Summary
Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) клетки для поколения поджелудочной железы линий на основе роста монослоя-колонии типа отделить одиночных клеток. Этот метод подходит для производства однородных клеток hPSC производные, генетические манипуляции и скрининг.
Abstract
Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных клеток поджелудочной железы являются перспективный источник клеток для регенеративной медицины и платформу для изучения процессов человеческого развития. Шагам направлены дифференциации, резюмирует процессов развития является одним из основных способов создания клеток поджелудочной железы, включая поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) поджелудочной железы прогениторных клеток. Обычные протоколы инициировать дифференциация с небольшими колониями вскоре после прохождения. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены неоднородностей, которые могут препятствовать дифференциации PDX1+ клеток. Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клеток. Протокол состоит из четырех этапов и инициирует дифференциация по посевной диссоциированных одиночных клеток. Индукции SOX17+ окончательного эндодермы клеток последовал выражение двух примитивных кишки трубки маркеров, HNF1β и HNF4α и возможной дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол обеспечивает удобство в обращении и может улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые ранее были обнаружены неэффективно дифференцироваться в эндодермы линий или PDX1+ клеток.
Introduction
Поджелудочной железы в основном состоит из эндокринной и экзокринной клеток, и его дисфункции или перегрузка вызывает несколько заболеваний, таких как панкреатит, сахарный диабет и рак поджелудочной железы. Для выяснения патогенеза pancreatopathy, это необходимо для анализа процесса развития и функции клеток поджелудочной железы. Кроме того стабильные ячейки поставок с надежным качеством требуется учредить терапия добавок ткани клеток. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных поджелудочной железы клетки перспективный источник клеток для этих целей, и дифференциация протокол к клеток поджелудочной железы был интенсивно изучали1,2,3, 4. Последние достижения в в пробирке генерации клеток поджелудочной железы β имитировать генерации β-клеток взрослого человека, и эти клетки шоу терапевтической эффективности после имплантации в диабетической модели мышей2,3. Кроме того анализ β-клеток, генерируется индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) здоровых и тип 1 диабет пациентов доноров показал не функциональные различия, включая когда в условиях стресса5. Кроме того болезнь фенотипов были частично воспроизведены в искусственных клеток поджелудочной железы с пациента производные iPSCs или hPSCs, укрывательство генетические мутации в том же сайте, что пациенты6,7.
Для генерации клеток поджелудочной железы от hPSCs, используется поэтапный направленного дифференцирования, которая повторяет процессы развития. Поджелудочной железы является производным из энтодермы слоя раннего эмбриона, который выражает секс определение региона Y-бокс 17 (SOX17) и forkhead ящик А2 (FOXA2)8. Основываясь на исследованиях мыши, эндодермы слой образует примитивных кишки трубка, которая характеризуется выражением гепатоцит ядерного фактора 1-бета (Hnf1β) и гепатоцит ядерного фактора 4-альфа (Hnf4α). Примитивных кишки трубка удлиняется и развивается в органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. После удлинения, передняя задняя кишка область становится регионе предполагаемого поджелудочной железы, как отмечено выражением transcriptional фактор поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1 (PDX1)8,9,10. Спинной и брюшной части PDX1+ кишки трубы утолщаются формы поджелудочной железы почки, которые отмечены одним выражением поджелудочной железы транскрипционного фактора 1 субблок альфа (PTF1A) и НК6 гомеобокс 18,(NKX6.1)11. Это выражение началу морфологических поджелудочной железы органогенеза. Поджелудочной железы эндодермы клеток, которые являются компонентами поджелудочной железы бутоны, формируют разветвленную сеть трубчатых эпителиальных структур12 и в конечном итоге дифференцироваться в эндокринной и экзокринной клетки, в том числе секреции инсулина β-клетками и Глюкагон секретирующих α-клетки. Выражение PDX1 обнаружен первый в регионе предполагаемого поджелудочной железы, который затем наблюдается на протяжении всего развития поджелудочной железы и показывает локализации для β - и δ-клетки9,,1314. Хотя Pdx1+ область ячейки, которая не выразить Ptf1a или Nkx6.1 отличает в желудка антрального, двенадцатиперстной кишки, кишечной клетки в середине на поздней стадии развития в мышей9, PDX1 и внепеченочных желчных протоков+ клетки, считаются прародителями поджелудочной железы на ранней стадии развития в организме человека.
Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клетки для поколения поджелудочной железы линий. Дифференциация инициирует протокол путем заполнения отрыве одной клетки15,16,17. Как правило недифференцированные hPSCs поддерживаются как колоний или агрегаты клеток в суспензии или адгезии. В результате большинство протоколов инициировать дифференциация вскоре после пассированый. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены пространственных и transcriptional неоднородностей18,19,20,21,22, которые могли бы воспрепятствовать Первый шаг дифференциации в окончательное энтодермы следуют неэффективных дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол может предложить управляемость улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые были ранее признаны дифференцировать неэффективно эндодермы линий и PDX1+ клеток23, 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с использованием hPSCs были утверждены Комитетом по этике Департамента медицины и высшая школа медицины, Университет Киото.
1. Подготовка материалов
Примечание: Подготовьте все средства массовой информации и реагенты для культуры клеток в стерильных условиях. Разминка базовой культуры СМИ до комнатной температуры (RT) перед использованием. Средний для дифференциации используется в течение 6 часов на RT. детали реагентов, перечислены в Таблице материалов.
-
Дифференциация (рис. 1A)
- Средний этап 1A: передачи среднего RPMI 1640 в трубку с помощью пипетки. Добавьте сыворотки бесплатные дополнения, activin A, CHIR99021 и Y-27632 в концентрации 1 x, 100 нг/мл, 3 мкм и 10 мкм, соответственно.
- Средний этап 1B: передачи среднего RPMI 1640 в трубку с помощью пипетки. Добавьте в сыворотке бесплатные дополнения, activin A и CHIR99021 в концентрации 100 нг/мл, 1 x, ≤1 мкм, соответственно.
Примечание: Концентрация CHIR99021 должна быть ниже, чем средний этап 1A и добавление не является необходимым, но она увеличивает номер ячейки. - Средний этап 2: средний MEM улучшение передачи (ИМЭМ) в трубку с помощью пипетки. Добавьте сыворотки бесплатные дополнения и фактор роста кератиноцитов (кгс) в концентрации 0,5 x и 50 нг/мл, соответственно.
- Средний этап 3: ИМЭМ теплоносителя в трубку с помощью пипетки. Добавить сыворотки бесплатные дополнения, кгс, БАШКА, 3-кето-N-аминоэтил N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) и 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic кислоты (TTNPB), очистка концентрации 0,5 x, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 0,5 мкм и 10 Нм, соответственно.
-
Проточная цитометрия (FCM)
- 1 x Permeabilization/мыть буфера: передачи воды в трубку с пипеткой. Добавьте Permeabilization/мыть буфера, пипетки в концентрации 1 x.
- ТСМ, преграждая разрешение: передачи 1 x Permeabilization/мыть буфера в трубку с пипеткой. Добавьте осла сыворотки, пипетки в концентрации 2% (vol/vol).
-
Иммуноокрашивания
- Блокирование решение: передача Дульбекко Phosphate-Buffered солевой (DPBS) в трубку с пипеткой. Добавьте осла сыворотки и Тритон X, пипетки в концентрации 5% (vol/vol) и 0,4% (vol/vol), соответственно.
2. hPSC дифференциации в задней прародителями Передняя кишка клеток/поджелудочной железы (PDX1+ клеток)
Примечание: Провести все процедуры с использованием стерильных методов. hPSCs ведутся на 6-ну плиты, покрытой синтетические поверхности материала для hPSCs с hPSC среднего обслуживания согласно инструкции производителя17,26. Когда клетки достигают 50-80% confluency (Стадия 0) использовать их для дифференциации.
-
Подготовка матрицы, покрытыми базальной мембраны.
- Передачи 6 мл RPMI 1640 (4 °C) в пробирку охлаждают до 4 °C на льду. Добавить 2 мг базальной мембраны матрицы (4 °C) с охлаждением 1 мл-наконечники и перемешать хорошо, нежный закупорить сделать матрица базальной мембраны 0,33 мг/мл.
- Переводом 2 мл разбавленной базальной мембраны матрицы для каждой скважины 6-ну клетки культуры пластин пипетки. Поместите пластины при 37 °C 60-90 мин в инкубаторе. Потом Держите пластины на RT до использования (в течение 3 ч).
-
Семена hPSCs и инициировать дифференциация для окончательного эндодермы (стадия 1A).
