Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule pour la médecine régénérative et une plate-forme pour l’étude des processus de développement humains. Réalisé par étapes de différenciation qui récapitule les processus de développement est un des principaux moyens pour générer des cellules pancréatiques y compris pancréas/duodénum homéotique protéine 1+ (PDX1+) des cellules progénitrices pancréatiques. Les protocoles classiques initient la différenciation avec petites colonies peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes aux hétérogénéités, qui pourraient entraver la différenciation à PDX1+ cellules. Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules. Le protocole consiste en quatre étapes et initie la différenciation par ensemencement monocellules dissociées. L’induction de SOX17+ cellules de l’endoderme définitif a été suivie par l’expression des marqueurs de tube deux intestin primitif, HNF1β et HNF4α et différenciation éventuelle en PDX1+ cellules. Le présent protocole offre une manipulation facile et peut améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvés à se différencier de manière inefficace en lignées endodermiques ou PDX1+ cellules.
Introduction
Le pancréas se compose principalement de cellules exocrines et endocrines et son dysfonctionnement ou surcharge provoque plusieurs maladies comme la pancréatite, le diabète et le cancer du pancréas. Afin d’élucider la pathogénie de le pancreatopathy, il est nécessaire d’analyser le processus de développement et la fonction des cellules du pancréas. En outre, une alimentation de variétés de cellule stables avec qualité robuste est nécessaire pour établir la thérapie de supplémentation de cellules/tissus. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule à ces fins, et le protocole de différenciation vers les cellules du pancréas a été intensivement étudiée1,2,3, 4. Les progrès récents dans la production in vitro de cellules β pancréatiques imitent la génération des cellules β homme adulte et ces cellules voir la thérapeutique sur l’implantation dans les diabétiques modèle souris2,3. En outre, l’analyse des cellules β générés par la les cellules souches pluripotentes induites (CISP) de sain et de type 1 diabetes patients donateurs a révélé aucune différence fonctionnelle y compris quand il est sous tension5. En outre, phénotypes de la maladie ont été partiellement reproduites dans les cellules pancréatiques induites avec CISP dérivé de patient ou hPSCs hébergeant des mutations génétiques dans le même site que les patients6,7.
Pour générer des cellules pancréatiques de hPSCs, la différenciation dirigée par étapes qui récapitule les processus de développement est utilisée. Le pancréas est dérivé de la couche de l’endoderme de l’embryon précoce, qui exprime la région Y-box 17 (SOX17) de détermination du sexe et de forkhead box A2 (FOXA2)8. Se fondant sur les études sur les souris, la couche endoderme forme le tube de l’intestin primitif, qui se caractérise par l’expression du facteur nucléaire hépatocytaire 1 bêta (Hnf1β) et le facteur nucléaire hépatocytaire 4 alpha (Hnf4α). Le tube de l’intestin primitif s’allonge et se développe dans l’appareil respiratoire, digestif et des organes. Après l’allongement, la zone de l’intestin postérieur devient la région pancréatique présumée, comme marqué par l’expression de la protéine de boîte homéotique de pancréas/duodénum de facteur de transcription 1 (PDX1)8,9,10. Les parties ventrales et dorsales de le PDX1+ gut tube épaissir à bourgeons pancréatiques de forme, qui sont marqués par la co-expression de pancréas transcription factor 1 sous-unité alpha (PTF1A) et NK6 boîte homéotique 1 (NKX6.1)8,11. Cette expression marque le début morphologique de l’organogenèse du pancréas. Les cellules pancréatiques endoderme, qui sont des composants des bourgeons pancréatiques, forment un réseau tubulaire ramifié de structures épithéliales12 et finalement se différencient en cellules exocrines et endocrines, dont les cellules insulino-sécrétrices β et α-cellules qui sécrètent du glucagon. Expression de PDX1 est détectée tout d’abord à la région pancréatique présumée, qui est ensuite observée tout au long de tout le développement du pancréas et montre la localisation de cellules β et δ9,13,14. Bien que le Pdx1+ zone de cellule qui n’exprime pas Ptf1a ou Nkx6.1 se différencie dans l’antre gastrique, duodénum, biliaires extrahépatiques et certaines cellules de l’intestin au milieu d’un stade avancé du développement chez la souris9, PDX1+ les cellules sont considérés comme les ancêtres du pancréas aux premiers stades du développement chez l’homme.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules pour la génération des lignées du pancréas. La protocole initiés différenciation par ensemencement dissocié monocellules15,16,17. Généralement, hPSCs indifférenciées sont mémorisées dans des colonies ou des agrégats de cellules en suspension ou en adhérence. En conséquence, la plupart des protocoles initient la différenciation peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes à des hétérogénéités spatiales et transcriptionnelle18,19,20,21,22, qui pourrait entraver la première étape de différenciation vers endoderme définitif suivie de différenciation inefficace à PDX1+ cellules. Le présent protocole peut proposer un maniement facile pour améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvées pour différencier inefficacement de lignées endodermiques et PDX1+ cellules23, 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Expériences à l’aide de hPSCs ont été approuvées par le Comité d’éthique de la faculté de médecine et la Graduate School of Medicine, Université de Kyoto.
