Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Encellede sekvensering avslører genotypic heterogenitet i biologiske systemer, men dagens teknologi mangler gjennomstrømningen nødvendig for dyp profilering av samfunnet komposisjon og funksjon. Her beskriver vi en microfluidic arbeidsflyt for sekvensering > 50.000 encellede genomer fra ulike celle populasjoner.

Abstract

Sekvensering teknologi har gjennomgått et paradigmeskifte fra bulk encellede oppløsning svar til en økende forståelse av rollen av mobilnettet heterogenitet i biologiske systemer. Imidlertid vært encellede sekvensering av store befolkningsgrupper hemmet av begrensninger i behandlingen genomer for sekvenser. I dette papiret beskriver vi en metode for enkeltceller genomet sekvensering (SiC-seq) som bruker dråpe microfluidics å isolere, forsterke og strekkode genomer i enkeltceller. Celle-innkapsling i microgels tillater compartmentalized rensing og tagmentation av DNA, mens microfluidic sammenslåing effektivt par hver genomet med en unik encellede oligonucleotide strekkode, slik at > 50.000 enkeltceller som ble sekvensert per kjørt. Sekvensering dataene er demultiplexed av strekkode, generere grupper av lyder fra enkeltceller. Som en høy gjennomstrømming og lav-bias encellede sekvensering gir SiC-seq et bredere spekter av genomisk studier rettet mot ulike celle populasjoner.

Introduction

Genomet fungerer som en blåkopi av mobilnettet identitet og funksjonen, som inneholder helheten av en organisme er koding potensial. En forståelse av mobilnettet biologi på genomet nivå kan forklare observerte fenotypiske mangfoldet i ulike celle populasjoner. Denne heterogene i biologiske systemer og har brede implikasjoner for helse og sykdom. For eksempel er genet kopi nummer variasjoner blant kreftceller knyttet til utvikling og spredning av kreft1,2. Bakterielle infeksjoner, virusets øyene i en brøkdel av genomer kan overføres horisontalt og fører til spredning av antibiotika-resistente bakterier3,4. En primær utfordring studere genomer på encellede nivå er lavt antall DNA tilgjengelig, samt behovet for å analysere tusenvis av celler for å prøve hele mangfoldet av genotyper. For disse grunner, har begrensninger i eksperimentell gjennomstrømming hindret effektiviteten av encellede studier, biasing resultatene mot de rikeste cellene. Encellede isolasjon teknikker som flyt sortering5,6, optisk pinsett7, forankring i bulk gels8og microfluidics9 kan der hundrevis av celler for sekvensering; men er dette bare en liten brøkdel av de fleste prøver. En metode for enkeltceller genomet sekvensering med betydelig høyere gjennomstrømming ville tillate dypere og mer komplett profilering av celle populasjoner, og dermed Klargjørende rollen genotypic mangfold innenfor disse samfunnene.

Slippverktøy microfluidics gir høy gjennomstrømming manipulering av celler og biologiske reagenser i millioner av picoliter skala reaktorer. Hittil har microdroplet technologies har blitt brukt til å studere differensial uttrykk mønstre blant celler fra heterogen vev10,11,12, dypt sekvens lang molekyler13,14 ,15, og gjennomføre chromatin immunoprecipitation sekvenser (ChiP-seq) analyser på enkeltceller16. Faktisk er microdroplets i stand til høy gjennomstrømning og compartmentalized operasjoner, gjøre dem mottakelig for programmer i én celle genomics. Utviklingen av denne teknologien presenterer sin egen unike teknologiske utfordringer, imidlertid. Cellene må være lysed, renset, og forsterket med minimal skjevhet, jevnt utvalg celle populasjoner. I motsetning til polyadenylated mRNA transkripsjoner i pattedyrceller er det ingen sammenlignbare molekylær motiv i genomet til rette erobringen av nukleinsyre mål. For disse grunner, har encellede genomet sekvensering vært vanskelig å gjennomføre microdroplet plattformer.

I dette arbeidet gir vi en detaljert protokoll i vår tidligere rapportert encellede microfluidic tilnærming kan sekvensering genomer titusenvis av celler i en enkelt eksperiment17. Med denne teknologien, kalt SiC-seq, bakterielle celler er innkapslet i mikron skala hydrogels og individuelt lysed, tagmented, og sammen med en microdroplet som inneholder en unik oligonucleotide strekkode, som er skjøtes på cellens genomisk DNA via en enkelt overlapping forlengelsen polymerasekjedereaksjons (PCR). Hydrogels tjene som isolert beholdere som høy-molekylvekt genomisk DNA sterically sitter, slik at mindre molekyler som vaskemidler og lytisk enzymer tilgang og rense før barcoding18. Denne protokollen behandler > 50.000 enkeltceller i løpet av timer, noe som resulterer i et barcoded bibliotek klar for sekvenser. Etter sekvensering er lest demultiplexed i henhold til deres encellede strekkode sekvensen, som resulterer i et dataset består av millioner av lyder, hver med en mobilnettet indeks.