- Аспирационная используемым средством и добавьте 2 мл 0,5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (RT) за хорошо дозатор мыть hPSCs культивировали в 6-ну пластины.
- Аспирационная 0,5 мм ЭДТА и добавить 2 мл 0,5 мм ЭДТА в колодец с пипеткой. Инкубируйте пластины при 37 °C за 5 мин.
- Аспирационная 0,5 мм ЭДТА и добавьте 1 mL hPSC обслуживания среды на RT, дополнена 10 мкм Y-27632 на хорошо с пипеткой. Пипетка аккуратно, но быстро сдуть придает клетки на тарелках и разъединять скомканным клетки в одной клетки. Не пузырь суспензию клеток во время закупорить.
- Передача суспензию клеток в 50 мл пластиковых пробирок, содержащих 4 мл hPSC обслуживания среды на RT, дополнена 10 мкм Y-27632. Аккуратно Пипетка суспензию клеток.
- Подсчет клеток в суспензии клеток, используя процедуру исключения пятно Трипановый синий.
- Смесь 15 мкл суспензии клеток и 15 мкл Трипановый синий в трубку.
- Передача 10 мкл суспензии клеток, разбавляют Трипановый синий ячейку подсчета слайдов в двух экземплярах по 10 мкл пипетки.
- Подсчитать ячейки номер с автоматической клеток счетчиком и рассчитать плотность клеток в суспензии клеток. Обычно является жизнеспособность > 98%.
- Алиготе суспензию клеток в пластиковых пробирок 50 мл на 1-1,5 х 106 клеток на хорошо 6-ну пластин (1-1,5 x 105 клеток/см2).
- Центрифуга Тюбик 50 мл на 200 x g на RT на 5 мин.
- Аспирационная супернатанта, с помощью пипетки и Ресуспензируйте клеток в 1 мл средний этап 1A (RT) за хорошо. Аккуратно Пипетка суспензию клеток и добавить еще 1 мл этап 1A среднего (общего, 2 мл на хорошо).
- Аспирационная разреженных базальной мембраны матрицы в скважинах пластин культуры клеток, подготовленный на шаге 2.1.2 1000 мкл пипетки. Немедленно приступить к следующему шагу.
- Аккуратно Пипетка суспензию клеток в шаге 2.2.8 снова. Сразу же после перемешивания, передача суспензию клеток (2 мл) в каждый хорошо 6-ну плиты. Крышка с алюминиевой фольги для защиты пластину от света. Место пластину в чистой скамейке в РТ за 10-15 мин.
Примечание: Не перемещайте пластины после посева. - Осторожно поместите пластины в 37 °C, 5% CO2 инкубатора (увлажненные атмосферы) и культура за 24 ч.
Примечание: Не трясите пластины после посева.
-
Индуцировать дифференцировку в окончательное эндодермы (этап 1B).
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS скважин, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
Примечание: Чтобы удалить все мертвые клетки однослойная, осторожно встряхните пластину перед каждой аспирации. - Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл средний этап 1B (37 °C) за хорошо. Осторожно поместите пластины в инкубатора 37 °C (увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуры за 48 ч.
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
Примечание: Удалите мертвые клетки от монослоя, мягкий сотрясение перед каждой аспирации. - Аспирационная используется DPBS, дозаторов и добавить 4 мл средний этап 1B (37 °C) за хорошо. Осторожно поместите пластины в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культура за 24 ч.
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS скважин, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
-
Индуцировать дифференцировку в примитивных кишки трубки (этап 2).
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки.
Примечание: Удалите мертвые клетки от монослоя, мягкий сотрясение перед каждой аспирации. - Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл 2 этап среднего (37 °C) в колодец. Место пластину в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуру на 4 дня.
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки.
-
Побудить дифференцировку в PDX1+ клеток (этап 3).
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
- Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл среды (37 °C) этап 3 за хорошо. Место пластину в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуру для 3 дней.
-
Индуцировать дифференцировку в эндокринных клеток поджелудочной железы.
- Выполните NKX6.1+ клеток индукции (этап 4, 8 дней) следуют эндокринных клеток индукции (этап 5, за 12 дней) с ранее описанные протоколы3,16,26. Характеризуют и проверить эндокринной клеточная дифференцировка иммуноокрашивания и количественных реального времени обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализа.