1. préparation des matériaux
Remarque : Préparer tous les milieux et réactifs pour culture de cellules dans un milieu stérile. Échauffement de base milieux de culture à la température ambiante (RT) avant utilisation. Médium pour la différenciation est utilisée moins de 6 h à RT. détails des réactifs sont répertoriés dans la Table des matières.
-
Différenciation (Figure 1 a)
- Milieu de phase 1 a : transfert milieu RPMI 1640 dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, activine A, CHIR99021 et Y-27632 à une concentration de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM et 10 μm, respectivement.
- Moyen de stade 1 b : transfert milieu RPMI 1640 dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, activine A et la CHIR99021 à une concentration de 100 ng/mL, 1 x, ≤ 1 μM, respectivement.
Remarque : La concentration de CHIR99021 doit être inférieure à celui de milieu de Stage de 1 a et addition n’est pas nécessaire, mais elle augmente le nombre de cellules. - Moyenne de l’étape 2 : médium de transfert amélioré MEM (iMEM) dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum et le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) à une concentration de 0,5 x et 50 ng/mL, respectivement.
- Moyenne de l’étape 3 : iMEM caloporteur dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, KGF, caboche, 3-céto-N-aminoéthyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) et l’acide 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) à la pipette concentrations de 0,5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM et 10 nM, respectivement.
-
Cytométrie en flux (FCM)
- 1 x tampon de perméabilisation/lavage : transvaser l’eau dans un tube par une pipette. Ajouter le tampon de perméabilisation/lavage par une pipette à une concentration de 1 x.
- FCM bloquant la solution : transférer 1 x tampon de perméabilisation/lavage dans un tube par une pipette. Ajouter sérum âne par une pipette à une concentration de 2 % (vol/vol).
-
Immunomarquage
- Bloquant la solution : Phosphate-Buffered Saline (SPD de transfert Dulbecco) dans un tube par une pipette. Ajouter sérum âne et Triton X en pipette à des concentrations de 5 % (vol/vol) et 0,4 % (vol/vol), respectivement.
2. hPSC différenciation de progéniteurs de cellules/pancréatique Foregut postérieur (PDX1 cellules+ )
Remarque : Effectuer toutes les procédures en utilisant des techniques stériles. hPSCs sont maintenus sur des plaques 6 puits recouvert d’un matériau synthétique pour hPSCs avec hPSC moyen d’entretien selon instructions17,26 les directives du fabricant. Lorsque les cellules atteignent 50-80 % confluence (stade 0) les utiliser pour différencier.
-
Préparer membrane basale matrice revêtu de plaques.
- 6 mL de milieu RPMI 1640 (4 °C) dans un tube de transfert refroidi à 4 °C sur la glace. Ajouter 2 mg de matrice de la membrane basale (4 °C) avec embouts de mL-pipette 1 refroidi et bien mélanger en douce de pipetage pour rendre la membrane basale 0,33 mg/mL dans une matrice.
- Transférer 2 mL de matrice de membrane de sous-sol dilué dans chaque puits de plaques de culture cellulaire 6 puits par une pipette. Placer les plaques à 37 °C pendant 60 à 90 min dans un incubateur. Par la suite, garder les plaques à ta jusqu'à utilisation (à moins de 3 h).
-
La hPSCs des graines et ouvrir la différenciation définitive endoderme (étape 1).
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (RT) de 0,5 mM / puits pour laver la hPSCs cultivées dans les plaques 6 puits à l’aide d’une pipette.
- Aspirer 0,5 mM EDTA et ajouter 2 mL d’EDTA 0,5 mM / puits en pipette. Incuber les plaques à 37 °C pendant 5 min.