Protocol

1. Microfluidic apparat fabrikasjon

  1. Forberede microfluidic maske design med dataassistert konstruksjon (CAD) programvare (leveres som. DWG; se Utfyllende filer). Har disse design trykt av leverandøren med 10 µm oppløsning på en krets bord film.
    Merk: For flerlags microfluidic enheter inneholder tilsvarende maskene justering merker.
  2. For hver enhet, dikte SU-8 master mold (figur 1A) som følger.
    1. Forberede en 3 - i diameter silisium wafer ved å helle ca 1 mL av SU-8 3025 photoresist på midten av kjeks. Sikre kjeks på spin coater chuck ved å bruke sugekraft.
    2. Se tabell 1 for en liste over lag tykkelser og spinne hastigheter for hver enhet. For alle enheter, starte spinn belegget med 30 s på 500 rpm, etterfulgt av 30 s angitt hastighet.
    3. Fjerne SU-8-silisium kjeks fra spinn coater og myk bake den på en kokeplate satt til 135 ° C i 30 min. tillate kjeks avkjøles til romtemperatur etter bakervarer.
    4. Utsett SU-8-silisium kjeks med riktig microfluidic masken under en collimated 190-mW, 365-nm UV LED i 3 minutter.
    5. Etter eksponering, hardt bake kjeks på en kokeplate satt til 135 ° C i 1 minutt. Etter dette bakervarer trinnet at kjeks avkjøles til romtemperatur.
    6. For ett lag microfluidic enheter, går du til trinn 1.2.7. For en multi-lagdelt microfluidic enhet, gjentar du trinn 1.2.1 - 1.2.5 for andre lag av photoresist (figur 1B).
    7. Etter første vanskelig bake for en enkelt enhet (eller andre harde bake for en multi-lagdelt enhet), utvikle kjeks ved å leve det i et badekar med propylenglykol monomethyl Eter acetate (PGMEA) i 30 min.
    8. Etter kjekss utvikling, bruk en sprøyting flasken inneholder PGMEA skylle kjeks. Skyll kjeks med en sprøyting flasken med isopropanol før du plasserer den på en 135 ° C kokeplate for 1 min tørke.
    9. Plass kjeks (heretter referert til som master) i en Petriskål av casting med polydimethylsiloxane (PDMS).
  3. Med master i trinn 1.2, fortsette å utføre apparat fabrikasjon med en PDMS avstøpning.
    1. Forbered PDMS ved å kombinere en silikon base med en herding agent i en 11:1-forhold av masse. Bland silikon base og herding agent for hånd med en røre pinne.
    2. Degas i PDMS ved å plassere den i en avgassing kammer og bruke et vakuum. Tillate PDMS å degas til luftbobler vises ikke lenger (vanligvis 30 min).
    3. Hell forsiktig degassed PDMS over Herre, å endelig PDMS lag tykkelse på ca 5 mm. Degas PDMS igjen å sikre fjerning av eventuelle luftbobler.
    4. Etter avgassing, bake PDMS og master ved 80 ° C i 80 min..
    5. Nøye avgiftsdirektoratet herdet PDMS skive fra bakt master med et barberblad. Kontroller at alle kutt er på silisium kjeks.
      Merk: Noen kutt laget av silisium kjeks kan resultere i en lip hindrer en enhetlig bånd.
    6. Punch inn- og utløp med en 0,75 mm biopsi punch. Fjern alle støv og spredt PDMS bruke emballasje bånd på funksjonen side av enheten.
    7. Før plasma behandling av enheten, rengjør en 50 x 75 mm glass lysbilde ved å skylle den med isopropanol og tørk den.
    8. For plasma behandling, plassere PDMS plate og glass lysbildet inn i plasma-bonder med funksjonene grossist. Utføre plasma behandling med 1 mbar O2 plasma for 1 min. Bond enheten til glasset lysbilde ved å bringe den utsatte eller bildesiden vises sidene sammen.
    9. Etter behandlingen plasma bake enheten på 80 ° C i 40 minutter.
    10. Til slutt, injisere glass overflatebehandling væske i en av de sundene gjengi microfluidic kanalene hydrofobe. Kontroller alle kanaler helt oversvømmet med løsningen og gjenta injeksjon for hver dropmaker. Stek behandlet enheten ved 80 ° C i 10 min å fordampe overflødig løsemiddel.

2. innkapsling av celler i Agarose Microgels

Merk: Se figur 2A.

  1. Forberede 1 mL av 3% w/v lav-smeltende temperaturen agarose i 1 x Tris-EDTA (TE) buffer. Hold agarose løsningen på 90 ° C varme blokk til umiddelbart før sprøyten lasting.
  2. Forberede celle suspensjon.
    Merk: Denne protokollen og dens tilknyttede microfluidic enheter har validert for å arbeide med bakterielle celler, enten fra en frossen aksje eller frisk forberedelse. Pattedyrceller, avhengig celle, krever en justering av microfluidic kanal dimensjonene til de større celle Str.
    1. Resuspend cellene i 1 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS).
    2. Telle celler i en hemocytometer eller ved flyt sortering. For 25 µm microgels med en målet cellen innkapsling rate av 1 av 10, forberede 1 mL av cellen suspensjon i en siste konsentrasjon av 2.4 x 107 celler/mL.
    3. Nedspinning cellene 3000 x g for 3 min. leveringstanken nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av 17% v/v tetthet gradert medium (se Tabell for materiale) i PBS. Hold det på is inntil sprøyte lasting.
  3. Laste inn en 3-mL sprøyte med fluorholdige olje (HFE) som inneholder en 2% w/w perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant, passer det med en 27 G nål og legg den i en sprøytepumpe.
    Merk: Passer alle sprøyter med en 27 G nål for microfluidic trinn i denne protokollen. For å redusere risikoen for utilsiktet pricking, holde caps på alle pinner før pumpen operasjonen starter.
  4. Laste inn celle suspensjon og smeltet agarose i 1-mL sprøyter, passer begge med 27-gauge nåler og plassere disse i sprøyten pumper.
  5. Hold agarose sprøyten og pumpe varm med en liten plass ovn for å hindre at agarose gelling i sprøyten og vik rør. Angi plass ovnen til høy, og plasser den slik at oppvarming er ca 10 cm fra sprøyten. Kontroller at temperaturen målt på sprøyten er ca 80 ° C.
    Merk: Brukere anbefales å opprettholde ovnen på anbefalt avstand og pumping apparater å redusere risikoen for skade på utstyret, inkludert smelting av slangen.
  6. Generere 25 µm mikrogel drops bruker co flyt dropmaking enheten.
    Merk: Se figur 3A for en enheten som angir plasseringen av reagensen inn- og utløp.
    1. Koble sprøyte nåler til de microfluidic enheten viker med stk polyetylen rør. Før du setter rør inn i enheten, prime pumper for å fjerne luft fra linjen.
    2. Koble et stykke rør til stikkontakten og sted gratis slutten i en 15 mL samling rør.
    3. Bruk de følgende (anbefales) strømningshastigheter for dropmaking: 800 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne; 200 µL/t for cellen suspensjon i PBS; og 200 µL/t for 3% w/v-agarose.
  7. Etter dropmaking, sett samling røret på 4 ° C i 30 min å sikre det fullstendig gelation av agarose.