Примечание: Обратитесь к Тойода et al.16 и26 Кимура et al. подробное описание экспериментальных процедур. Обратитесь в таблице 1 для последовательностей праймера для qRT ПЦР анализа.
- Выполните NKX6.1+ клеток индукции (этап 4, 8 дней) следуют эндокринных клеток индукции (этап 5, за 12 дней) с ранее описанные протоколы3,16,26. Характеризуют и проверить эндокринной клеточная дифференцировка иммуноокрашивания и количественных реального времени обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализа.
3. проточной цитометрии (FCM)
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл 0,5 мм ЭДТА в колодец с пипеткой. Повторите аспирации и добавлением 0,5 мм ЭДТА один раз.
Примечание: Встряхните пластину осторожно, чтобы удалить любые отмершие клетки от монослоя клеток перед каждой аспирации. - Чтобы разбить ячейки (приблизительно 3-6 × 106 клеток в колодец), добавить 2 мл 0,25% трипсина, содержащий 0,5 мм ЭДТА в колодец. Инкубируйте пластины при 37 °C за 5-10 мин.
- Пипетка аккуратно, но быстро отделить скомканным клетки в одной клетки. Не пузырь суспензию клеток во время закупорить.
- Добавить 8-10 мл базовой среды (RPMI 1640 или ИМЭМ, RT) содержащий 0,5 x сыворотки бесплатные дополнения и 10 мкм Y-27632 за хорошо и перемешать суспензию клеток. Перенесите суспензию клеток в пластиковых пробирок.
- Центрифуга трубки на 300 x g на RT на 5 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки с 2 мл 0,5 мм ЭДТА (RT). Аккуратно Пипетка суспензию клеток.
- Центрифуга трубки на 300 x g на RT на 5 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл буфера фиксации и permeabilization за 106 клеток под капотом. Аккуратно Пипетка суспензию клеток под капотом. Держите трубку на RT 30 мин.
- Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин.
- Аспирационная супернатант под капотом и Ресуспензируйте клетки с 500 мкл ТСМ блокирования решения за 106 клеток. Аккуратно Пипетка суспензию клеток. Держите трубку на RT 30 мин.
- Передача 50 мкл суспензии клеток в трубку (приблизительно 1 х 105 клеток). Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл разбавленного основное антитело (см. Таблицу материалы) в FCM преграждая разрешение и Инкубируйте на 4 °C для > 16 h.
- Центрифуга трубки на 400 x g на RT 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 1 x Пермь/мыть буфера.
- Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл разбавленного вторичные антитела (см. Таблицу материалы) в FCM, преграждая разрешение. Инкубировать клетки на RT 60 мин или на 4 °C для > 16 h с защитой от света.
- Центрифуга трубки на 400 x g на RT 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 1 x Пермь/мыть буфера.
- Центрифуга трубку g 400 x на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 2% сыворотки осел в DPBS.
- Фильтр суспензию клеток путем передачи на 5 мл круглая труба внизу полистирола с ячейки сита (35 мкм нейлоновая сетка) и хранить при 4 °C с защитой от света до анализа.
- Анализировать доля положительно окрашенных клеток потока цитометр27.
4. иммуноокрашивания
- Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
Примечание: Осторожно встряхните пластину для удаления любых мертвых клеток из монослоя клеток перед каждой аспирации. - Добавить 2 мл параформальдегида 4% (PFA) (4 °C) в колодец, Пипетка под капотом. Держите пластины на 4 °C в течение 20 мин.
- Удалите PFA, Пипетка под капотом. Добавьте 2 мл DPBS на RT в колодец, Пипетка под капотом. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
- Добавить 2 мл раствора блокировки на хорошо и сохранить пластину на RT 30 мин.
- Аспирационная используемое решение и добавить 1 мл основное антитело (см. Таблицу материалы) в блокировании раствора на хорошо. Инкубируйте на RT 60 мин или на 4 °C для > 16 h.
- Аспирационная используемое решение, добавить 2 мл DPBS, содержащих 0,4% Тритон X-100 и Инкубируйте на RT на 10 мин повторить стремление, добавлением раствора и инкубации один раз.
- Аспирационная используемое решение и добавьте 1 mL вторичные антитела (см. Таблицу материалы) в блокировании раствора на хорошо. Инкубируйте на RT 60 мин с защитой от света.