- Aspirer 0,5 mM EDTA et ajouter 1 mL de milieu de maintenance hPSC à ta additionné de 10 μM Y-27632 par bien de pipette. Pipetter doucement mais rapidement à s’envoler des cellules attachées sur les plaques et de dissocier les cellules regroupées dans des cellules individuelles. Ne se propagent pas la suspension cellulaire pendant le pipetage.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger contenant 4 mL de milieu de maintenance hPSC à RT additionné de 10 μM 50 mL Y-27632. Pipetez doucement la suspension cellulaire.
- Compter le nombre de cellules dans la suspension de cellules à l’aide de la procédure d’exclusion de tache bleu Trypan.
- Mix 15 μl de suspension cellulaire et 15 μl de bleu Trypan dans un tube.
- Transférer 10 μL de la suspension cellulaire diluée avec le bleu Trypan vers la cellule de comptage des diapositives en double par une pipette de 10 μL.
- Compter la cellule numéro avec un compteur de cellule automatique et calcul de la densité cellulaire dans la suspension cellulaire. La viabilité est habituellement > 98 %.
- Aliquote la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 50 mL à 1-1. 5 x 106 cellules / puits de 6 plats (1-1. 5 x 105 cellules/cm2).
- Centrifuger le tube de 50 mL à 200 x g à RT pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension les cellules avec 1 mL de milieu de Stage 1 a (RT) par puits. Doucement, la suspension cellulaire, déposer et ajouter un autre 1 mL de milieu de Stage 1 a (total, 2 mL par puits).
- Aspirer la matrice de la membrane de sous-sol dilué dans les puits des plaques de culture cellulaire établis à l’étape 2.1.2 par une pipette μL 1 000. Passez à l’étape suivante immédiatement.
- Pipetez doucement, encore une fois, la suspension de cellules à l’étape 2.2.8. Immédiatement après le mélange, transférer la suspension cellulaire (2 mL) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Couvrir la plaque avec une feuille d’aluminium pour protéger la plaque de la lumière. Placer la plaque dans le banc propre à ta pendant 10-15 min.
Remarque : Ne pas déplacer la plaque après le semis. - Placez délicatement la plaque dans un 37 °C, 5 % CO2 incubateur (atmosphère humidifiée) et de la culture pendant 24 h.
Remarque : Ne pas secouer la plaque après le semis.
-
Induire la différenciation en définitive endoderme (stade 1 b).
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans les puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
Remarque : Pour enlever les cellules mortes de la monocouche, secouez légèrement la plaque avant chaque aspiration. - Aspirer le SPD utilisés par une pipette et ajouter 4 mL de milieu de phase 1 b (37 °C) / puits. Placez délicatement la plaque dans l’incubateur de 37 °C (atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 48 h.
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
Remarque : Retirer les cellules mortes de la monocouche en agitant doucement avant chaque aspiration. - Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de phase 1 b (37 °C) / puits. Placez délicatement la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 24 h.
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans les puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
-
Induire la différenciation dans le tube d’intestin primitif (étape 2).
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette.
Remarque : Retirer les cellules mortes de la monocouche en agitant doucement avant chaque aspiration. - Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de Stage 2 (37 °C) / puits. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 4 jours.
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette.
-
Induire la différenciation en PDX1+ de cellules (étape 3).
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
- Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de Stage 3 (37 °C) / puits. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 3 jours.
-
Induire la différenciation en cellules endocrines du pancréas.
- Induction de cellules NKX6.1+ (stade 4, pendant 8 jours) suivie par induction des cellules endocrines (stade 5, pendant 12 jours) s’exécute avec les protocoles décrits antérieurement3,16,26. Caractériser et valider la différenciation des cellules endocriniennes par immunomarquage et analyse la réaction en chaîne (qRT-PCR) polymérase quantitative de transcription inverse en temps réel.
Remarque : Voir Al. Toyoda16 et Kimura et al.,26 , pour des procédures expérimentales détaillées. Consultez le tableau 1 pour les séquences d’amorces utilisées pour l’analyse qRT-PCR.
- Induction de cellules NKX6.1+ (stade 4, pendant 8 jours) suivie par induction des cellules endocrines (stade 5, pendant 12 jours) s’exécute avec les protocoles décrits antérieurement3,16,26. Caractériser et valider la différenciation des cellules endocriniennes par immunomarquage et analyse la réaction en chaîne (qRT-PCR) polymérase quantitative de transcription inverse en temps réel.
