 mL zu bringen. Mischen Sie die Lösung durch aufschütteln.
  3. Die gesamte 1 mL der Enzymlösung lytische zu nicht mehr als 1 mL der gewaschenen mikrogele hinzufügen. Durch pipettieren 10 X mischen. Die Mischung bei 37 ° C inkubieren > 2 h in einem Shaker (das Maximum ist über Nacht Inkubation).

5. Reinigungsmittel-basierte Microgel Behandlung

  1. Im Anschluss an die Lyse über lytischen Enzymen (Schritt 4) Waschen der mikrogele.
    1. Spin-down der mikrogele 2.000 x g für 2 min und den überstand abgesaugt. Die Tröpfchen werden Deckweiß durch Zelle Trümmer verstreut im Pellet angezeigt.
    2. Aufschwemmen der mikrogele in 5 mL 10 mM Tris-HCl-Puffer und pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    3. Spin-down das Gemisch bei 2.000 x g für 2 min, dann entfernen Sie den Überstand durch Absaugen.
  2. Führen Sie eine reinigende Behandlung auf die mikrogele.
    1. Die Gele in einem Lithium Dodecyl Sulfat (Deckel) Lysis Puffer Aufschwemmen (0,5 % w/V Deckel in 20 mM Tris-HCl) und 60 µL 0,5 M EDTA zu einem Endvolumen von 3 mL.
    2. 5 µL ein Enzym Proteinase K (800 U/mL Brühe) hinzufügen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen, dann brüten die Mischung bei 42 ° C auf einem Heizblock für 1 h nach lösen der Zellmembranen und Proteine zu verdauen.
  3. Im Anschluss an die reinigende Behandlung Waschen der mikrogele.
    1. Spin-dem konische Rohr mit der mikrogele down bei 2.000 x g für 2 min. Entfernen des Überstands durch Absaugen.
    2. Mikrogele mit 10 mL 2 % V/V Polysorbat 20 im Wasser zu waschen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    3. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen.
    4. Waschen Sie die mikrogele mit 10 mL 100 % Ethanol, jede verbleibende Enzym zu inaktivieren. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    5. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen.
    6. Mikrogele mit 10 mL von 0,02 % V/V Polysorbat 20 im Wasser zu waschen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen.
    7. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen.
    8. Wiederholung der Polysorbat 20 Waschen 3 X. Übergeben Sie die Lösung durch ein 100 µm Zelle Sieb vor dem letzten Waschen, großen Klumpen zu entfernen.
  4. Aufschwemmen der mikrogele in 5 mL 10 mM Tris-HCl-Puffer, um DNA-Abbau zu verhindern. Die mikrogele können bis zu 1 Woche vor der Tagmentation (Schritt 7) bei 4 ° C aufbewahrt werden.

6. Erzeugung von Barcode Tröpfchen durch digitale PCR

  1. Bereiten Sie einen 500-Uhr bestand von BAR Grundierung (Tabelle 2) in einem 1 x TE-Puffer in einem Low-Bind-Rohr. Vor jedem Gebrauch verdünnen die Grundierung arbeiten bestand von 13:00 und Erhitzen auf 70 ° C für 1 min auf einem Heizblock.
  2. Bereiten Sie eine 150 µL PCR Reaktion Mischung mit 75 µL High-Fidelity-Heißstart Meister mischen (siehe Tabelle der Materialien) (2 X), 42 µL 3 µL P7_BAR Grundierung (10 µM bestand, PCR-Grade Wasser, 3 µL DNA_BAR Grundierung (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM) Letzte 0,2 µM), 6 µL Barcode Verdünnung (13:00-Lager, 40 fM final), 6 µL Polysorbat 20 (50 % V/V Lager, 2 % final) und 15 µL PEG 6 k (50 % w/V Lager, 5 % final). Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 X pipettieren.
  3. Bereiten Sie eine HFE-backed Spritze durch Zeichnen von 200 µL des HFE Öl in eine Spritze und passen Sie es mit einer Nadel. Befestigen Sie die Nadel einen Teil von PE-Rohre und prime die Linie von hand. Stecken Sie das Ende des PE-Rohres in der Ziellösung und zeichnen Sie sorgfältig alle 150 µL des PCR-Mixes in die PE-Schlauch und Spritze. Laden Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe.
  4. Laden Sie eine 1 mL Spritze mit fluorierten Öl (HFE), enthält ein 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG)-Tensid, passen Sie es mit einer Nadel und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.
  5. 25 µm-Barcode-Tropfen mit dem Co-Flow Dropmaking Gerät zu generieren.
    Hinweis: Siehe Abbildung 3A für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose.
    1. Stecker der Zellen Einlass eines Co-Flow-Dropmaker-Geräts mit einem kleinen Stück Blei Löten.
    2. Schließen Sie die Spritzen mit HFE geladen und PCR mix, der mikrofluidischen Gerät Buchten mit Stücken von PE-Schlauch, mit dem Geschmolzenen Agarose -Einlass für den Barcode PCR Mischung. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen.
    3. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in ein 0,2 mL PCR-Tube. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 600 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG und 200 µL/h für den PCR-Mix. Sammeln Sie die Tropfen in die PCR-Röhrchen mit etwa 50 µL der Tropfen in jedes Rohr.
  6. Entfernen Sie nach der Dropmaking vorsichtig die untere Schicht der HFE-Öl aus der Emulsionen mit Gel-Loading pipettieren Tipps und ersetzen Sie es mit FC-40 fluorierten ölhaltigen ein 5 % w/w PFPE-PEG Tensid. Thermischen Zyklus mit das folgende Protokoll: 98 ° C für 3 min, 40 X (98 ° C für 10 s, 62 ° C für 20 s, 72 ° C für 20 s), 72 ° C für 5 min und dann Halt bei 12 ° C.
    Hinweis: Die thermische radelte Tröpfchen können bei 4 ° C bis zu 1 Tag aufbewahrt werden.
  7. Überprüfen Sie die Barcode-Verstärkung und Kapselung-Rate.
    1. Bereiten Sie eine 1 X Nukleinsäure in HFE färben (siehe Tabelle der Materialien), mit einer 2 % w/w PFPE-PEG Tensid; der Fleck ist geringfügig mischbar in HFE und Binden an die DNA in den Tröpfchen.
    2. 1 µL Thermal radelte Barcode-Emulsion zu 10 µL Färbung Öl hinzufügen. Inkubieren sie 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Bild von Tröpfchen durch Fluoreszenz-Mikroskopie (GFP Kanal, 497/520 nm Anregung/Emission Wellenlängen) bei 200 X Vergrößerung und zählen die Barcode-Kapselung-Rate. Beachten Sie, dass das Signal diskret sein wird: die Tröpfchen mit verstärkten Barcodes fluoreszieren hell, während die leere Tropfen dunkel erscheint (Abbildung 4 b).