3. bryte og vask Agarose-Microgels

  1. Fjerne det nederste laget olje fra samlingen røret ved hjelp av en 3 mL sprøyte med en 20 G nål, ta vare ikke for å forstyrre det øverste laget av agarose-dråper.
  2. Bryte emulgatorer med perfluorooctanol (PFO).
    1. Legge til 1 mL av 10% v/v PFO i HFE agarose dråper. Pipetter denne løsningen opp og ned for 1 min til grundig coat emulgatorer.
      Merk: For alle mikrogel vask trinn, Pipetter løsninger med 1000 µL tips. Mikrogel suspensjon vises homogen og uten klumper etter pipettering det.
    2. Spinne konisk røret 2000 x g for 1 min å samle agarose microgels. Fjerne PFO/HFE nedbryting av aspirasjon; microgels er nå gratis surfactant lag og vises klar.
  3. Vask microgels med en surfactant i Heksan.
    FORSIKTIG: Heksan er en flyktige organiske løsemidler vask i trinn 3.3 bør gjennomføres på avtrekksvifte.
    1. Legge til 2 mL 1% v/v sorbitan monooleate ikke-ionisert surfactant (se Tabell for materiale) i Heksan til agarose microgels. Pipetter opp og ned 10 x å blande, sikre komplett oppløsningen av mikrogel pellets.
    2. Spinne røret på 1000 x g for 1 min å samle microgels. Sug opp nedbryting for å fjerne surfactant/Heksan løsningen.
    3. Gjenta surfactant/Heksan vask.
  4. Legg til microgels i en vandig buffer fjerne gjenværende organiske løsemidler.
    1. Legge til 5 mL av TET buffer [0,1% v/v octylphenol ethoxylate ikke-ionisert vaskemiddel (se Tabell for materiale) i 1 x TE] til konisk røret. Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    2. Spinne konisk røret 2000 x g i 2 minutter å samle microgels. Sug opp nedbryting for å fjerne TET bufferen.
    3. Gjenta TET vask 2 x.
    4. Legge til 5 mL 1 x TE bufferen til konisk røret. Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    5. Spinne konisk røret 2000 x g i 2 minutter å samle microgels. Sug opp nedbryting for å fjerne TE bufferen.
    6. Gjenta TE vask.
  5. Kontrollerer celle innkapsling i microgels under et mikroskop på en 400 X forstørrelse av flekker en 10 µL aliquot gelé med 1 x nukleinsyre flekker (se Tabell for materiale).
    Merk: Microgels vises klart under gjennomsiktig kanalen mens celle DNA vil fluoresce under GFP kanalen (497/520 nm eksitasjon/utslipp bølgelengder). En overlapping av gjennomsiktig og fluorescerende vises cellene i microgels som vist i figur 4A.

4. lysis av celler i Agarose via lytisk enzymer

  1. Forberede 1 mL av en lytisk enzym cocktail med 800 µL av TE buffer (1 x), 2 µL av gjær lytisk enzym (5 U/µL lager, 10 U/mL siste), 30 µL av dithiothreitol (1 M lager, 30 mM endelige) 60 mg av lysozyme (lyofiliserte pulveret), 15 µL av EDTA (0,5 M lager 7,5 mM endelige), 2 µL av mutanolysin (100 U/µL lager, 200 U/mL siste), 2 µL av lysostaphin (10 U/µL lager, 20 U/mL endelige) og 30 µL av NaCl (1 M lager, 30 mM endelige).
  2. Legge til ekstra TE å bringe volumet til 1 mL. Bland løsningen ved vortexing.
  3. Legg det hele 1 mL av lytisk enzym løsningen til mer enn 1 mL av vasket microgels. Bland ved pipettering 10 x. Inkuber blandingen ved 37 ° C i > 2t i en shaker (maksimum er overnatting inkubasjon).

5. vaskemiddel-baserte mikrogel behandling

  1. Etter lysis via lytisk enzymer (trinn 4), vask microgels.
    1. Nedspinning microgels 2000 x g i 2 minutter og Sug opp nedbryting. Dråpene vises ugjennomsiktig hvit på grunn av celle rusk spredt i pellet.
    2. Resuspend microgels i 5 mL 10 mM Tris-HCl buffer og Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    3. Nedspinning blandingen 2000 x g i 2 minutter, deretter fjerne nedbryting av aspirasjon.
  2. Utfør en vaskemiddel behandling av microgels.
    1. Resuspend geléer i lyseringsbuffer en litium dodecyl sulfate (lokk) (0,5% w/v lokk i 20 mM Tris-HCl) og 60 µL av 0,5 M EDTA til et endelig antall 3 mL.
    2. Legge til 5 µL av en proteinasen K enzym (800 U/mL stock). Pipetter opp og ned 10 x å blande, ruge deretter blandingen på 42 ° C på varme blokk 1t solubilize cellemembraner og fordøye proteiner.
  3. Etter vaskemiddel behandling, vask microgels.
    1. Nedspinning konisk røret med microgels 2000 x g i 2 min. Fjern nedbryting av aspirasjon.
    2. Vask microgels med 10 mL 2% v/v polysorbat 20 i vann. Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    3. Nedspinning konisk røret 2000 x g i 2 minutter, deretter fjerne nedbryting av aspirasjon.
    4. Vask microgels med 10 mL av 100% etanol å deaktivere alle gjenværende enzym. Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    5. Nedspinning konisk røret 2000 x g i 2 minutter, deretter fjerne nedbryting av aspirasjon.
    6. Vask microgels med 10 mL 0.02% v/v polysorbat 20 i vann. Pipetter opp og ned 10 x å blande.
    7. Nedspinning konisk røret 2000 x g i 2 minutter, deretter fjerne nedbryting av aspirasjon.
    8. Gjenta polysorbat 20 vask 3 x. Løsningen passere en 100 µm celle sil før siste vask fjerne eventuelle store klumper.
  4. Resuspend microgels i 5 mL 10 mM Tris-HCl buffer for å hindre DNA nedbrytning. Microgels lagres på 4 ° C i opptil 1 uke før tagmentation (trinn 7).