3. cytométrie en flux (FCM)
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de 0,5 mM EDTA au puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’addition de 0,5 mM EDTA une fois.
Remarque : Secouez la plaque doucement pour enlever les cellules mortes des cellules monocouche avant chaque aspiration. - Pour dissocier les cellules (environ 3 à 6 × 106 cellules / puits), ajouter 2 mL de 0,25 % trypsine contenant 0,5 mM EDTA / puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant 5-10 min.
- Pipetter doucement mais rapidement à se dissocier les cellules regroupées en cellules individuelles. Ne se propagent pas la suspension cellulaire pendant le pipetage.
- Ajouter 8 à 10 mL de milieu de base (RPMI 1640 ou iMEM, RT) contenant 0,5 x supplément sans sérum et 10 μM Y-27632 par puits et mélanger la suspension cellulaire. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger.
- Centrifuger le tube à 300 x g à RT pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 2 mL d’EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetez doucement la suspension cellulaire.
- Centrifuger le tube à 300 x g à RT pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL de tampon de fixation et permeabilization par 106 cellules sous une hotte. Pipetez doucement la suspension cellulaire sous une hotte. Maintenir le tube à RT pendant 30 min.
- Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant sous une hotte et remettre en suspension les cellules avec une solution FCM bloquant 500 μL par 106 cellules. Pipetez doucement la suspension cellulaire. Maintenir le tube à RT pendant 30 min.
- Transférer 50 μl de la suspension de cellules dans un tube (environ 1 x 105 cellules). Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL d’anticorps primaire dilué (voir Table des matières) dans FCM bloquant la solution et laisser incuber à 4 °C pour > 16 h.
- Centrifuger le tube à 400 x g à RT pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de 1 x tampon de Perm/lavage.
- Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL d’anticorps secondaire dilué (voir Table des matières) en bloquant la solution de la FCM. Incuber les cellules à ta pendant 60 min ou à 4 °C pendant > 16 h avec protection contre la lumière.
- Centrifuger le tube à 400 x g à RT pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de 1 x tampon de Perm/lavage.
- Centrifuger le tube à 400 g à ta pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de sérum âne 2 % au SPD.
- Filtrer la suspension cellulaire en transférant sur un 5 mL tube polystyrène fond rond avec une crépine (mailles de nylon de 35 µm) de la cellule et les conserver à 4 °C avec protection contre la lumière jusqu'à l’analyse.
- Analyser une proportion de cellules colorées positivement par un cytomètre de flux27.
4. Immunostaining
- Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
Remarque : Secouez légèrement la plaque pour enlever les cellules mortes des cellules monocouche avant chaque aspiration. - Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) (4 °C) / puits sous une hotte à l’aide d’une pipette. Maintenir la plaque à 4 °C pendant 20 min.
- Retirez la PFA sous une hotte à l’aide d’une pipette. Ajouter 2 mL de SPD à ta le puits sous une hotte à l’aide d’une pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.
- Ajouter 2 mL de solution de saturation / puits et maintenir la plaque au RT pendant 30 min.
- Aspirer la solution utilisée et ajouter 1 mL d’anticorps primaire (voir Table des matières) en bloquant la solution / puits. Incuber à RT pendant 60 min ou à 4 °C pendant > 16 h.
- Aspirer la solution utilisée, ajouter 2 mL de SPD contenant 0,4 % Triton X-100 et incuber à RT pendant 10 min. répéter l’aspiration, ajout de solution et un temps d’incubation.
- Aspirer la solution utilisée et ajouter 1 mL d’anticorps secondaire (voir Table des matières) en bloquant la solution / puits. Incuber à RT pendant 60 min avec protection contre la lumière.
- Aspirer la solution utilisée, ajouter 2 mL de SPD contenant 0,4 % Triton X-100 (RT) et incuber à RT pendant 5 min avec protection contre la lumière. Répétez l’aspiration, l’addition de la solution et d’incubation deux fois.