7. Tagmentation Genomic DNA in Tröpfchen

Hinweis: Siehe Abb. 2 b.

  1. Bereiten Sie 500 µL Tagmentation Lösung mit Reagenzien von Next Generation Sequencing Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie 7 µL Tagmentation Enzym, 250 µL Tagmentation-Puffer und 243 µL des PCR-Grade Wasser. Durch Vortexen mischen und die Mischung spin-down um zu sammeln. Laden Sie diese Lösung in einer HFE Öl-backed 1 mL Spritze und passen Sie es mit einer Nadel.
  2. Die Reinjektion der mikrogele vorbereiten.
    1. Spin-down der Microgel Tube für 2 min bei 2.000 x g und den überstand abgesaugt. 200 µL des Gels an die Spitze der eine HFE-backed Spritze mit einer Gel-Loading pipettieren Spitze zu übertragen und die Düse mit einem kleinen Stück Klebeband verschließen.
    2. Mithilfe eines Adapters 3D-gedruckten Zentrifuge (siehe ergänzende Dateien 1 und 2), drehen die Microgel Spritze für 3 min bei 3.000 x g.
    3. Entfernen Sie die flüssigen überstand aus der Spritze mit einer Gel-Loading pipettieren Spitze. Drücken Sie die Microgel-Schicht auf der Basis der Spritze Düse. Passen Sie die Spritze mit einer Nadel.
  3. Laden Sie eine 3 mL Spritze mit fluorierten Öl (HFE) mit einer 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG)-Tensid, passen Sie es mit einer Nadel und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.
  4. Neu Kapseln der mikrogele in Tröpfchen mit Tagmentation Reagenzien.
    Hinweis: Siehe Abb. 3 b für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose.
    1. Schließen Sie die Spritzen mit HFE, Tagmentation Mix und mikrogele zu den mikrofluidischen Gerät Einlässen mit Stücken von PE-Rohren. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen.
    2. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in eine leere 1-mL-Spritze mit den Kolben auf die 1 mL-Linie gezogen.
    3. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 2.000 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG, 200 µL/h für die mikrogele und 500 µL/h für die Tagmentation Mix.
  5. Überprüfen Sie die Microgel Kapselung Rate unter einem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung. Ca. 80-90 % der Tropfen sollte ein Microgel enthalten, wie in Abbildung 4dargestellt.
  6. Passen Sie die Spritze mit der Tagmentation-Emulsionen mit einer Nadel und inkubieren Sie es aufrecht in einem Heizblock oder Backofen für 1 h bei 55 ° C um die genomische DNA fragment.

8. Single-Cell Barcoding von mikrofluidischen Double Fusion

Hinweis: Siehe Abbildung 2.