- Аспирационная используемое решение, добавить 2 мл DPBS, содержащих 0,4% Тритон X-100 (RT) и Инкубируйте на RT на 5 мин с защитой от света. Повторите аспирации, добавлением раствора и инкубации в два раза.
- Возьмите микроскопии для изучения эффективности дифференциация под микроскопом флуоресценции28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распространение hiPSCs (585A129,30) конденсируются и образуют однородную монослоя (Рисунок 1B), который подходит для дифференциации. Недифференцированные hiPSCs (Стадия 0) отделить и вновь посеяны как единичных клеток при плотностях низкой ячейки (1-1,5 x 105 клеток/см2). В течение 1 ч клетки прикрепляются к пластине и начать, чтобы показать выступ. День 1 клетки распространились и хорошо распределены на 80-90% от площади поверхности. В этапе 1B средства массовой информации появляются облачно благодаря мертвые клетки. Удаление омертвевших клеток имеет решающее значение для высокоэффективных дифференциации, так как мертвые клетки могут нарушить выживания и дифференцировки клеток, лежа под. На дня 3-4 клетки образуют однородный монослоя лист, который может быть описан как булыжник внешний вид. На данный момент большинство клеток остановить, выражая секс определение региона Y-box 2 (SOX2), маркером недифференцированных клеток и вместо этого выразить окончательного энтодермы маркер, SOX17, в более чем 90% (рисунок 2A и B). Большинство SOX17+ клетки Экспресс FOXA2 (рис. 2A). Начиная дифференциация с неуместным клеток плотность компромиссов эффективности дифференциация на этот шаг (рис. 3). На этапах 2 и 3 смерть клетки расслабляет, и средство используется не так ясно, как это в этапе 1B. Клетки Экспресс примитивных кишки трубки маркеры HNF1β и HNF4α (рис. 2 c) и в конечном итоге Экспресс задняя Передняя кишка поджелудочной прародитель маркер, PDX1, в более чем 90% (Рисунок 2D и E). PDX1+ индукции клетки воспроизводимые в другой hiPSC линии и 1231A3 31, Госкомсанэпиднадзором линии, KhES-3 32 (рис. 4). qRT ПЦР результаты экспрессии мРНК стадии маркеров согласуются с иммуноокрашивания (Рисунок 5A). Выражение mRNA PDX1 очевидна на этапе 3 и существенно увеличивает послесловие.
PDX1+ клетки на ранних этапах своего развития имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в не только поджелудочной железы клетки, но также желудка антрального, двенадцатиперстной кишки, внепеченочных желчных протоков и часть кишки 9. Дифференциация потенциал в пробирке создан PDX1+ клетки поджелудочной железы клетки могут оцениваться Расширенный культуры с сообщил протоколы для поджелудочной железы энтодермы и клетки поджелудочной железы внутренней секреции3,16, 26. выражения маркер поджелудочной железы энтодермы, NKX6.1и два поджелудочной железы эндокринной маркеры, ИНСУЛИНи ГЛЮКАГОН, были замечены в дни 19 (этап 4) и 31 (этап 5), соответственно (рис. 5).