6. generere strekkode dråper av digitale PCR

  1. Forberede en 500-pM lager av BAR primer (tabell 2) i en 1 x TE buffer i en lav-binde rør. Før bruk, fortynne primeren en arbeider lager av 1 pM og varme den til 70 ° C for 1 min på varme blokk.
  2. Forberede en 150-µL PCR reaksjonen blanding med 75 µL av høy kvalitet varmt start blande (se Tabell for materiale) (2 x), 42 µL av PCR-grade vann, 3 µL av DNA_BAR primer (10 µM lager, 0,2 µM siste), 3 µL av P7_BAR primer (10 µM lager 0,2 µM siste), 6 µL av strekkoden fortynning (1 pM lager, 40 fM siste), 6 µL av polysorbat 20 (50% v/v lager, 2% endelige) og 15 µL av PEG 6 k (50% w/v lager, 5% siste). Bland ved pipettering opp og ned 10 x.
  3. Forberede en HFE-støttet sprøyten ved 200 µL av HFE olje i en sprøyte og passer det med en nål. Knytte en del av PE rør til nålen og prime linjen for hånd. Slutten av PE slangen inn målet løsningen og nøye trekke alle 150 µL av PCR blandingen i PE rør og sprøyten. Legg sprøyten i en sprøytepumpe.
  4. Laste inn en 1 mL sprøyte med fluorholdige olje (HFE) med en 2% w/w perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant, passer det med en nål og legg den i en sprøytepumpe.
  5. Generere 25 µm strekkode drops bruker co flyt dropmaking enheten.
    Merk: Se figur 3A for en enheten som angir plasseringen av reagensen inn- og utløp.
    1. Koble celler mengden av en co flyt dropmaker enhet med en liten bit av bly loddetråd.
    2. Koble sprøyter lastet med HFE og PCR bland til de microfluidic enheten viker med biter av PE rør, Smeltet Agarose mengden i strekkoden PCR blanding. Før du setter rør inn i enheten, prime pumper for å fjerne luft fra linjen.
    3. Koble et stykke rør til stikkontakten og sted gratis slutten i en 0,2 mL PCR rør. Bruk de følgende (anbefales) strømningshastigheter for dropmaking: 600 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne og 200 µL/h for PCR blanding. Samle dråper i PCR rør med ca 50 µL dråper i hver retning.
  6. Etter dropmaking, Fjern forsiktig det nederste laget HFE olje fra emulgatorer bruke gel-lasting Pipetter tips og erstatte den med FC-40 fluorholdige olje som inneholder en 5% w/w PFPE-pinne surfactant. Termisk syklus med følgende protokollen: 98 ° C i 3 minutter, 40 x (98 ° C for 10 s, 62 ° C for 20 s, 72 ° C for 20 s), 72 ° C i 5 minutter, og hold deretter på 12 ° C.
    Merk: Termisk-syklet dråpene lagres på 4 ° C for opptil 1 dag.
  7. Kontroller strekkode forsterkning og innkapsling hastigheten.
    1. Forberede en 1 x nukleinsyre stain (se Tabell for materiale) i HFE med en 2% w/w PFPE-pinne surfactant; flekken er marginalt blandbar i HFE og vil binde til DNA i dråpene.
    2. Legge til 1 µL av termisk-syklet strekkode emulsjon 10 µL av flekker. Inkuber dem i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Bilde dråper av fluorescerende mikroskopi (GFP kanal, 497/520 nm eksitasjon/utslipp bølgelengder) på en 200 X forstørrelse og telle strekkode innkapsling hastigheten. Vær oppmerksom på at signalet blir diskret: dråpestørrelse inneholder forsterket strekkoder vil fluoresce lyst, mens tomme dråper vises mørk (figur 4B).

7. Tagmentation genomisk DNA dråper

Merk: Se figur 2B.

  1. Forberede 500 µL tagmentation løsning bruker reagenser fra en neste generasjons sekvensering biblioteket forberedelse kit (se Tabell for materiale). Bruke 7 µL av tagmentation enzym, 250 µL tagmentation bufferen og 243 µL PCR-grade vann. Bland dem ved vortexing og Nedspinning blandingen for å samle. Legg denne løsningen i en HFE olje-støttet 1 mL sprøyte og passer det med en nål.
  2. Forberede microgels reinjeksjon.
    1. Nedspinning mikrogel røret i 2 minutter på 2000 x g og Sug opp nedbryting. Overføre 200 µL gelé til toppen av en HFE-støttet sprøyte med gel-lasting Pipetter tips og forsegle munnstykket med et lite stykke tape.
    2. Med en 3D-trykt sentrifuge adapter (se ekstra filer 1 og 2), spin mikrogel sprøyten for 3 min 3000 x g.
    3. Fjern flytende nedbryting fra sprøyten ved hjelp av en gel-lasting Pipetter tips. Skyv mikrogel laget til bunnen av sprøyte munnstykket. Passe sprøyten med en nål.
  3. Laste inn en 3 mL sprøyte med fluorholdige olje (HFE) med en 2% w/w perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant, passer det med en nål og legg den i en sprøytepumpe.
  4. Nytt innkapsle microgels i dråpestørrelse inneholder tagmentation reagenser.
    Merk: Se figur 3B for en enheten som angir plasseringen av reagensen inn- og utløp.
    1. Koble sprøyter som inneholder HFE, tagmentation mix og microgels til de microfluidic enheten viker med stk PE rør. Før du setter rør inn i enheten, prime pumper for å fjerne luft fra linjen.
    2. Koble et stykke rør til stikkontakten og plassere gratis slutten i et tomt 1-mL sprøyte med stempelet trukket til 1 mL linjen.
    3. Bruk de følgende (anbefales) strømningshastigheter for dropmaking: 2000 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne, 200 µL/t for microgels og 500 µL/t for tagmentation blanding.
  5. Kontroller mikrogel innkapsling hastigheten under lys mikroskop på en 400 X forstørrelse. Ca 80-90% av dråper bør inneholde en mikrogel, som vist i figur 4C.
  6. Passer sprøyten som inneholder tagmentation emulgatorer med en nål og ruge det oppreist i varme blokk eller ovnen i 1 time ved 55 ° C fragmentere genomisk DNA.

8. encellede Barcoding av Microfluidic dobbel fusjon

Merk: Se figur 2C.