  1. Bereiten Sie die Barcode-Tropfen für die Fusion indem die FC-40 ölfraktion mit HFE 2 % w/w PFPE-PEG. Sorgfältig übertragen Sie diese Tropfen in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel passen Sie und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.
  2. Laden Sie die inkubierten und Tagmented Microgel Tröpfchen Spritze in eine Spritzenpumpe.
  3. Bereiten Sie 500 µL des PCR-Mixes. Fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge zu verhindern, dass Ausscheidungen bilden: 140 µL des PCR-Grade Wasser, 10 µL der P5_DNA Primer (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM), 10 µL der P7_BAR Primer (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM), 50 µL PEG 6k (50 % w/V bestand 5 % final), 50 µL Polysorbat 20 (50 % V/V Lager, 5 % final), 250 µL Taq Master Mix (2 X) (siehe Tabelle der Materialien), 10 µL der Isothermen Polymerase (siehe Tabelle der Materialien), und 10 µL der Neutralisation Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Mischen sie von oben und unten 10 X pipettieren und spin-down der Mischung, um es zu sammeln. Laden Sie diese Lösung in einer 1-mL-Spritze mit HFE-backed, passen Sie es mit einer Nadel, und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.
  4. Laden drei 3 mL Spritzen mit fluorierten Öl (HFE), enthält ein 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen Glykol (PFPE-PEG) Tensid passen jeweils mit einer Nadel und legen Sie sie in Spritzenpumpen.
  5. Laden Sie drei 1 mL Spritzen mit 2 M NaCl, passen Sie jeweils mit einer Nadel und legen Sie sie beiseite.
  6. Die Barcode-Tröpfchen, Tagmented Genom Tröpfchen, zusammenführen und PCR Mischung mithilfe der doppelten Fusion-Gerät.
    Hinweis: Siehe Abbildung 5 für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz und Elektrode Buchten und Steckdose.
    1. Die 3 NaCl Spritzen an die 2 Elektrode Buchten und single Stadtgraben Inletusing Stücke von PE-Schlauch anschließen. Für die Elektroden Druck auf die Spritzen manuell bis die Elektroden vollständig mit Kochsalzlösung gefüllt sind. Nach dem Befüllen Druck die Elektroden manuell an der Wassergraben Spritze bis der Graben gefüllt ist. Stecken Sie das freie Ende des Grabens mit einem kleinen Stück von Bleilot.
    2. Schließen Sie die 3 HFE-Spritzen auf Pumpen 2 Abstandhalter öleinführungen und Dropmaking Öl Inletusing Stücke von PE Schlauch montiert. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen.
    3. Schließen Sie die PCR Mischung Spritze, Microgel sinkt Spritze und Barcode sinkt Spritze auf ihre jeweiligen Buchten mit PE-Schlauch. Schießen Sie alle Tröpfchen Reinjektion Schläuche mit einem antistatischen Pistole vor dem Anschluss an die Spritze Nadeln; die antistatische Behandlung verringert das Risiko von Tröpfchen Koaleszenz induziert durch statische Aufladungen auf den PE-Schlauch.
    4. Schließen Sie ein Stück PE-Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in ein 0,2 mL PCR-Tube.
    5. Verbinden Sie die Nadel der Spritze Elektrode mit einem Kaltkathoden Leuchtstofflampen Wechselrichter mit einer Krokodilklemme. Setzen Sie den Wechselrichter DC-Stromversorgung auf 2 V.
    6. Laufen die doppelte Fusion-Gerät mit der empfohlenen Volumenströme: 300 µL/h für die Tagmented Microgel Tropfen, 100 µL/h für die Barcode-Tropfen, 1500 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG (Dropmaking Öl), 600 µL/h für die Amplifikation mischen, 200 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG () Barcode-Abstandhalter-Öl), und 700 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG (Microgel Abstandhalter Öl). Sammeln Sie die Tropfen in PCR-Tubes mit etwa 50 µL der Emulsion in jedem Röhrchen.
  7. Entfernen Sie vor die Temperaturzyklen vorsichtig die untere Schicht der HFE-Öl aus der Emulsionen mit Gel-Loading pipettieren Tipps und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluorierten ölhaltigen ein 5 % w/w PFPE-PEG Tensid. Thermischen Zyklus mit das folgende Protokoll: 65 ° C für 5 min, 95 ° C für 2 min, 30 X (95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 72 ° C für 1 min), 72 ° C für 5 min, dann Halt bei 12 ° C.
  8. Erholen Sie der Barcode DNA von der thermischen Gefahren Tröpfchen.
    1. Die Tröpfchen zu einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln und die Emulsionen mit 20 µL des PFO zu brechen. Wirbel für 10 s zu mischen.
    2. Drehen Sie das Rohr auf 10.000 x g für 1 min um die Mischung in wässrigen (oben) und Öl (unten) Phasen fraktionieren. Sorgfältig Entfernen der oberen wässrigen Schicht aus der Tube mit einem pipettieren und überträgt es auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch. Verwerfen der Ölphase.
    3. Reinigen Sie das Barcode-PCR-Produkt in einer Spin-Spalte nach der Hersteller-Protokoll und in 20 µL 1 X TE-Puffer eluieren.
    4. Fahren Sie mit der durchgeführten Sequenzierung und Analyse nach Schritte 9 und 10.

9. Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung

  1. Vorbereiten der einzelligen Bibliothek für die Sequenzierung von der Hersteller-Protokolle für Fragment Größenauswahl und Quantifizierung.
  2. Reihenfolge der gepaart-End-Bibliothek mit Standard-Chemie für Lesen 1 und 2 lesen. Verwenden Sie den benutzerdefinierten Index 1 Primer I7_READ (Tabelle 2) für einen 15-bp-Index lesen, entsprechend des einzelligen Barcodes.

10. einzellige Datenanalyse

Hinweis: Benutzerdefinierte Python-Skripte zur Qualitätskontrolle und vorläufige Analyse der SiC-Seq-Daten können von https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq heruntergeladen werden.

  1. Führen Sie das Skript "barcodeCleanup.py" um Qualitätskontrolle auf der Barcodes liest und die Single-Cell-Daten in eine SQLite-Datenbank exportieren. Für ein kontrollexperiment, verwenden Sie dieses Skript mit der "-ausrichten" flag gesetzt, der liest mit bekannten Referenz Genomen auszurichten.
  2. Analysieren Sie die Reinheit der Barcode-Gruppen (für ein kontrollexperiment) mit dem Skript "purity.py" und bestätigen Sie die hohe Reinheit Werte entsprechen Abbildung 6 b.

Representative Results

Die SiC-Seq experimentelle Workflow enthält 3 PDMS mikrofluidischen Geräten hergestellt, mit einem weichen Lithographie-Verfahren (Abbildung 1). Eine Co-Flow-Dropmaker (Abbildung 3A) erzeugt 25 µm von digitalen Barcode Tröpfchen für die Kennzeichnung von genomischen DNS mit einer eindeutigen Kennung der einzelligen. Die Barcode-Oligonukleotide bestehen aus einer 15 bp Entartete Abfolge flankiert von PCR-Griffe für Verstärkung (Tabelle 2, BAR-Primer). Die Barcodes werden verdünnt, um eine femtomolare Konzentration der Einzelmolekül-Kapselung zu erreichen und alle Tröpfchen erhalten entweder 0 oder 1 Barcode FCP. Die Tröpfchen mit einem Barcode werden verstärkt, viele Kopien der Doppelstrang-Barcode Amplifikate nachgeben. Ein Nukleinsäure-Fleck wird verwendet, um die erfolgreiche Verstärkung zu überprüfen und zu quantifizieren die Kapselung Rate der Barcode-Fragmente (Abbildung 4 b). Die mikrogele entstehen durch Co fließt eine Bakterienzelle Federung und einem geschmolzenen Agarosegel bei gleicher Flussraten (Abbildung 2A). Die Agarose wird in zweimal die gewünschte Endkonzentration, vorbereitet, wie die Co-Flow Dropmaking Prozess effektiv die wässrigen Lösungen um den Faktor 2 verdünnt. Da die Agarose abkühlt, erstarrt es in eine 25 µm Durchmesser Microgel besetzen die kugelförmigen Volumen des tropfenabscheiders.

Eine Reihe von Wasch- und Lyse Schritten reinigt den hohe Molekulargewicht genomischen DNA in mikrogele (Abb. 2 b). Nach dem Bruch der Emulsionen, wässrige Waschungen erfolgt in großen Mengen, Spur organische Lösungsmittel verdünnen die nachgelagerten enzymatischen Behandlungen hemmen können. Die gewaschenen mikrogele werden unter dem Mikroskop zu überprüfen, die Zelle Kapselung Rate (Abb. 4A) beobachtet. Ein Cocktail von Enzymen mit breiten lytische Aktivität ergänzt die Microgel Aussetzung, die Zellwände der Bakterien und Eukaryoten Mikroben19zu verdauen. Eine zweite Behandlung mit Proteinase K und Reinigungsmittel die Proteine abbaut und zellenrückstand solubilisiert.

Tagmentation der gereinigte DNA erfolgt in Tropfen, um potenzielle infolge der Diffusion von kleinen Tagmented DNA-Fragmente zwischen mikrogele18Kreuzkontamination zu vermeiden. Ein Tröpfchen Kapselung Gerät (Abb. 3 b) teilt jedem mikrogel mit einem Puffer und Tagmentation Enzym, welches gleichzeitig doppelsträngige DNA Fragmente während auch "tagging" es mit einer vorinstallierten Oligonukleotid-20. Die mikrogele werden in die Tröpfchen als dicht an dicht Partikel erreichen Kapselung Preise nähert sich 1 Microgel für jeden Tropfen mit einigen Dubletten21 (Abbildung 4) geladen.

Im letzten Schritt des mikrofluidischen Workflows (Abbildung 2) führt ein Gerät einen doppelten Fusion Vorgang 1 Barcode-Tropfen, 1 Microgel-haltigen Tropfen und die Verstärkung Mischung in zwei kontrollierten Schritten kombinieren. Erstens ist ein Tröpfchen mit PCR Reagenz gepaart und mit einem Barcode-Tropfen in der Region erscheinen in gelb (Abbildung 5) zusammengeführt. Salzwassersee Elektroden in der Mikrofluidik-Kanal erzeugen einen hohen elektrischen Feld Farbverlauf, der Tröpfchen Fusion auslöst. In ähnlicher Weise ist das erste zusammengeführte Tröpfchen gepaart mit einem Microgel Tröpfchen und ein zweites Mal in der Region erscheinen in rot zusammengeführt. Die Tröpfchen werden gesammelt und thermischen Gefahren-Chip in einer Single-Überlappung Verlängerung (SOE) PCR. Die überlappenden komplementäre Enden des Barcodes und die Tagmented genomischer DNA ermöglichen Fusion und exponentielle Amplifikation nur richtig Barcode Konstrukte.