- Prendre des photographies au microscope pour vérifier l’efficacité de différenciation sous un microscope de fluorescence28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HiPSCs multiplication (585A129,30) se condensent et forment une monocouche homogène (Figure 1 b) qui convient à la différenciation. HiPSCs indifférenciés (stade 0) sont dissociées et re-graines comme des cellules individuelles à faible densité (1-1. 5 x 105 cellules/cm2). Moins de 1 h, les cellules sont fixées à la plaque et commencent à montrer la partie saillante. Jour 1, les cellules sont se sont multipliés et bien réparties pour couvrir les 80-90 % de la surface. Au cours de l’étape 1 b, les médias semblent nuageux à cause des cellules mortes. L’élimination des cellules mortes est critique pour une différenciation très efficace puisque les cellules mortes susceptibles de perturbent la survie et la différenciation des cellules situées en dessous. Jours 3 et 4, les cellules forment une feuille monocouche homogène qui peut être décrit comme un aspect. À ce stade, la plupart des cellules arrêter exprimant la région Y-box 2 (SOX2), un marqueur des cellules indifférenciées, de détermination du sexe et expriment à la place un marqueur de l’endoderme définitif, SOX17, à plus de 90 % (Figure 2 a et B). La plupart SOX17+ cellules FOXA2 express (Figure 2 a). La différenciation en commençant par un compromis de densité cellulaire inappropriée l’efficacité de la différenciation à cette étape (Figure 3). Aux stades 2 et 3, la mort cellulaire se détend, et le support utilisé n’est pas aussi nuageux comme il est dans l’étape 1 b. Les cellules expriment les marqueurs de tube d’intestin primitif HNF1β et HNF4α (Figure 2) et finit par exprimer un marqueur progénitrices foregut postérieure et pancréatique, PDX1, à plus de 90 % (Figure 2D et E). Le PDX1+ induction de cellules est reproductible dans une autre ligne de hiPSC, 1231A3 31et une ligne de CSEh, KhES-3 32 (Figure 4). qRT-PCR résultats de l’expression de l’ARNm de marqueurs de stade concordaient avec immunostaining (Figure 5 a). L’expression de l’ARNm de PDX1 est évidente à l’étape 3 et augmente considérablement la postface.
PDX1+ cellules aux premiers stades du développement ont le potentiel de se différencier en cellules pas seulement du pancréas mais aussi de l’antre gastrique, duodénum, biliaires extrahépatiques et une partie de l' intestin, 9. Le potentiel de différenciation d’in vitro généré PDX1+ les cellules de pancréas peuvent être évaluées par la culture prolongée avec des protocoles déclarés pour endoderme pancréatique et les cellules du pancréas endocrine3,16, 26. les expressions d’un marqueur de l’endoderme pancréatique, NKX6.1et deux marqueurs endocrines du pancréas, l’insulineet du GLUCAGON, on a observé les jours 19 (étape 4) et 31 (étape 5), respectivement (Figure 5).
Figure 1 : aspect représentatif de cellules sous la différenciation progressive. (A) A régime de différenciation dirigée de hPSCs aux lignées du pancréas. Chiffres entre parenthèses indiquent des concentrations (unités sont écrites ci-dessous). (B) les micrographies de champ lumineux représentant des hiPSCs à des étapes clés de la culture de la différenciation. 585A1 hiPSCs ont été dissociées comme cellules individuelles et induites à se différencier en définitive endoderme, tube tube digestif primitif et l’ancêtre foregut postérieure et pancréatique. Les panneaux inférieurs sont une vue élargie sur les panneaux supérieurs. RPMI, RPMI 1640 ; AA, activine A (ng/mL) ; CH, CHIR99021 (ΜM) ; KGF (ng/mL) ; NOG, caboche (ng/mL) ; CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM) ; TTNPB, acide 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (nM). Barreaux de l’échelle = 300 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : induction représentative vers pancréatiques lignées de hiPSCs. (A), la proportion de SOX2–SOX17+ cellules analysées par cytométrie en flux avant la différenciation (stade 0) et le jour 4 (stade 1 b). Indifférencié hiPSCs (SOX2+SOX17–) ont été différenciées en définitive endoderme (SOX2–SOX17+). La plupart SOX17+ cellules FOXA2 conjointement exprimé. (B) microscopie par immunofluorescence représentatif au jour 4 (stade 1 b). Les cellules fixes ont été colorés pour les noyaux (bleu), SOX2 (rouge) et SOX17 (vert). (C) représentative par immunofluorescence micrographies jours 4 (stade 1 b) et 8 (étape 2). Les cellules fixes ont été colorés pour HNF1β (vert), HNF4α (rouge) et noyaux (bleus). (D) la proportion de cellules positives pour PDX1, telle qu’analysée par cytométrie jours 4 (stade 1 b) et 11 (étape 3). (E) représentant par immunofluorescence micrographies de PDX1 (vert) et de noyaux (bleus), jour 11 (étape 3). Barreaux de l’échelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : induction représentative vers définitif endoderme initié à partir des densités cellulaires différentes. (A) les micrographies de champ lumineux représentatif de 1 h après la différenciation des cellules. hiPSCs ont été dissociées comme cellules individuelles et induites à se différencier dans l’endoderme définitif aux densités cellulaires différentes (1-50 x 104/cm2). Les panneaux inférieurs sont une vue élargie sur les panneaux supérieurs. (B), la proportion de SOX2–SOX17+ cellules analysées par cytométrie en flux avant la différenciation (stade 0) et le jour 4 (stade 1 b). (C), la proportion des PDX1+ cellules analysées par cytométrie en flux aux jours 8 (étape 2) et 11 (étape 3). Barreaux de l’échelle = 300 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Induction représentative vers PDX1+ cellules hiPCSs et CSEh. Une ligne de hiPSC, 1231A3 (A), et une ligne de CSEh, KhES-3 (B), ont pu être différenciés à l’endoderme définitif et PDX1+ cellules. La composition de la cellule a été analysée par cytométrie en flux. La proportion de SOX2–SOX17+ cellules a été analysée avant la différenciation (stade 0) et le jour 4 (stade 1 b). La proportion des PDX1+ cellules a été analysée aux jours 8 (étape 2) et 11 (étape 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : induction représentative vers endoderme pancréatique et cellules endocrines. hiPSCs (585A1) ont été différenciées en PDX1+ cellules. Les cellules étaient plus différenciés dans l’endoderme pancréatique et les cellules endocrines pancréatiques avec protocoles déclarés3,16,26. (A) les ARNm des expressions de marqueurs de stade ont été mesurées par quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR). Les données ont été normalisées à l’expression de GAPDH et présentées comme le pli-changement dans l’expression des gènes par rapport à la valeur de crête. Notez que l’expression PDX1 a augmenté à > 20 fois de jours 8 (étape 2) 11 (étape 3) et à > 100 fois de jours 11 (étape 3) à 19 (étape 4). L’expression dans le pancréas humain adulte est affichée comme Panc. SOX2, noir ; SOX17, pourpre ; HNF1β, brune ; HNF4α, orange ; PDX1, vert clair ; NKX6.1, vert ; L’insuline, bleu ; GLUCAGON, rouge. (B) microscopie par immunofluorescence représentatif d’un marqueur de l’endoderme pancréatique, NKX6.1 (rouge), 11 (étape 3) et 19 (étape 4) jours. PDX1 (vert) et noyaux (bleus) ont été conjointement tachées. (C) représentative par immunofluorescence micrographies de deux fabricants endocrines du pancréas, l’insuline (INS, vert) et le glucagon (GCG, rouge), 19 (étape 4) et 31 (étape 5) jours. Noyaux (bleu) ont été conjointement tachées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom de gène | Symbole de gène | Primer avant | Inverser l’apprêt |
| glycéraldéhyde-3-phospha déshydrogénase de te |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-boîte de 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-boîte 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| Boîte homéotique HNF1 B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| alpha du facteur nucléaire 4 hépatocytaire | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| boîte homéotique 1 du pancréas et du duodénum | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 boîte homéotique 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glucagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insuline | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tableau 1 : Amorces pour qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La génération de PDX1+ cellules se compose de plusieurs étapes ; par conséquent, il est essentiel de traiter les cellules au moment opportun. Parmi les mesures, l’efficacité de l’induction de l’endoderme définitif dans une large mesure affecte l’efficacité de l’induction final, éventuellement par l’interférence des autres cellules de lignée contaminantes (mésoderme et ectoderme), qui peuvent proliférer et/ou sécrètent des facteurs qui perturber la différenciation spécifique. Si la proportion des SOX17+ cellules est inférieure à 80 % au jour 4 (stade 1 b), dont l’induction est efficace à PDX1+ cellules est susceptible d’être compromise.