  1. Forberede strekkode dråpene sammenslåingen ved å erstatte FC-40 olje brøken med HFE 2% w/w PFPE-pinne. Nøye overføre disse drops til 1 mL sprøyte, passer det med en nål og legg den i en sprøytepumpe.
  2. Legg inkubert og tagmented mikrogel slippverktøy sprøyten i en sprøytepumpe.
  3. Forberede 500 µL PCR mix. Legge til reagenser i følgende rekkefølge for å hindre precipitates dannes: 140 µL av PCR-grade vann, 10 µL av P5_DNA primer (10 µM lager, 0,2 µM siste), 10 µL av P7_BAR primer (10 µM lager, 0,2 µM siste), 50 µL av PEG 6k (50% w/v lager 5% siste), 50 µL av polysorbat 20 (50% v/v lager, 5% siste), 250 µL Taq Master mix (2 x) (se Tabell for materiale), 10 µL av isotermiske utvalg (se Tabell for materiale), og 10 µL nøytralisering bufferen (se Tabell for materiale). Bland dem av pipettering opp og ned 10 x og Nedspinning blandingen for å samle det. Legg denne løsningen i en HFE-støttet 1-mL sprøyte, passer det med en nål og legg den i en sprøytepumpe.
  4. Last tre 3-mL sprøyter med fluorholdige olje (HFE) med en 2% w/w perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant, passer med en nål og plassere dem i sprøyten pumper.
  5. Laste inn tre 1 mL sprøyter med 2 M NaCl, passer med en nål og sett dem til side.
  6. Flette strekkode dråper, tagmented genomet dråper, og PCR bland med dobbel fusjonen enhet.
    Merk: Se figur 5 for en enheten som angir plasseringen av reagens og elektroden inn- og utløp.
    1. Koble 3 NaCl sprøyter til 2 elektrode viker og enkelt vollgrav inletusing stk PE rør. For elektrodene, gjelde trykket sprøyter manuelt til elektrodene er helt fylt med saltløsning. Etter utfyllingen gjelder elektroder, manuell trykk vollgrav sprøyten til vollgraven fylles. Plugg den gratis enden av vollgraven med en liten bit av bly loddetråd.
    2. Koble 3 HFE sprøyter montert på pumper til 2 spacer olje viker og dropmaking olje inletusing stk PE rør. Før du setter rør inn i enheten, prime pumper for å fjerne luft fra linjen.
    3. Koble PCR blanding sprøyten, mikrogel drops sprøyten og strekkode faller sprøyten til deres respektive viker med PE rør. Skyte alle slippverktøy reinjeksjon rør med en antistatisk pistol før du kobler dem til sprøyte nåler; antistatiske behandling reduserer risikoen for slippverktøy Koalesens av statisk elektrisitet på PE slangen.
    4. Koble et stykke PE rør til stikkontakten og sted gratis slutten i en 0,2 mL PCR rør.
    5. Koble nålen av elektrode til en kald katode fluoreserende inverter med en alligator klipp. Angi inverter's likestrøm til 2 V.
    6. Kjør dobbel fusjonen med anbefalte flyt priser: 300 µL/t for tagmented mikrogel dråper, 100 µL/t for strekkode dråper, 1500 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne (dropmaking olje), 600 µL/t for forsterkning blande, 200 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne ( strekkode spacer olje), og 700 µL/t for HFE 2% w/w PFPE-pinne (mikrogel spacer olje). Samle dråper i PCR rør med ca 50 µL av emulsjon i hver retning.
  7. Før termisk sykling, forsiktig fjerne det nederste laget HFE olje fra emulgatorer bruke gel-lasting Pipetter tips og erstatte dem med FC-40 fluorholdige olje som inneholder en 5% w/w PFPE-pinne surfactant. Termisk syklus med følgende protokollen: 65 ° C i 5 min, 95 ° C i 2 minutter, 30 x (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min), 72 ° C i 5 min, så hold på 12 ° C.
  8. Gjenopprette barcoded DNA fra de termiske-syklet dråpene.
    1. Pool av dråper i et microcentrifuge rør og bryte emulgatorer bruker 20 µL av PFO. Vortex dem for 10 s å blande.
    2. Spinne røret på 10.000 x g for 1 min å smuldre vekk blandingen i vandig (øverst) og olje (nederst) faser. Nøye fjerne øvre vandig laget fra røret med en Pipetter og overføre den til en ny microcentrifuge tube. Kast olje fasen.
    3. Rense barcoded PCR produktet i en spinn kolonne i henhold til produsentens protokollen og elute det i 20 µL 1 x TE bufferen.
    4. Fortsett til utføres sekvensering og analyse per trinn 9 og 10.

9. biblioteket forberedelse og sekvensering

  1. Forberede encellede biblioteket sekvensering ved å følge produsentens protokoller for fragment størrelse-valg og kvantifisering.
  2. Sekvens sammen-end biblioteket med standard kjemi for Les 1 og Les 2. Bruke egendefinerte indeks 1 primer I7_READ (tabell 2) for en 15-bp indeks lese, tilsvarer én celle strekkoden.

10. encellede dataanalyse

Merk: Egendefinert Python-skript for kvalitetskontroll og foreløpig analyse av SiC-seq data kan lastes ned fra https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Kjør skriptet "barcodeCleanup.py" for å utføre kvalitetskontroll på den barcoded lest og eksportere encellede dataene til en SQLite database. For en kontroll eksperiment, kan du bruke dette skriptet med den "-justere" flagget justere lest til kjente referansen genomer.
  2. Analysere renheten av strekkoden grupper (for en kontroll eksperiment) bruker skriptet "purity.py" og Bekreft høy renhetsgrad verdiene samsvarer med figur 6B.