Die Sequenzierungsdaten zuerst gefiltert durch eine Lesen Sie Qualität und dann durch die Gruppierung der liest laut ihrer 15-bp einzellige Barcode-Sequenz analysiert. Für eine Barcode-Gruppe als gültig betrachtet werden sollte es eine Mindestanzahl von liest enthalten; Diese Schwellwerte schränkt die Analyse auf Zellen mit eine sinnvolle Menge an Sequenzierungsdaten und den PCR mutiert Barcode "Waisen" aus dem Dataset entfernt. In diesem Beispiel ausführen, befindet sich das Minimum auf 7,5 kbit/s pro Gruppe (50 mal gelesen von 150 bp jedes). Ein Histogramm der Barcode Grafen gegen die Größe der Gruppe zeigt, dass ein erheblicher Teil der gültigen Barcode Gruppen oberhalb der Schwellengröße (Abbildung 6A).

In einem kontrollexperiment, wo die mikrobiellen Gemeinschaft Zusammensetzung bekannt ist, werden die Reinheit und die relative Häufigkeit Metriken zur Bewertung der Qualität einer SiC-Seq laufen. Hier ist eine synthetische 10-Zelle-Gemeinschaft bestehend aus 3 gram-negativen Bakterien, 5 gram-positiven Bakterien und Hefen 2 analysiert. Die Reinheit einer bestimmten Barcode-Gruppe ist definiert als die Anzahl der Lesevorgänge, die Zuordnung zu den häufigsten Genom in der Gruppe geteilt durch die Gesamtzahl der Lesevorgänge in der Gruppe. Die überwiegende Mehrheit der Barcode-Gruppen haben Reinheiten größer 0,95 (Abb. 6 b). Relative Häufigkeit der Zelltypen wird berechnet durch zählen der rohen liest und zählen die Barcode-Gruppen, wo die Gruppen einen Zellentyp entspricht dem Konsens von seiner Mitglied liest (Abbildung 6) zugeordnet sind. Die Fülle der Lese- und Barcode-Gruppen verfolgen in etwa zu gleichen Teilen, darauf hinweist, dass die Zell-Populationen abgetastet wird werden, so dass bestimmte Arten nicht in Gruppen unverhältnismäßig klein oder groß Barcode enthalten sind. Plotten der aggregierten Abdeckung aller Barcode-Gruppen aus einer einzigen Spezies zeigt eine hohe Abdeckung über das gesamte Genom, mit wenigen oder keinen ausfallende Regionen (Abbildung 7). Die Einheitlichkeit der Abdeckung mit einer Häufigkeitsverteilung der normalisierten Flächendeckungswerte, mit die meisten Werte um den Mittelwert zentriert überprüft werden kann (Abbildung 7, inset).