Рисунок 1: представительный внешний вид ячеек под ступенчатой дифференциация. (A) A схема направленного дифференцирования для поджелудочной железы линий от hPSCs. Цифры в скобках указывают концентрации (единицы пишутся ниже). (B) представитель светлые области микроскопии hiPSCs на ключевых этапах дифференциация культуры. 585A1 hiPSCs были отделить как отдельные клетки и индуцированных дифференцироваться в окончательное энтодермы, примитивных кишки трубки и задняя Передняя кишка поджелудочной прародителя. Нижней панели являются Расширенный вид верхней панели. RPMI, RPMI 1640; AA, activin (нг/мл); CH, CHIR99021 (МКМ); КГС (нг/мл); Нагель, БАШКА (нг/мл); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (мкм); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic кислоты (Нм). Масштаб баров = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель индукции к поджелудочной железы линий от hiPSCs. (A) доля SOX2–SOX17+ клетки, анализируемой проточной цитометрии до дифференциации (Стадия 0) и день 4 (этап 1B). Недифференцированные hiPSCs (SOX2+SOX17–) были дифференцированы в окончательное эндодермы (SOX2–SOX17+). Большинство SOX17+ клетки совместно выраженной FOXA2. (B) представитель immunofluorescent микроскопии на день 4 (этап 1B). Фиксированные клетки окрашивали SOX17 (зеленый), SOX2 (красный) и ядра (синий). (C) представитель immunofluorescent микроскопии в дни 4 (этап 1B) и 8 (этап 2). Фиксированные клетки окрашивали HNF1β (зеленый), HNF4α (красный) и ядра (синий). (D) доля клеток позитивные для PDX1, как анализируемой проточной цитометрии в дни 4 (этап 1B) и 11 (этап 3). (E) представитель immunofluorescent микроскопии PDX1 (зеленый) и ядра (синий) на день 11 (этап 3). Масштаб баров = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель индукции к окончательного энтодермы, инициированных из различных клеточных плотности. (A) представитель светлые области микроскопии клетки 1 ч после дифференциации. hiPSCs были отделить как отдельные клетки и индуцированных дифференцироваться в окончательное Эндодерма в плотности различных клеток (1-50 x 104выход2). Нижней панели являются Расширенный вид верхней панели. (B) доля SOX2–SOX17+ клетки, анализируемой проточной цитометрии до дифференциации (Стадия 0) и день 4 (этап 1B). (C) доля PDX1+ клетки, анализируемой проточной цитометрии в дни 8 (этап 2) и 11 (этап 3). Масштаб баров = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель индукции к PDX1+ клеток в hiPCSs и ЭСК. Линия hiPSC, 1231A3 (A), и Госкомсанэпиднадзором линии, KhES-3 (B), были продифференцированы окончательного энтодермы и PDX1+ клеток. Клеточный состав был проанализирован проточной цитометрии. Доля SOX2–SOX17+ клетки были проанализированы до дифференциации (Стадия 0) и день 4 (этап 1B). Доля PDX1+ клетки была проанализирована на дни 8 (этап 2) и 11 (этап 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель индукции к поджелудочной железы энтодермы и эндокринных клеток. hiPSCs (585A1) были дифференцированы в PDX1+ клеток. Клетки были далее дифференцированы в поджелудочной энтодермы и эндокринных клеток поджелудочной железы с сообщил протоколы3,16,26. (A) мРНК выражения стадии маркеров были измерены количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Данные были нормализованы выражение GAPDH и представлены как раз изменения в экспрессии генов по отношению к пикового значения. Обратите внимание, что выражение PDX1 была увеличена на > кратной от дней 8 (этап 2) до 11 (этап 3) и на > 100-кратного от дней 11 (этап 3) до 19 (этап 4). Выражение в взрослого человека поджелудочной железы показана как Panc. SOX2, черный; SOX17, фиолетовый; HNF1β, коричневый; HNF4α, оранжевый; PDX1, светло-зеленый; NKX6.1, зеленый; ИНСУЛИН, синий; ГЛЮКАГОН, красный. (B) представитель immunofluorescent микроскопии маркера поджелудочной железы энтодермы, NKX6.1 (красный), дни 11 (этап 3) и 19 (этап 4). PDX1 (зеленый) и ядра (синий) были совместно окрашенных. (C) представитель immunofluorescent микроскопии создателей двух поджелудочной железы эндокринной, инсулин (СИН, зеленый) и глюкагона (ГКГ, красный), в дни 19 (этап 4) и 31 (этап 5). Ядер (синий) были совместно окрашенных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя Джин | Джин символ | Форвард грунтовка | Обратный грунтовка |
| Глицеральдегид-3-phospha Дегидрогеназа TE |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-box 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-бокс 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| Гомеобокс HNF1 B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| Гепатоцит ядерного фактора 4 альфа | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| поджелудочной железы и дуоденального гомеобокс 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| Гомеобокс НК6 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| Глюкагон | ГКГ | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| инсулин | МОДУЛИ | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Таблица 1: Праймеры для ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поколение PDX1+ клетки состоит из нескольких шагов; Таким образом крайне важно для лечения клетки в соответствующее время. Среди шагов эффективности индукции окончательного энтодермы во многом влияет на окончательный индукции эффективность, возможно, помехи от других загрязняющих клеток линии (то есть, мезодермы и эктодермы), которые могут размножаться и/или выделяют факторы, которые нарушить конкретные различия. Если доля SOX17+ клеток ниже, чем 80% на день 4 (этап 1B), эффективной индукции к PDX1+ клеток может быть нарушена.