Representative Results

SiC-seq eksperimentelle arbeidsflyten inneholder 3 PDMS microfluidic enheter fabrikasjon benytter en myk litografi prosedyre (figur 1). En co flyt dropmaker (figur 3A) genererer 25 µm til digital strekkode dråper for merking genomisk DNA med en unik ID, én celle. Strekkode-oligonucleotides består av en 15 bp degenerert sekvens flankert av PCR håndtak for forsterkning (tabell 2, BAR primer). Strekkodene er utvannet til en femtomolar konsentrasjon å oppnå enkelt-molekylet innkapsling, og alle dråper motta enten 0 eller 1 strekkode fragment(s). Dråpestørrelse inneholder en strekkode er forsterket, gir mange eksemplarer av double-strandet strekkode amplicons. En nukleinsyre flekk brukes til å bekrefte vellykket forsterkning og kvantifisere innkapsling frekvensen av strekkoden fragmenter (figur 4B). Microgels genereres av co flyter en bakteriell celle suspensjon og en smeltet agarose gel lik strømningshastigheter (figur 2A). Agarose er forberedt på to ganger ønsket endelige konsentrasjonen, som co flyt dropmaking prosessen effektivt utvanner de vandige løsningene med en faktor på 2. Som agarose kjøler, størkner det i en 25 µm diameter mikrogel opptar sfærisk volumet av slippverktøyet.

En rekke vask og lyseringsbufferen trinn renser høy-molekylvekt genomisk DNA i microgels (figur 2B). Etter å ha brutt emulgatorer, utføres vandig vasker i store mengder for å fortynne ut spor organiske løsemidler som kan hemme nedstrøms enzymatisk behandlinger. De vasket microgels er observert under et mikroskop kontrollere innkapsling cellehastighet (figur 4A). En cocktail av enzymer med bred lytisk aktivitet legges til mikrogel suspensjon å fordøye cellen vegger av bakterier og eukaryotic mikrober19. En andre behandling med proteinasen K og vaskemiddel forringer proteiner og solubilizes celle rusk.

Tagmentation av renset DNA utføres i dråper å unngå potensielle kryssforurensning skyldes spredningen av små tagmented DNA fragmenter mellom microgels18. En dråpe innkapsling enhet (figur 3B) compartmentalizes hver mikrogel med en buffer og tagmentation enzym, som samtidig fragmenter double-strandet DNA mens også "merking" det med en forhåndsinstallert oligonucleotide20. Microgels er lastet inn dråpene som tett-pakket partikler, oppnå innkapsling priser nærmer seg 1 mikrogel for hver dråpe med noen doublets21 (figur 4C).

I siste trinn i microfluidic arbeidsflyten (figur 2C) utfører en enhet en dobbel fusjonen operasjon kombinerer 1 strekkode dråpe, 1 mikrogel inneholder drop og forsterkning blandingen i en kontrollert prosess. Først er et slippverktøy som inneholder PCR reagens tilkoblet og slått sammen med en strekkode nedgang i regionen vises i gule (figur 5). Saltvann elektrodene i mikrovæskekanalen produsere høy elektrisk felt gradering som utløser slippverktøy fusjonen. På en lignende måte, er første flettede slippverktøyet sammen med et mikrogel slippverktøy og slått sammen en gang i regionen vises i rødt. Dråpene er samlet og termisk syklet av sjetonger i en enkelt-overlapping utvidelse (SOE) PCR. De overlappende komplementære endene av strekkoden og tagmented genomisk DNA tillate fusion og eksponentiell forsterkning av bare riktig barcoded konstruksjoner.

Sekvensering dataene først filtrert av en Les kvalitet og deretter analyseres av gruppering leser etter den 15-bp encellede strekkode-sekvensen. For en strekkode gruppe skal være gyldig, bør den inneholde et minimum antall leser; Denne terskelverdi begrenser analyse til celler med en nyttig datamengde sekvensering og fjerner PCR-mutert strekkoden "foreldreløse" fra datasettet. Dette eksemplet kjører minimum er satt til 7,5 kbps per gruppe (50 leser av 150 bp hver). Et histogram strekkode som teller mot gruppestørrelsen viser at en betydelig del av gyldig strekkode gruppene er like over terskelstørrelsen (figur 6A).

I en kontroll eksperiment der mikrobielle samfunn sammensetningen er kjent, brukes renhet og relative overflod beregninger til å vurdere kvaliteten på en SiC-seq kjøre. Her, er en syntetisk 10-celle fellesskap bestående av 3 gram-negative bakterier, 5 gram-positive bakteriene og 2 gjær analysert. Renheten av en gitt strekkode-gruppe defineres som antall leser tilordning til vanligste genomet i gruppen delt på totalt antall lesninger i gruppen. De aller fleste av strekkoden grupper har purities større enn 0,95 (figur 6B). Relative overflod celletyper beregnes ved å telle den rå lest og ved å telle strekkode grupper, hvor gruppene tilordnes en celle type svarer til konsensus av sin medlem (figur 6C). Overflod av leser og strekkode grupper spor i omtrent like forhold, som angir at celle populasjoner som samples slik at enkelte arter ikke finnes i strekkode for uforholdsmessig små eller store grupper. Plotting samlet dekning av alle strekkode grupper fra én art angir en høy dekning over hele genomet, med få eller ingen frafall områder (figur 7). Sıtt dekning kan bekreftes med en frekvens distribusjon av normalisert dekning verdier, med de fleste verdier sentrert rundt gjennomsnittet (figur 7innfelt).