Figure 1
Abbildung 1 : Herstellung von mikrofluidischen Geräten durch Photolithographie. (A) Master Formen mit einer einzigen Funktion Höhe werden von Spin coating eine Schicht von SU-8 Photoresist auf einem Silizium-Wafer hergestellt. Der Fotolack ist dann eine Photolithographische Maske mit UV-Licht, Vernetzung der exponierten SU-8 gemustert. Schließlich ist in einem Entwickler-Bad Uncrosslinked SU-8 aufgelöst. Die resultierende Form wird verwendet, um PDMS zu werfen, das auf einen Objektträger zu produzieren das komplette mikrofluidischen Gerät verbunden ist. (B) für eine Doppelschicht-Gerät beginnt die Herstellung ähnlich mit Spin Coating und Belichtung Schritte. Diese Schritte werden dann wiederholt, ein zwei-Schicht-Gerät erstellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Überblick über die SiC-Seq-Workflow. (A) A mikrobielle Federung ist Co floss mit geschmolzenen Agarose in einem Dropmaker Gerät Einzelzellen in mikrogele zu kapseln. (B) die mikrogele unterliegen einer Reihe von Waschungen, die bakterielle genomische DNA zu reinigen. Lytischen Enzyme verdauen die Zellwände von gram-positiven Bakterien und Hefen und Waschmittel solubilisiert der zelltrümmer. Die mikrogele sind neu gekapselt in Tröpfchen für die Tagmentation, Cross-Kontamination zu reduzieren. (C) der mikrofluidischen Fusion vereint digitale PCR Barcode, ein Tagmented Microgel Genom und eine Verstärkung-Mischung mit einer Rate > 1 kHz. Off-Chip SOE-PCR Spleiße einen einzigartigen einzellige Barcode auf das Tagmented Genom und selektiv verstärkt voll Barcode Konstrukte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Mikrofluidische Geräte für Dropmaking und Microgel Re Kapselung. (A) dieses Panel zeigt eine Co-Flow-Dropmaker (25 µm Funktion Höhe). Zellen und flüssige Agarose werden in das Gerät bei gleicher Flussraten bis 25 µm Tröpfchen an einer 25 µm X 25 µm Kreuzung produzieren vorgestellt. Für die digitalen Barcode-Dropmaking der zelleneinströmungsöffnung angeschlossen ist, und eine PCR-Mischung wird in der Agarose-Einlass eingeführt. (B) dieses Panel zeigt ein Microgel Re Kapselung Gerät (25 µm Funktion Höhe). Die mikrogele fließen in einen trichterförmigen Einlass zu erhalten, ihre dicht an dicht bestellen und erhalten ein Volumen von Tagmentation Mischung vor die erneute Einkapselung an einer 25 µm X 30-µm-Kreuzung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Mikrographen Tröpfchen und mikrogele. (A) dieses Panel zeigt 25 µm mikrogele vor enzymatische Lyse gewaschen. Die Bakterien sind für die Quantifizierung der Kapselung Rate fluoreszent gefärbt. Poisson laden Statistiken zu diktieren, dass die Zellen gekapselte mit einer Rate von 1 in 10 Tropfen oder weniger um die Häufigkeit der Multiple-Kapselung Ereignisse zu minimieren. (B) zeigt dieses Panel eine Fluoreszenz Mikroskopie 25 µm digitalen Barcode Tröpfchen mit einer Nukleinsäure-beize behandelt. Die Tröpfchen mit verstärkten Barcode Fragmente erzeugen eine starke Fluoreszenz-Signal. (C) zeigt dieses Panel mikrogele wieder in 50 µm Tropfen gekapselt. Die schließen-Verpackung von der mikrogele ermöglicht eine Kapselung Preise nähert sich 1 Gel pro Tropfen mit einigen Dubletten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Mikrofluidischen double Fusion Gerät für einzellige Genom Barcoding. Eine zweistufige Fusion Operation Paare Barcode Tröpfchen mit Tagmented Genome bei hohem Durchsatz. Ein Tropfen des PCR-Mixes zuerst erzeugt und mit einem Barcode-Tröpfchen in der Region erscheinen in gelb mit Salzwasser Elektroden zusammengeführt. Als nächstes ist ein Tröpfchen mit einem Microgel eingeführt und ein zweites Mal in der Region erscheinen in rot zusammengeführt. Öleinführungen ermöglichen präzise Kontrolle über den Abstand zwischen den reinjected Tröpfchen. Der Barcode Reinjektion Kammer und seine Abstandhalter Öl befinden sich auf der kürzeren 25 µm Schicht blau schattiert. Alle anderen Gerätefunktionen gehören zu den dickeren Schicht mit 45 µm Gesamthöhe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Barcode Gruppe Metriken für ein 10-Zelle synthetische mikrobiellen Gemeinschaft. (A) dieses Panel zeigt die Verteilung des Barcodes Gruppengrößen. Die Anzahl der Gruppen einer bestimmten Größe sinkt exponentiell steigender Größe Gruppe. Eine Mindestgrenze von 7,5 kbit/s pro Gruppe begrenzt die Analyse zu Gruppen mit einer ausreichenden Menge an Informationen und entfernt die PCR mutiert Sequenz "Waisen." (B) dieses Panel zeigt die Verteilung der Barcode Gruppe Reinheiten. Die überwiegende Mehrheit (> 90 %) der Gruppen sind von sehr hoher Reinheit (> 95 %). (C) dieser Bereich zeigt die relative Häufigkeit von 10 Arten berechnet auf Konzernebene Lese- und Barcode. Die 2 zählen Methoden produzieren ähnliche Ergebnisse, darauf hinweist, dass der Barcode Gruppengrößen über Artgrenzen konsistent sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Aggregieren genomischen Abdeckung der Bacillus subtilis Barcode Gruppen. Das liest der Barcode Gruppen zuordnen, das Bakterium B. Subtilis (N = 9.398) gebündelt werden und in ihrer Gesamtheit analysiert. Eine kreisförmige Versorgungskarte zeigt die Abdeckung Einheitlichkeit des SiC-Seq lautet, mit keine beobachtbaren Dropout-Regionen. Eine gestrichelte Linie um den Umfang zeigt die durchschnittliche Reichweite (5.55 X). Der Einschub-Histogramm der relative Abdeckung Frequenzen zeigt, dass ein Großteil der Basen fallen in eine Tiefe in der Nähe der Genom-weiten Durchschnitt durch die gestrichelte Linie dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Gerät 1. Layerhöhe (µm) 1. Schicht Spin Drehzahl (u/min) 2. Layerhöhe (µm) 2. Schicht Spin Drehzahl (u/min)
Co-Flow dropmaker 25 4000 N/A N/A
Re Gel encapsulator 25 4000 N/A N/A
Doppelte Fusion 25 4000 20 5000

Tabelle 1: Herstellung Geräteparameter mikrofluidischen. Diese Tabelle zeigt eine Auflistung der mikrofluidischen Geräte in der SiC-Seq-Workflow mit ihren erforderlichen Geschwindigkeiten für Fotolack Spin coating (basierend auf den Angaben des Herstellers für SU-8 3025) verwendet.

Label Sequenz (5' > 3')
BAR GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabelle 2: Primer Sequenzen.

Ergänzende Datei 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 2: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Die SiC-Seq mikrofluidischen Workflow produziert einzellige Genom-Sequenzierungsdaten von Tausenden von Bakterienzellen. Digitalen Barcodes gespleißt auf die Genome der Microgel-gekapselte Zellen ermöglichen die in Silico Dekonvolution NGS Daten in Gruppen von Barcodes liest aus derselben Zelle. Ein kontrollexperiment mit einer mikrobiellen Gemeinschaft von bekannter Zusammensetzung ist notwendig für die Beurteilung der Reinheit der Barcode-Gruppen. Ein großer Teil der Low-Reinheit Gruppen zeigt, dass die Zelle Kapselung Rate zu hoch ist oder gibt es erhebliche Tröpfchen Cross-Kontamination während der mikrofluidischen Verarbeitungsschritte auftreten. Poisson Statistiken zufolge sollte die Barcodes und Zellen in einem Ziel-Verhältnis von 1 Teilchen für jeden 10 Tropfen, die Rate der mehrere Kapselung Ereignisse auf weniger als 5 % von allen nicht-leere Tröpfchen zu begrenzen gekapselt werden. Eine Kapselung-Rate höher als dies steigt die Preise von Dubletten exponentiell, so ist die Überprüfung der Kapselung Verhältnis während des Dropmaking-Prozesses von entscheidender Bedeutung. Nutzer sollten die Kapselung von mehreren Zellen in eine einzelne Microgel besonders vorsichtig sein, da liest aus verschiedenen Zellen teilen die gleiche Barcode-Sequenz Bioinformatically getrennt werden können. Im Fall, dass 1 Zelle erhält 2 verschiedene Barcodes, die Barcode-Gruppe-Reinheit ist nicht betroffen, obwohl die Fülle Metriken verzerrt werden, wenn durch Barcode-Sequenz zählen.

Droplet Cross-Kontamination auch durch suboptimale Fusion Bedingungen entstehen können. Bei einer erfolgreichen Operation kann mikrofluidischen Fusion Gerät (Abbildung 5) kontrollierbar 1 Barcode-Tropfen mit 1 Microgel und einem Volumen von PCR-Reagenz koppeln. Non-Ideal Flussraten führt ein Tröpfchen Paarung bei falschen Verhältnisse: 1 Barcode könnte zum Beispiel mit 2 mikrogele gekoppelt werden. Alle Durchflussmengen im Protokoll aufgeführten sollen Schätzungen und können je nach geringfügige Abweichungen in der Geometrie und Tröpfchen Gerätegrößen angepasst werden müssen. Benutzer mit Zugriff auf Kameras mit High-Speed-Aufnahme-Funktionen (> 10.000 Bilder/s) sollten die richtigen Tropfen Fusion zu Beginn und im Laufe der Operation mikrofluidischen überprüfen. Benutzer ohne Zugriff auf eine High-Speed-Kamera ein kleines Volumen der zusammengeführten Ausgabe sammeln und manuell messen die tröpfchengrößen unter dem Mikroskop. Die Tröpfchengröße sollte einheitlich sein: ein Übermaß an individuellen Barcodes oder Microgel Tropfen zeigt an, dass die Reinjektion entsprechend gesenkt werden sollte.

Mehrere werden allgemeine Vorkehrungen beim Umgang mit mikrogele und Microdroplets, ihre Integrität zu bewahren. Mikrogele, muss obwohl mechanisch robust, ausreichend vor den Bruch und Waschschritte dafür vollständig Gelierung gekühlt werden. Non-sphärische mikrogele sind ein Indiz, das die Agarose nicht ausreichend Zeit gegeben, zu festigen. Beim Waschen mikrogele spin-down die Suspensionen mit der erforderlichen Geschwindigkeit um ein Produkt zu vermeiden. Agarose Hydrogel hat einen Brechungsindex genau passend, das Wasser und kann schwierig sein, in ein Rohr22, zu sehen, so dass Benutzer die Gel-Liquid-Grenze vor Aspiration sorgfältig identifizieren sollte. Wasser-in-Öl-Tropfen sind anfällig für Koaleszenz durch den Aufbau von statischen Kräfte23 Labor Handschuhe und Schläuche. Aus diesem Grund empfehlen wir laden die Tröpfchen Reinjektion Spritzen mit bloßen Händen und behandeln die Reinjektion Linien mit einem Anti-Statik-Pistole vor die Pumpe ansaugen. Zusammengeführte große Tröpfchen können entfernt werden, durch langsam rotierende die Emulsionen in einer Spritze und manuell Absaugen von großen Tropfen, die in der Nähe der Spitze aufgrund ihrer größeren Auftrieb zu sammeln.

SiC-Seq ist die erste Technologie nachzuweisen einzellige Genomsequenzierung von > 50.000 Bakterienzellen. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile im Durchsatz über bestehende Ansätze und ermöglicht eine tiefere Probenahme von heterogenen mikrobieller Gemeinschaften. Bisher haben mikrofluidischen Technologien für einzellige Genom-Sequenzierung Microchambers9 und Mikrovertiefungen24 für Zelle Isolation und Verstärkung, aber mit Durchsätzen im Bereich von nur Dutzende bis Hunderte von Zellen eingesetzt. Der Fluss sortieren einzelner Zellen in Wellplates5,6 erfordert keine spezielle mikrofluidischen Instrumentation aber besitzt einen ähnlich geringen Durchsatz. Da die Boden- und Wasserproben aus der Umgebung häufig alpha Unterschiede haben > 1.000 auf die Spezies Stufe25,26, SiC-Seq ist ein großer Vorteil aufgrund seiner Fähigkeit, eine weit größere Anzahl von Organismen zu probieren. Die SiC-Seq-Workflow ist anpassungsfähig auf Zelle Eingaben von Laborkultur, die natürliche Umwelt oder eine lebende Host. Eine Zellprobe muss nur in einer wässrigen Suspension und frei von großen Partikeln (> 10 µm) für mikrofluidischen Kapselung geeignet. Beispielsweise wurde die Methode bereits zu einer Probe von Meerwasser mit Hilfe einer Reihe von Waschanlagen und Filterung Schritte aus, um die Zellen vor der Kapselung17Vorverarbeiten angewendet.

Die SiC-Seq-Protokoll generiert eine relativ spärliche Sequenzierung Datenmenge aus jeder einzelnen Zelle und möglicherweise nicht für alle Anwendungen geeignet. Einige Bioinformatik-Algorithmen wie de Novo Genom Montage oder Einzel-Nukleotid-Variante (SNV) aufrufen erfordern höhere Abdeckung tiefen, effektiv zu arbeiten. Stattdessen können Barcode Gruppen gruppierten in Silico taxonomische binning Methoden27 sein, so dass Algorithmen auf größere Sätze liest angewendet werden können. Die relativ niedrige Barcoding Gesamteffizienz der SiC-Seq-Workflow kann auch in Fällen Herausforderungen denen die Verfügbarkeit der eingabesample niedrig ist. SiC-Seq basiert auf einer Poisson-verteilten Barcode Kapselung Schritt, daher etwa 10 % der Zellen erhalten einen molekularen Barcode und werden während der abschließenden Bibliothek Vorbereitungsschritt verstärkt. Zwar ist dies vergleichbar mit anderen Microdroplet-basierte Barcode Systeme10, Benutzer arbeiten mit kostbaren Zellproben haben Schwierigkeiten, die die entsprechende Bibliothek Ausbeute für die Sequenzierung zu erreichen und möglicherweise müssen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen im Finale zu erhöhen Verstärkung Schritt. Eine andere mögliche Lösung für Benutzer mit mikrofluidischen Expertise ist es, positive Barcode Tröpfchen Sortieren nach dem digitalen PCR Schritt, womit sich den Gesamtwirkungsgrad Barcoding auf > 85 %28.

Eine mögliche zukünftige Richtung für SiC-Seq-Technologie wird den Workflow für die Verwendung mit Säugerzellen, ebnet den Weg für neue klinische Studien der einzelligen angepasst. Als Beispiel, eine Analyse der die Kopie Nummer Unterschiede zwischen den einzelnen Krebs Zellen Mai unser Verständnis der Rolle der Heterogenität in Krebs Pathologie2weiter. Alternativ würde die Integration von SiC-Seq mit vorhandenen Methoden zur Sonde und DNA-Sequenzen von Interesse29 bereichern die gezielte einzellige Sequenzierung von Subpopulationen oder seltene Sorten von Zellen ermöglichen. Mit Umweltproben könnten Gene innerhalb einer bekannten Stoffwechselweg gezielt und Kontextuell neben benachbarte Gene zur Identifizierung neuartiger genomischer Inseln analysiert werden. Von innerhalb einer menschlichen Host-Umgebung, niedrige Titer Pathogene Bakterien Proben isoliert werden konnte und sequenziert einzellige Ebene mehr untersuchen eng ihre genotypischen Ursprünge der Virulenz.

Disclosures

Patente im Zusammenhang mit diesem Workflow wird vielleicht an Mission Bio, von welchen Adam R. Abate lizenziert ein Aktionär.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation durch den CAREER Award (Grant-Nummer DBI-1253293); die National Institute of Health (NIH) (Zuschuss Zahlen HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); und das Defense Advanced Research Projekte Agentur Leben Gießereien Programm (Vertragsnummern HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biotechnik Ausgabe 135 Mikrofluidik Microdroplets einzellige Genomics Metagenomik Next Generation Sequencing Molekulare barcoding
Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung
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Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

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