Недифференцированная государства hPSCs поддерживаются как колоний или агрегатов уплотненного клеток. Однако методы, которые начинаются дифференциация от колоний или агрегатов могут страдать от неоднородности, из-за различных клеточной адгезии и плотности в колонии, такие как в центре и на периферии22, и потому, что клетки находятся на различных стадиях в клеточный цикл25. С другой стороны наш метод начинается с диссоциированных одиночных камер, что позволяет относительно однородное состояние клеточной адгезии одиночных клеток или плотность клеток в каждый single cell. С точки зрения однородную обработку для каждой ячейки, наши методы могут быть легче, чем другие, которые начинаются с колонии или агрегирования культур.
Хотя наш протокол может использоваться для стимулирования PDX1+ клетки от несколько hPSC линий, дифференциация по-прежнему может быть неэффективным. В таких случаях причиной могут быть различия в состоянии адгезии сразу после посева среди hPSC линии, и изменения плотности заполнения может быть решение33. Действительно, Рисунок 3 показывает, что неуместно плотность дифференциация по компромиссы посева клеток в окончательное энтодермы и PDX1+ клеток. Интересно, что плотность оптимальной клеток для PDX1+ индукции клетки отличался среди популяции клеток, которые достигли > 90% окончательного энтодермы. Еще одна возможность для неэффективных дифференциации является плохое техническое обслуживание условием недифференцированные hPSCs, которая ставит под угрозу качество плюрипотентности несмотря на выражение маркеров для недифференцированных государства. В этом случае hPSC расширение культуры следует возобновила от ранних проход замороженные запасы или sub клонирование должно выполняться для получения hPSCs в подходящих условиях. В случае неэффективного дифференциации в дни 8 (этап 2) или 11 (этап 3) Длительность действия должны быть оптимизированы. Поддерживая эту идею, продолжительность стадии 3 показала важнейшее значение для приобретения более поздней стадии клетки характеристики и ячейка строки зависимых в поджелудочной линии34.
Поколение PDX1+ клетки имеет решающее значение для поколения в пробирке клеток поджелудочной железы. PDX1 функционально важно для поджелудочной железы развития, основанной на знаниях от мышей Pdx1 значение null, которые являются apancreatic35. Последовательно, имплантации в vitro и in vivo исследования показали hPSC производные PDX1+ клетки имеют потенциал для развития во всех поджелудочной железы компонентов, в том числе экзокринной и эндокринные клетки, такие как поджелудочной железы β-клеток3,16 , 36 , 37. Таким образом, эффективное поколение PDX1+ клеток от hPSCs приводит к стабильной поджелудочной железы клетки поставки для создания β клеточной терапии против диабета и понимание развития человека поджелудочной железы и заболеваний поджелудочной железы.
Ограничения этого метода связаны с двухмерный (2D) монослоя культуры формат, который не подходит для некоторых типов клеток и клеток обработки. В последние годы было показано трехмерные (3D) культур, содействовать поколения зрелых клеток и тканей, возможно, вследствие передразнивать в естественных условиях микроокружения. Например β-клеток, образующихся в 3D культур, но не 2D монослоя культур может достичь способности секретировать инсулина в ответ на внеклеточные глюкозы уровни38.
Для использования PDX1+ клетки для поколения развивающих более поздних типов клеток, важно перейти к 3D культур, таких как подвеска культур агрегатов, встроенных в внеклеточного матрикса и совокупных культур на воздухе жидкость интерфейс3 , 16 , 37. Кроме того, 2D монослоя культур требуют больше площади поверхности для культивирования чем подвеска культур, ограничивая масштабируемость. Обработка большого количества клеток для коммерческого использования требует модификации, такие как использование микрошарики. В то же время нынешний метод подходит для скрининга дифференциации индуцировать факторы и изучение молекулярных механизмов переноса генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в части финансирования от японского общества для поощрения науки (JSP) через Scientific Research (C) (JSP-страницы KAKENHI Грант Number15K09385 и 18 K 08510) т.т., и субсидий для страниц JSP научных сотрудников (JSP-страницы KAKENHI номер гранта 17J07622) а.к., и Японское агентство для медицинских исследований и развития (AMED) через его исследования «Основной центр iPS исследования клеток, исследовательский центр сети для реализации регенеративной медицины» предоставить K.O. Авторы благодарят д-р Питер Karagiannis для чтения рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