Figure 1
Figur 1 : Fabrikasjon av microfluidic enheter av klima og jordsmonn. (A) Master formene med en enkel funksjon høyde er fabrikkert av spin belegg et lag av SU-8 photoresist på en silicon wafer. Photoresist er deretter mønstret med photolithographic maske og UV-lys, crosslinking eksponert SU-8. Endelig oppløses uncrosslinked SU-8 i en utvikler bad. Resulterende mold brukes å kaste PDMS som er limt til et glass lysbilde å produsere komplett microfluidic enheten. (B) For tolags utstyr fabrikasjon tilsvarende begynner med spin belegg og eksponering trinn. Disse trinnene er så gjentok opprette en to-lags enhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over SiC-seq arbeidsflyten. (A) A mikrobiell suspensjon er co strømmet med smeltet agarose i en dropmaker enhet å kapsle enkeltceller i microgels. (B) i microgels er utsatt for en rekke vasker å rense bakteriell genomisk DNA. Lytisk enzymer fordøye cellen vegger av gram-positive bakterier og gjær og vaskemiddel solubilizes mobilnettet rusk. Microgels er nytt innkapslet i dråper for tagmentation å redusere kryssforurensning. (C) microfluidic fusjonen kombinerer en digital PCR-strekkode, en tagmented mikrogel genomet og en forsterkning blanding med en hastighet > 1 kHz. Av-chip SOE PCR splint en unik encellede strekkode på tagmented genomet og forsterker selektivt fullt barcoded konstruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Microfluidic enheter for dropmaking og mikrogel re innkapsling. (A) dette panelet viser en co flyt dropmaker (25 µm funksjonen høyde). Celler og smeltet agarose blir introdusert inn i apparat på likt strømningshastigheter å produsere 25 µm dråper på en 25 µm x 25 µm junction. Digital strekkode-dropmaking celle mengden er koblet og en PCR blanding er introdusert i agarose mengden. (B) dette panelet viser en mikrogel re innkapsling enhet (25 µm funksjonen høyde). Microgels flyte inn i en trakt-formede vik å opprettholde deres tett-pakket bestiller og mottar en tagmentation blanding før re innkapsling på en 25 µm x 30 µm junction. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Micrographs dråper og microgels. (A) dette panelet viser vasket 25 µm microgels før enzymatisk lysis. Bakterier er fluorescently farget for kvantifisering av innkapsling rate. Poisson lasting statistikken tilsier at cellene skal være innkapslet med en hastighet på 1 av 10 dråper eller mindre å redusere frekvensen av flere-innkapsling hendelser. (B) dette panelet viser et fluorescens mikroskopi bilde av 25 µm digital strekkode dråper behandlet med en nukleinsyre flekk. Dråpestørrelse inneholder forsterket strekkode fragmenter produserer en sterk fluorescens signal. (C) dette panelet viser microgels re innkapslet i 50 µm drops. Lukk-pakking av microgels muliggjør innkapsling priser nærmer seg 1 gel per slipp med noen doublets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Microfluidic dobbel fusjonen enhet for enkeltceller genomet barcoding. En to-trinns fusjonen operasjon parene strekkode dråper med tagmented genomer på en høy gjennomstrømming. En dråpe PCR blanding første genereres og slått sammen med en strekkode dråpe i regionen vises i gule med saltvann elektroder. Deretter er et slippverktøy som inneholder en mikrogel innført og slått sammen en gang i regionen vises i rødt. Olje viker tillater presis kontroll av avstanden mellom reinjisert dråpene. Strekkode reinjeksjon kammeret og spacer olje er plassert på kortere 25 µm laget, skyggelagt med blått. Alle andre enhetsfunksjoner tilhører tykkere laget med 45 µm total høyde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Strekkode gruppe beregninger for en 10-celle syntetiske mikrobielle samfunn. (A) dette panelet viser fordelingen av strekkoden gruppe størrelser. Antall grupper i en gitt størrelse reduseres eksponentielt som gruppe størrelse øker. En laveste terskelen på 7,5 kbps per gruppe begrenser analyse til grupper med en tilstrekkelig mengde informasjon og fjerner PCR-mutert sekvensen "foreldreløse". (B) dette panelet viser fordelingen av strekkoden gruppe purities. De aller fleste (> 90%) av grupper er svært høy renhetsgrad (> 95%). (C) dette panelet viser den relative overfloden av 10 arter beregnet på gruppenivå lese og strekkode. 2 teller metoder gir samme resultat, indikerer at strekkoden gruppe størrelsene er konsekvent på tvers av arter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Samlet genomisk dekning av Bacillus subtilis Strekkode grupper. Lest fra alle strekkode gruppene tilordning til bakterien B. subtilis (N = 9,398) er samlet og analysert samlet. En sirkulær dekningskart illustrerer dekning sıtt SiC-seq-leser, med ingen observerbare dropout regioner. En stiplet linje rundt omkretsen angir gjennomsnittlig dekning (5.55 x). Innfelt histogrammet av relativ dekning frekvenser viser at hoveddelen av baser er dekket dyp nær genomet hele gjennomsnittet, representert ved den stiplede linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Enheten 1 lag høyde (µm) 1 lag Spin hastighet (rpm) 2 lag høyde (µm) 2 lag Spin hastighet (rpm)
Co flyt dropmaker 25 4000 I/T I/T
Gel re encapsulator 25 4000 I/T I/T
Dobbel fusjon 25 4000 20 5000

Tabell 1: Microfluidic enhetsparametrene fabrikasjon. Denne tabellen viser en liste over microfluidic-enheter brukes SiC-seq arbeidsflyten med deres nødvendig hastigheter for photoresist spinn belegg (basert på produsentens spesifikasjoner for SU-8 3025).

Etikett Sekvens (5' > 3')
BAR GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabell 2: Primer sekvenser.

Ekstra fil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra filen 2: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

SiC-seq microfluidic arbeidsflyten produserer encellede genom sekvensering data fra tusenvis av bakterielle celler. Digital strekkoder skjøtes på genomer mikrogel-innkapslet celler tillate i sili deconvolution NGS data i grupper av barcoded stammer fra samme celle. En kontroll eksperimentere med et mikrobielle samfunn av kjente komposisjon er nødvendig for å vurdere renheten av strekkoden gruppene. En stor andel av lav-renhet grupper angir at celle innkapsling frekvensen er for høy eller at det er betydelig slippverktøy kryss-kontaminering oppstår under microfluidic behandlingstrinnene. Ifølge Poisson bør de strekkoder og være innkapslet i målet forholdet 1 partikkel for hver 10 dråper begrense frekvensen av flere innkapsling hendelser mindre enn 5% av alle ikke-tom dråper. En innkapsling hastighet høyere enn dette øker satsene for doublets eksponentielt, så verifisering av innkapsling forhold under dropmaking prosessen er av avgjørende betydning. Brukere bør være spesielt forsiktig med innkapsling av flere celler i en enkelt mikrogel fordi leseoperasjoner fra forskjellige celler deler samme strekkode sekvens ikke kan være bioinformatically atskilt. I tilfelle 1 cellen mottar 2 forskjellige strekkoder, strekkode gruppe renhet er upåvirket selv om overflod beregningene er skjev ved telling av strekkoden sekvens.