États non différenciées de hPSCs sont maintenues comme colonies ou agrégats de cellules compactés. Cependant, les méthodes qui commencent la différenciation des colonies ou des agrégats peuvent souffrir d’hétérogénéité, à cause d’adhésion cellulaire différente et de densité dans la colonie, tel comme dans le centre et la périphérie22, et parce que les cellules sont à différentes étapes de le cycle cellulaire25. En revanche, notre méthode commence par des cellules dissociées unique, qui permet à un état relativement homogène d’adhésion cellulaire des cellules individuelles ou la densité des cellules dans chaque cellule. En ce qui concerne le traitement homogène pour chaque cellule, nos méthodes pourraient être plus faciles que d’autres qui commencent par une colonie ou un regroupement des cultures.
Bien que notre protocole peut être utilisé pour induire la PDX1+ cellules de plusieurs lignes de hPSC, la différenciation pourrait encore être inefficace. Dans ce cas, des différences dans l’état d’adhérence juste après ensemencement parmi les lignes de hPSC pourraient être la cause, et modification de la densité de semis pourrait être une solution à33. En effet, la Figure 3 montre qu’inapproprié semis densité compromis la différenciation cellulaire dans l’endoderme définitif et PDX1+ cellules. Fait intéressant, la densité cellulaire optimal pour PDX1+ induction de cellules ne différait pas entre les populations de cellules qui atteint > 90 % endoderme définitif. Une autre possibilité de différenciation inefficace est la condition de mauvais entretien de la hPSCs indifférenciées, ce qui compromet la qualité de pluripotence malgré l’expression de marqueurs pour l’état indifférencié. Dans ce cas, la culture d’expansion hPSC doit être recommencée de passage début gelé les stocks ou void clonage doit être effectué afin d’obtenir des hPSCs dans des conditions convenables. Dans le cas de différenciation inefficace aux jours 8 (étape 2) ou 11 (étape 3), la durée de ces étapes doit être optimisée. Soutenant cette idée, la durée de Stage 3 a été montrée critique pour l’acquisition des caractéristiques de cellules stade ultérieurs et cellule dépendante de ligne dans la lignée du pancréas34.
La génération de PDX1+ cellules est crucial pour la production in vitro de cellules pancréatiques. PDX1 est fonctionnellement essentiel pour le développement du pancréas basé sur la connaissance des souris null Pdx1, qui sont apancreatic35. Constamment, études d’implantation in vitro et in vivo ont montré PDX1 dérivé de hPSC+ cellules ont le potentiel de développement dans tous les composants du pancréas, y compris exocrines et endocrines cellules comme les cellules β du pancréas3,16 , 36 , 37. ainsi, la génération efficace de PDX1+ cellules de hPSCs conduit à un approvisionnement stable de cellules pancréatiques pour la mise en place de thérapie cellulaire β contre le diabète et la compréhension du développement du pancréas humain et les maladies du pancréas.
Les limitations de cette méthode sont liées au format de la culture à deux dimensions (2D) monocouche, qui n’est pas approprié pour certains types de cellules et le traitement des cellules. Ces dernières années, montrent en trois dimensions cultures (3D) pour promouvoir la génération des cellules matures et des tissus, probablement à cause d’imitant le microenvironnement in vivo. Par exemple, les cellules β générée en cultures 3D mais des cultures monocouches 2D ne pouvaient atteindre la capacité de sécréter de l’insuline en réponse à des niveaux de glucose extracellulaire38.
Pour utiliser PDX1+ cellules pour la génération de types de cellules développemental plus tard, il est important de passer à des cultures 3D, telles que les cultures en suspension d’agrégats d’enrobés dans une matrice extracellulaire et cultures agrégées sur un air liquide d’interface3 , 16 , 37. en outre, des cultures monocouches 2D nécessitent plus grande surface de culture que les cultures en suspension, limiter l’évolutivité. Le traitement de grandes quantités de cellules pour un usage commercial nécessite des modifications telles que l’utilisation de microbilles. Dans le même temps, la présente méthode consiste pour le dépistage des facteurs induisant la différenciation et l’exploration des mécanismes moléculaires par transfert de gènes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) par l’intermédiaire de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 et 18 K 08510) à T.T. et subvention pour les chargés de recherche de pages jsp (jsp KAKENHI Grant Number 17J07622) A.K. et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) par le biais de ses travaux de recherche accordent « Core Center for iPS Cell Research, centre de recherche de réseau pour la réalisation de la médecine régénérative » à K.O. Les auteurs remercient Dr Peter Karagiannis pour la lecture du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