Slippverktøy kryssforurensning kan også oppstå på grunn av suboptimal fusjonen. Under en vellykket operasjon, kan microfluidic fusjonen enheten (figur 5) controllably koble 1 strekkode dråpestørrelse med 1 mikrogel og en mengde PCR reagens. Ikke-ideelle strømningshastigheter vil resultere i en dråpe sammenkobling på feil forholdstall: 1 strekkode kan være forbundet med 2 microgels, for eksempel. Alle flyt priser oppført i protokollen er ment å være estimater og må justeres avhengig av små variasjoner i enheten geometri og slippverktøy størrelser. Brukere med tilgang til kameraer med høyhastighets-opptak evner (> 10 000 bilder/s) bør kontrollere riktig slippverktøy fusjonen i begynnelsen og i løpet av microfluidic operasjonen. Brukere uten tilgang til et høyhastighets kamera kan samle en liten mengde flettede utdata og manuelt måle slippverktøy størrelser under et mikroskop. Dråpestørrelse bør være ensartet: et overskudd av uflettede strekkoder eller mikrogel drops angir at reinjeksjon prisene skal reduseres tilsvarende.

Flere generelle forholdsregler bør tas ved håndtering av microgels og microdroplets å bevare sin integritet. Microgels, må om mekanisk robust, være tilstrekkelig avkjølt før bryte og vaske trinn for å sikre fullstendig gelation. Non-sfærisk microgels er en indikasjon at agarose ikke var gitt tilstrekkelig tid til å stivne. Når du vasker microgels Nedspinning av suspensjon av nødvendig hastighet å unngå tap av produktet. Agarose hydrogel har en brytningsindeks stemmer godt overens med vann og kan være vanskelig å se i en tube22, så brukerne bør nøye identifisere gel-flytende grensen før aspirasjon. Vann-i-olje dråper er mottakelige for Koalesens av oppbyggingen av statisk styrker23 på laboratoriet hansker og rør. Derfor anbefaler vi lasting slippverktøy reinjeksjon sprøyter med nakne hender og behandle alle reinjeksjon linjene med en antistatisk pistol før pumpen grunning. Store coalesced dråper kan fjernes ved sakte roterende emulgatorer i en sprøyte og manuelt aspirating større dråper, som akkumulerer øverst på grunn av deres større høy styrke.

SiC-seq er den første teknologien å demonstrere encellede genomet sekvensering av > 50.000 bakterielle celler. Denne plattformen tilbyr betydelige fordeler i gjennomstrømming over eksisterende tilnærminger og gir et dypere utvalg av heterogene mikrobielle samfunn. Hittil har microfluidic teknologier for enkeltceller genomet sekvensering ansatt microchambers9 og microwells24 for cellen aisolering og forsterkning, men med stykklistenøyaktighet i området bare titalls til hundrevis av celler. Flyt sorteringen av enkeltceller i wellplates5,6 krever ingen spesialisert microfluidic instrumentering men har tilsvarende lav overføringshastighet. Gitt at jord og vann prøver fra miljøet har vanligvis alfa forskjeller i > 1000 på arten nivå25,26, SiC-seq er svært fordelaktig i kraft av sin evne til å smake et langt større antall organismer. SiC-seq arbeidsflyten er tilpasningsdyktig til celle innganger laboratorium kulturen, naturen eller et levende vert. En celle prøve trenger bare være i en vandig suspensjon og uten store partikler (> 10 µm) å være egnet for microfluidic innkapsling. For eksempel er metoden tidligere brukt et utvalg av sjøvann ved hjelp av en rekke vask og filtrering for å forhåndsbehandle cellene før innkapsling17.

SiC-seq protokollen genererer en relativt sparsom mengde sekvensering data fra hver enkelt celle og kan ikke være egnet for alle programmer. Noen bioinformatikk algoritmer som de novo genomet montering eller single nukleotid variant (SNV) ringer krever høyere dekning dypet å arbeide effektivt. I stedet kan strekkode grupper være gruppert i sili av taksonomisk binning metoder27 slik at algoritmer kan brukes på større sett leser. Relativt lav barcoding virkningsgraden i SiC-seq arbeidsflyten kan også presentere utfordringer i tilfeller der tilgjengeligheten av inn prøven er lav. SiC-seq avhenger litt Poisson-distribuert strekkode innkapsling, derfor ca 10% av cellene mottar en molekylær strekkode og er forsterket i løpet av det siste bibliotek forberedelse skrittet. Mens dette kan sammenlignes med andre microdroplet-baserte barcoding ordninger10, brukere som arbeider med dyrebare celle prøver kan ha problemer med å oppnå tilstrekkelig biblioteket avkastningen for sekvensering og må øke antall PCR sykluser i finalen forsterkning trinn. En annen mulig løsning for brukernes med microfluidic kompetanse er å sortere positiv strekkode dråper etter digital PCR trinn, dermed å barcoding virkningsgraden > 85%28.

En potensiell fremtidig retning for SiC-seq teknologi er tilpasse arbeidsflyten for bruk med pattedyrceller, banet vei for nye kliniske encellede studier. Som et eksempel, en analyse av kopi nummer variasjon blant enkelt kreft celler kan ytterligere vår forståelse av rollen av heterogenitet i kreft patologi2. Også ville integrere SiC-seq eksisterende metoder for å undersøke og berike DNA-sekvenser av interesse29 aktivere den målrettede encellede sekvensering av subpopulasjoner eller sjeldne stammer av celler. Med miljøprøver, kan gener fra i en kjent stoffskiftebane være målrettet og analysert innholdsrettede sammen med nabokommunene gener for å identifisere romanen genomic øyene. Fra innenfor et menneske vert miljø, lav-titer patogene bakterier prøver kan isoleres og sekvensielt på encellede nivå undersøke mer tett deres genotypic opprinnelsen til virulens.

Disclosures

Patenter vedrørende denne arbeidsflyten kan være er lisensiert til oppdraget Bio, av hvilke Adam R. Abate en aksjonær.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gjennom en CAREER-pris (bevilgning nummer DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (grant tall HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); og Defense Advanced prosjekter byrå bor støperier forskningsprogrammet (kontrakt nummer HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Bioteknologi problemet 135 Microfluidics microdroplets encellede genomics metagenomics neste generasjons sekvensering molekylær barcoding
En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter