Summary
매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.
Abstract
Alzheimer의 질병 (광고)의 neuropathology는 축적과 두뇌의 세포 외 플 라크로 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 집계에 의해 특징입니다. Aβ 펩 티 드, 40 개의 아미노산으로 구성 하 여 β-및 γ-secretases 녹말 체 선구자 단백질 (APP)에서 생성 됩니다. Aβ 뇌 실질 뿐만 아니라 환자의 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA)로 알려진 대뇌 혈관 벽에 입금 됩니다. Aβ 펩 티 드의 다양 한 발견 했다 하는 동안 자세한 생산 및 광고의 병 적인 조직에 개별 Aβ 펩 티 드의 분포와 CAA 완전히 해결 되지 않은. 여기, 우리는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS) 포괄적인 단백질 매핑을 인간의 부검 뇌 조직에의 한 프로토콜을 개발 한다. 이 위해 인간의 대뇌 피 질의 표본 도쿄 수도권 노인 연구소에서 두뇌 은행에서 얻은 했다. 언된 cryosections는 잘라내어 인듐 주석 산화물 (ITO) 전송-유리 슬라이드 코팅. 스펙트럼을 공간 해상도 MALDI 시스템을 사용 하 여 인수 20 µ m. Sinapinic 산 (SA)은 균일 하 게 입금 자동 또는 수동 분무기를 사용 하 여 슬라이드에. MALDI IMS의 현재 기술 이점, 인간 위해 두뇌의 같은 섹션 내에서 다양 한 Aβ 종의 일반적인 데이터 집합 특정 프로브 없이 얻어질 수 있다. 또한, 고해상도 (20 µ m)는 광고 두뇌와 심한 CAA 샘플의 이미징 명확 하 게 보여준다 Aβ1-42와 Aβ1-43 치 패 (SP)로 뇌 실질에 예금 되었다 하는 동안 Aβ1-36 Aβ1-41을 환자의 혈관으로 예금 되었다. 그것은 광고, CAA의 병 리를 이해 임상, 유전, 및 병 적인 관찰과 조합에서 표준 접근 방식으로 MALDI-IMS 채택 수 그리고 현재 전략을 기반으로 다른 신경 질환.
Introduction
진단 하 고 신경 퇴행 성 질환의 pathogenesis의 이해, 병 적인 예금의 정확한 분자 식별은 필수1. 광고, 동안 Aβ 뇌 실질에 SPs를 만들기 위해 생산 및 혈관에 질병 발병2,,34,,56오래 전에. Aβ1-42 광고 두뇌의 SP에 주된 펩 티 드, N 맨끝 또는 C 터미널 등 다른 Aβ 변종 잘립니다 또는 Aβs를 수정, 또한 영향을 받는 광고 두뇌7,,89에서 확인 된 10. 전체 그림 인간의 두뇌에 있는 Aβ의 광범위 한 범위 종의 특히 광고와 대뇌 녹말 체 angiopathy (CAA)11, 도움이 될 것입니다 Aβ 생산, 물질 대사, 및 증 착을 이해 하는 과학자.
Neuropathology의 고전적인 접근으로 immunohistochemistry (IHC) 뇌 조직12,13,,1415에 Aβs의 위치를 결정 하는 가장 결정적인 방법 되었습니다. 일반적으로, IHC 여러 epitopes 동시에 공존 하는 경우 분자를 구별할 수 없습니다. 대조적으로, 신흥 질량 분석 기반 proteomic 분석은 Aβ 종 항 체16,17분화 될 수 없는 뇌 조직에서의 다양 한 분석을 위해 특히 귀중 한 접근 이다. 뇌 lysates의 면역을 시 켰 던 샘플 기존의 질량 분석 기반 분석 사소한 Aβ 펩 티 드를 검색 실패 하 고 뇌 조직에서 Aβ의 유통 정보를 잃는다.
이전 작품에서 마우스 두뇌에 있는 Aβ 예금 시각화 성공 했다 광고, APP23 등의 유전자 변형 동물 모델을 사용 하 여. 그러나,이 과정에는 여전히 IMS와 IHC 해상도 감도18,,1920에 대해 비교 기술 발전 필요 합니다. 광고 neuropathology 인간의 두뇌에 공부 한다 고 우리는 포괄적인 단백질 매핑21를 인간의 부검 뇌 조직에 MALDI IMS 기술을 사용. 이 목적을 위해 우리는 속도, 감도 및 재현성에 장점이 질량 분석의 고급 유형에 대 한 프로토콜을 개발 했다.
Protocol
여기, 조직 샘플 도쿄 도립 노인 병원, 일본의 노인 인구에 지역 사회 기반의 의료 서비스를 제공에 수집 되었다. 연구에 사용 하는 두뇌 부검 샘플 사망자의 친척의 통지 해준 동의 노화 연구 (BBAR) 두뇌 은행에 등록 되었다. BBAR 도쿄 도립 노인 병원 및 노인 학 연구소의 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 두뇌 두뇌 은행에 등록 된, 우리는 환자 또는 그들의 가족에서 의료 연구에 대 한 그들의 사용에 대 한 서 면된 통지 해준 동의 얻었다. 환자는 뇌의 사후 변화를 줄이기 위해 죽음 후 2 시간 내 감기 (4 ° C) 룸에 배치 했다. 여기 설명 된 모든 메서드는 노화 연구, 도쿄 도립 노인 병원 및 노인 학 연구소 도시샤 대학과 두뇌 은행에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. IMS에 대 한 조직 단면도의 준비
- 인간의 autopsied 뇌의 조직 표본을 처리
참고: IMS에 대 한 샘플 준비 단계는 조직의 원래 상태를 유지 해야 합니다. 오염 및 사후 변경을 하지 마십시오. 다음 단계는 중요 한.- 머리 제거, 처리, 그리고 사후 8 h 이내-80 ° C에 저장에서 IMS에 대 한 인간의 대뇌 피 질의 표본을 가져옵니다. 광고 환자와 컨트롤 일치 하는 나이21의 후 두 피에서 뇌 견본을 가져가 라.
- 냉동된 조직 단면도의 준비
- 조직 단면도 cryostat에 잘라. Cryostat21내부 전도성 ITO 코팅 현미경 유리 슬라이드를 놓습니다.
- -80 ° C에서-22 ° C는 cryostat 내부 부검 뇌 견본을 따뜻한.
- 모든 실험에 대 한 cryostat를 새로운 일회용 블레이드를 연결 합니다. 항상 칼 날의 깨끗 한 부분을 사용 하려고 합니다.
- 10 월 화합물의 작은 금액을 함께 무대에 냉동된 부검 두뇌를 넣어 (무대;의 중앙 영역을 커버 하는 충분 한 재료의 표참조).
- 얇은 단면에 대 한 조건을 선택 합니다. IMS, 인간 두뇌의 섹션에 대 한 10-12 μ m의 두께 사용 합니다. IMS와 IHC, 각 조직 샘플에서 5 ~ 6 섹션을 잘라.
- 조직의 모든 노출 될 때까지 잎은 그냥 시작 하면 조직을 잘라, 바퀴 및 "얼굴" 블록 설정. 경우 작은 행진 또는 눈물 섹션에 걸쳐, 좀 더에서 대기는 cryostat 온도 조정 자동으로 수정 될 때까지. 아래 조직으로 안티 롤을 열기 전에 몇 초를 계산 합니다.
- 즉시에 ITO 코팅 유리 슬라이드의 조직 조각을 놓습니다. ITO 코팅 된 측면에 슬라이드 아래 손가락을 넣어 조직 조각을 녹여. 조직은 슬라이드;에 충실 합니다. 조직 주름으로 가능한 평면 인지 확인 합니다. 실 온에서이 단계를 수행 합니다.
참고: 인간의 샘플 생물 학적 오염 물질을 포함 될 수 있습니다 때문에 장갑, 마스크, 그리고 실험실 가운 착용. 하루에 대 한 모든 섹션을 만들었습니다 때 cryostat, 브러쉬, 그리고 척 실험실 잎사귀와 200 mL 100% 에탄올의 청소.
- 조직 섹션을 rinsing
- 30 대 70% 에탄올의 40-100 mL에 샘플을 담가 생 지질 및 무기 염을 제거 하는 s. 항아리를 얼룩이 지는 유리를 사용 합니다.
- 30에 대 한 100% 에탄올의 40-100 mL와 함께 샘플을 씻어 s, 3 분, 40-100 mL의 30에 대 한 100% 에탄올에 대 한 Carnoy의 솔루션의 40-100 mL, 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA) 1 분의 40-100 mL 및 100% 에탄올 30 s. 사용 유리의 40-100 mL 항아리를 얼룩.
참고: Carnoy의 솔루션은 정착 액 6 부품 에탄올, 아세트산 세 부분, 한 부분 클로 프롬의 구성. - 30 분 동안 진공에서 건조.
- 부검 결과 뇌 조직에서 Aβ 단백질의 더 나은 이온화에 대 한 포 름 산 수증기를 가진 조직 단면도의 치료
- 100% 포 름 산의 5 mL와 함께 후속 증발에 사용할 오븐 및 외피 유리 슬라이드를 준비 합니다. 만족 스러운 산 성 치료를 위해이 단계를 통해 채도 수준에서 부 화 유리 접시에 공기 습도 유지 하 고 60 ° c.에 온도 유지 조직 슬라이드 외피 유리 접시에 포 름 산에 침수를 피하고 있는 동안 놓고 6 분에 대 한 치료.
- 필름 스캐너, 젤 스캐너를 사용 하 여 샘플의 광학 이미지 또는 실 온에서이 단계를 수행 하는 디지털 현미경, 등 . 샘플의 광학 이미지의 맞춤은 샘플 대상 악기 배치는 경우에 필요 합니다. 일반적으로, 그것은 매트릭스 레이어 아래 조직 단면도 인식 가능한 되지 않습니다.
참고: 광학 이미지를가지고 하는 가장 편리한 방법은 사무실 스캐너를 사용 하는 것입니다. 그것은 영상 데이터 저장 폴더에 이미지를 저장 하는 것이 좋습니다. - 광학 이미지 샘플 연관, 광학 이미지와 카메라 광학에서 매트릭스 레이어 아래에 표시 되는 안내 표시를 확인 합니다. 가장 쉬운 방법은 광학 이미지를 복용 하기 전에 자리 적어도 3 개의 교정 유체 표시 샘플 것입니다.
- 매트릭스 응용 프로그램
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매트릭스 솔루션의 준비
- 유기 용 매에 강한 microtube에서 준비 10 mg/mL SA 솔루션 50% 이기 (ACN) 및 0.1 %TFA. 철저 하 게 vortexing 또는 사용까지 10 분 게 실 온에서 솔루션에 대 한 간단한 쥡니다 복합 SA 해산.
참고: 매트릭스 살포에 대 한 세 가지 다른 옵션이 있습니다:에 어 브러시, 초음파 분무기 또는 자동 분무기를 사용 하 여.
- 유기 용 매에 강한 microtube에서 준비 10 mg/mL SA 솔루션 50% 이기 (ACN) 및 0.1 %TFA. 철저 하 게 vortexing 또는 사용까지 10 분 게 실 온에서 솔루션에 대 한 간단한 쥡니다 복합 SA 해산.
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에어브러쉬와 매트릭스를 분사
- 일정 한 실내 온도 (20-23 ℃)와 습도 (40%-60%)에서 작업을 수행 합니다. 최적의 분사에 대 한 조정 매개 변수는 작은 물방울의 크기, 안개, 각도 및 스프레이 노즐 및 조직 섹션 실험실 온도 습도 간의 거리의 양을 포함 한다. 현미경 검사 결과 확인 하 여 이러한 조건을 조정 합니다.
참고: 제한 요소 결정의 크기와 매트릭스 범위의 analytes의 바람직하지 않은 마이그레이션/확산 등으로 작은 방울 크기에 대 한 더 나은. 동질성 검사의 포인트 이기도합니다.
- 일정 한 실내 온도 (20-23 ℃)와 습도 (40%-60%)에서 작업을 수행 합니다. 최적의 분사에 대 한 조정 매개 변수는 작은 물방울의 크기, 안개, 각도 및 스프레이 노즐 및 조직 섹션 실험실 온도 습도 간의 거리의 양을 포함 한다. 현미경 검사 결과 확인 하 여 이러한 조건을 조정 합니다.
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매트릭스는 초음파 분무기로 분사
- 제거는 desiccator에서 살포 될 챔버에 배치 하는 조직. 조직 센서 창 취재는 다는 것을 확인 하십시오.
- 시작 버튼을 누르면 준비를 시작 일반적으로, 준비 시간은 약 90 분입니다. 준비는 매트릭스 레이어 두께 촉촉한의 모니터링을 통해 자동으로 통제 될 것 이다. 준비 완료 된 후 슬라이드를 제거 하 고 MALDI 악기에 그것을 읽기 전에 15 분 동안 desiccator에 저장.
- 2-3 mL 100 %MeOH 스프레이 헤드 나타날 때까지 청소와 스프레이 청소.
참고: 매트릭스 물방울의 정밀한 안개 시트를 중력에 의해 조직에 싱크대를 허용 됩니다. 20 μ m의 평균 작은 물방울 크기 생성 됩니다; 모든 작은 물방울 지름 50 μ m입니다.
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매트릭스는 자동 분무기로 분사
- 자동 분무기와 조직 표면에 매트릭스 솔루션 스프레이. 열띤된 칼 집 가스 (N2, 10 psi와 75 ° C에 설정)의 상수 flow conjointly 매트릭스 솔루션 스프레이 함께 배달 됩니다. 솔벤트 펌프 시스템 (10 psi 및 0.15 mL/min에서 설정)를 사용 하 여 행렬 솔루션을 제공.
참고: 캐비닛을 매트릭스에 어로 졸의 어떤 흡입을 피하기 위해 안전에서 가장 중요 한 것은, 작동 합니다. 실내 온도 습도 균질 매트릭스 화 재현을 제어 합니다.
- 자동 분무기와 조직 표면에 매트릭스 솔루션 스프레이. 열띤된 칼 집 가스 (N2, 10 psi와 75 ° C에 설정)의 상수 flow conjointly 매트릭스 솔루션 스프레이 함께 배달 됩니다. 솔벤트 펌프 시스템 (10 psi 및 0.15 mL/min에서 설정)를 사용 하 여 행렬 솔루션을 제공.
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매트릭스 솔루션의 준비
2입니다. MALDI-IMS
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초고속 질량 분석을 수행 합니다.
- MALDI-IMS 10 kHz nd: yag 장비와 높은 처리량과 높은-해상도 이미징 실험을 수행 (355 nm) 레이저.
- 질량 분석 측정을 위해 MALDI 제어 소프트웨어 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 조직 영역을 정의 합니다.
- M/z 2000-20000의 질량 범위와 긍정적인 선형 모드에서 스펙트럼 그리고 20, 100 µ m의 공간 해상도 얻을.
- 표준 보정을을 분해 펩 티 드 교정 표준 및 TA30 솔루션에서 알파-Cyano-4-히 드 록-cinnamic 산 (CHCA) 1: 4의 비율로 표준 단백질 교정 (ACN:0.1% TFA과 =) 다음 그것을 희석 하 고 10 배. 교정의 1 μ 표준 4 개의 서로 다른 위치에 슬라이드에 배치 합니다.
- 분자 조직학 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 다른 Aβ 펩 티 드 SPs와 동맥 벽에 colocalizing 같은 다양 한 신호의 공간 상관 관계를 찾을 수 여러 개의 단일 이미지 오버레이.
3입니다. 데이터 처리
- 스펙트럼의 정렬에 대 한 이전 게시21에서 선택한 m/z 목록에 모든 스펙트럼을 맞춥니다.
- 통계 분석 소프트웨어에 MALDI IMS 데이터 세트 가져오기 ( 재료의 표참조) 초기 빼기와.
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관심 (ROIs) 조직학 지식에 따라 영역을 추적 합니다.
- 일변량 분석 수행 평균 농도, 표준 편차에 대 한 m/z 값을 colocalized 구별 m/z-마커 (ROC 분석), 가설 테스트, 그리고의 발견의 잠복.
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세그먼트화 지도를 만듭니다.
- 큰 데이터 집합 및 기본 동향의 추출에 대 한 구성 요소 분석의 공간 분할에 대 한 자동된 변수 분석을 수행 합니다.
- 해 부 ROIs 실질 등 거미 막 밑 공간 조직학 특징에 따라 선택 합니다.
- 개별 ROIs 구조를 할당 하 고 처리 된 MS 데이터 영역의 이미지 세분화 허용 관련된 펩 티 드를 확인 하기 위해 그들을 연관.
Representative Results
CAA 산발적 광고 환자 (n = 5; 나이 의미 83.2 = y) 과목 무료 (SP O)와 CAA 치 패를 세 (n = 5; 나이 의미 77.2 = y) 했다 분석 (표 1). 환자 # 3의 CAA 고기가이 연구에서 가장 눈에 띄는 했다. Aβ1-40와 # 3의 환자에서 뇌 조직에서 Aβ1-42 예금의 배포판 MALDI-IMS (그림 1)와 시각화 했다. 그림 1에서 보듯이 nonpathological 제어 두뇌 (환자 # 9와 #10)에 아무 중요 한 신호 했다. 여기, MALDI IMS 명확 하 게 시각 Aβ1-42 대뇌 실질에 SPs로 우선적으로 예금 되었다. 대조적으로, 짧은 Aβs, 1-41, Aβ1-36 등 우선적으로 환자의 혈관 영역 (그림 1)에 예금 되었다.
Aβ40 및 Aβ42의 배포판 했다 IHC 조직의 인접 한 냉동된 섹션을 사용 하 여 함께 추가 검증 됩니다. 안티-Aβ40 항 체 SPs로 대뇌 실질에 Aβ42의 배포에 명확한 대조에서 CAA ( 그림 2B에서 화살표), 표시. Aβ1-41, 우리는 먼저 인간의 두뇌에서이 부분을 감지 하 고 우리 Aβ41 Aβ40 andAβ4221에서 차별화 수 있는 특정 항 체를 생성 합니다.
MALDI-IMS의 공간 해상도 일반적으로 향상 시킬 수 가장 중요 한 요소. 그림 1 과 그림 2 에서 100 µ m 피치 해상도 MALDI-IMS를 보여 고 비교적 광역21에 대 한 전반적인 배포 프로필. 아 밀 로이드 증 착 혈관 구조를 포함 한 거미 막 밑 공간에 정확 하 게 정의 하는 것이 어렵습니다. 거미 막 밑 혈관의 미세 조직 구조와 피 질, 표면 묘사 고해상도 MALDI 이미징 (40 µ m: 그림 3; 20 µ m: 그림 4 및 그림 5) 수행 되었다. 그 결과, MALDI IMS는 명확 하 게 그 짧은 Aβs, 1-41, Aβ1-36 등는 배포, 동맥의 벽에는 IHC와 비교 시연 했다.
MALDI IMS 시연 Aβx-40와 Aβx-42의 상세한 배포판 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 11pE) 적당 한 CAA 두뇌와 함께 하는 광고에. 예를 들어 Aβx-40 종 Aβ1-40 비슷한 분포 프로필을 보여주었다, 그러나 Aβx-42 종 Aβ1-4221다른 배포 패턴을 보였다. 현재 프로토콜을 통해 개별 Aβ 펩 티 드 MALDI IMS와 관찰의 단일 이온 이미지 Aβ 종에 할당 됩니다. 반면, 이미지 정의 되지 않은 단백질의 추가 분석에 대 한 관심의 해 부 지역 이미지 세분화를 얻기 위하여 자율된 다변량 통계를 사용 하 여 데이터를 조사 수 있습니다 인수. 그림 5 표시 세분화 지도 얻은 bisecting k-평균 분석 #3 환자21에서 같은 섹션에 적용 합니다. 이 클러스터링 메서드는 성공적으로 ( 그림 5C에 파란색) 실질에 플 라크와 같은 구조와 거미 막 밑 공간 ( 그림 5C에 녹색)에서 혈관 구조 확인. 실질, 실질, 뿐만 아니라 거미 막 밑 공간 ( 그림 5C에 보라색)에서 작은 되 돌면 감지 되는에 작은 원형 영역을 찾을 수 흥미롭습니다. 이 이러한 그림 5D에 개별 Aβ 펩 티 드의 단일 이온 이미지에 의해 확인 된다-5 층.
그림 1: 고정된 광고/CAA의 MALDI-IMS 뇌 섹션. 다양 한 단자 잘린 Aβ 심각한 CAA (환자 #3)를 동반 하는 광고에 펩 티 드 오른쪽 패널에서 왼쪽된 패널 및 컨트롤 (오른쪽 모든 이미지에서 왼쪽에 #10 환자에 환자 #9)에서 시각화 됩니다. Aβ1-Aβ1-41 36는 Aβ1-42와 Aβ1-43는 입금 대뇌 실질에 치 패로 #3, 동안 거기 아무 신호 제어 환자의 두뇌 (# 9와 # 10의 경우) 경우에 하는 동안 환자의 혈관에 우선적으로 입금 됩니다. 해상도 = 100 μ m. 눈금 막대 = 5 mm. 이 그림은가 쿠 다 외.21에서 허가로 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: MALDI-IMS 냉동된 광고/CAA의 섹션 및 인접 한 부분의 광고 두뇌에서 후 두 피 질 뇌. (A - C)는 냉동된 광고/CAA 뇌 섹션 광고 두뇌에서 후 두 피 질 (D 및 E) 인접 섹션 면역 스테인드 그리고 되 고 Aβ40에 대하여 항 체를 사용 하 여 뇌 실질에 초점을 맞춘 (d: BA27) 또는 Aβ42 (E: 안티-Aβ42 polyclonal). 두 분석 시연 Aβ40 우선적으로 환자의 혈관 (패널 D에 화살표)과 거미 막 밑 공간에 CAA를 형성 하는 뇌 실질 arterioles에 입금 됩니다. 반면, Aβ42은 SPs에 주로 예금 된다. IMS, 해상도 대 한 100 μ m =. 눈금 막대 5 m m (A, B및 C) = = 5 mm, 500 (D 및 E). 이 그림은가 쿠 다 외.21에서 허가로 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 냉동된 광고/CAA의 MALD IMS 뇌 섹션 (#3 환자) 40 µ m의 해상도에. 다양 한 단자 및 N 맨끝 잘리고 심각한 CAA (환자 #3) 동반 광고 Aβ 펩 티 드를 수정. Aβ1-Aβ1-41 36는 Aβ1-42와 Aβ1-43 치 패로 대뇌 실질에 입금 됩니다 동안 환자의 혈관에 우선적으로 입금 됩니다. 스케일 바 = 1 m m (A-B), 2 mm (왼쪽 위). 해상도 40 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: MALDI-IMS 냉동된 광고/CAA의 뇌 섹션 (#3 환자) 20 µ m의 해상도에. 이 패널에는 다양 한 단자 및 N 맨끝 잘리고 수정 Aβ 펩 티 드 광고 심각한 CAA (환자 #3)를 함께 보여줍니다. Aβ1-Aβ1-41 36는 Aβ1-42와 Aβ1-43 치 패로 대뇌 실질에 입금 됩니다 동안 환자의 혈관에 우선적으로 입금 됩니다. 스케일 바 = 200 μ m (a, b, c) 1 mm (왼쪽 위). 해상도 = 20 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 세분화 지도, MALDI-IMS 냉동된 광고 뇌 섹션의에 의해 얻은 putative 치 패, 큰 거미 막 선박 구조 및 작은 parenchymal arterioles 보여준다. (A) 세분화 지도 MALDI IMS 데이터의 복수 이미지 분석에서 얻은. (B) Bisecting k-의미 기반된 클러스터링 분석 후 두 피 질에 플 라크와 같 및 선박 모양의 구조를 식별 합니다. 클러스터 및 콘텐츠의 그들의 관계 (e.g.,1-0-0) 노드로 표시 됩니다. (C) 뚜렷한 Aβ 펩 티 드 지역화 패턴 패 (파란색)를 닮은 거미 막 (녹색), 선박과 되 (레드) 구조. 참고 몇 가지 빨간색 클러스터 또한 거미 막 밑 공간에 배포 됩니다. 이 이러한 개별 Aβ 펩 티 드 20 µ m 해상도 단일 이온 이미지를 확인: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41, 그리고 (F) Aβ 1-42. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 케이스 | 성별 | 죽음에 나이 | Braak SP | CAA |
| 1 | M | 83 | C | 0.5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
표 1: CAA의 경우와 세 SP O 주제 광고의 임상 및 병 적인 데이터. IMS와 IHC 인간의 대뇌 피 질의 표본 도쿄 수도권 노인 연구소에서 두뇌 은행에서 얻은 했다. 각 뇌 견본 5 광고 환자와 5 나이 일치 하는 컨트롤의 후 두 피 질에서 찍은. Aβ 단일 클론 항 체에 의해 같이 아 밀 로이드 증의 정도 Braak SP (아 밀 로이드) 단계에 의해 정의 되었다. O 단계에는 isocortex에 걸쳐 거의 없는 치 패 있다. C 단계에서 거의 모든 isocortical 지역 영향을 받습니다. 광고는 하지 변수 단계 c. 이 테이블은가 쿠 다 외.21에서 허가로 수정 되었습니다.
Discussion
여기 우리가 보여주는 상세한 프로토콜 및 Aβ 및 그것의 isoforms의 시각화의 결과와 여러 autopsied 두뇌에서 고 MALDI IMS와 CAA. Aβs의 증 착 프로 파일 N 및 C 터미널 유사 하 Aβ1-42에서 크게 변경 되었습니다. Aβ1-41 처음 확인 하 고 현재 프로토콜 인간의 두뇌 시각 IHC21추가 확인 했다. 고해상도 분석 (20 μ m)와 IMS에 의해 예금 된 Aβ의 형태 IHC와 좋은 계약에 있어야 고려, IMS와 IHC 동등 하 게 기여할 Aβ 예금 그들의 형태학에 의해 뿐만 아니라 그들의 위치 및 단백질 내용에 의해 구별. 여기에 설명 된 전체 실험을 후 두 피 질에서 실시 했다로 종 베타-아 밀 로이드의 지역화 모든 두뇌 지역에 걸쳐 공부 하 고 현재 프로토콜을 사용 하 여 미래 실험 일반화 될 것입니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 인간의 뇌 조직에 집계 된 단백질의 효과적인 이온화를 조직 준비 단계. 매트릭스 레이어 레이저 에너지 흡수와 탈 착 및 analytes의 이온화를 유도 해야 합니다. 이 과정에서 전체 조직 섹션은 균질 작은 결정으로 입힌 다. 매트릭스와 분석의 균질 성 cocrystallization은 높은 감도 및 유물-무료 이미지에 대 한 중요 합니다. 3 스프레이 방법의 각각 그것의 자신의 이점이 있다. 수동 스프레이 코팅 가장 자주 사용 되는 방법 중 하나입니다. 에어브러쉬는 편리한; 그러나, 그것은 숙련 된 작업을 요구 한다. 정확 하 고 재현성 실험 기술은 필수적으로, 현재 프로토콜에 설명 된 대로 초음파 분무기 / 자동 분무기를 사용 하 여 것이 좋습니다. 초음파 분무기에 관하여 그것 것입니다 하지 의해 좌우 될 방의 온도 습도 챔버로 분사 하기 때문에. 한편, 자동 분무기와 상대적으로 보존된 공간 해상도 좋은 재현성이 얻어진 다. 일반적으로, 공간 해상도 1) 에어브러쉬, 2) 자동 장치, 및 3) 초음파 분무기의 순서로 세 가지 방법 증가 함께 얻을.
가장 중요 한 것은,이 프로토콜은 원래 감지 하 여 뇌 위해 샘플에서 Aβs를 시각화 생성 됩니다. 인간의 애플 리 케이 션의 스웨덴 형 변이에 따라 광고의 동물 모델로 생성 APP23 마우스, MALDI IMS와 Aβs의 시각화는 기존 방법18,19다른 사람에 의해 이전 보고 되었다. 그러나, APP23에 적용 이전 프로토콜의 수평 해상도 감도에 Aβ를 시각화 충분 하지 않았다. 이전 작품의 조직 경계 밖에 서 높은 Aβ 농도 명확 하 게 그들의 프로토콜18,19이미지 APP23에 아티팩트를 논의 했다. 즉, 소위 '흐림' 진짜 SPs와 IMS 사이 때문에 매트릭스 추출 단계 이미지 불가피 했다 MALDI 형 영상으로. 그러나, 현재 프로토콜에서 흐림 사라졌다 하 고 각 스펙트럼 표시 모든 단일 SP 뇌 실질에 키를 누릅니다.
우리 광고에 처음으로 Aβ1-41를 추적할 수 있습니다 같이, 및 우리의 자신의 세대21에 의해 특정 항 체와 CAA 두뇌 MALDI-IMS, 뿐만 아니라 IHC. Aβ 처리 모델 Aβ1-38에서 파생 Aβ1-45를 통해 Aβ1-42, Aβ1-41 γ-secretase stepwise 분열27,,2829,30,31 Aβ1-45에서 파생 하는 동안 . 즉, 현재 프로토콜이이 모델을 지원 합니다. 이 기술의 한계에 관해서는 우리 인간의 부검 뇌에서 샘플의이 질을 고려해 야 합니다. 윤리적 증명 된 부검 뇌 조직을 평가 하는 의미에서 가장 중요 한 단계가입니다. 그 자격 갖춘된 부검 뇌 조직에는 현재 프로토콜, MALDI IMS 개별적으로 여러 개의 수정으로는 아직 알 수 없는 factor(s) 광고의 병 인을 규제 하는 데 복잡 한 분자의 전체 배포를 추적할 수 있습니다. 정의. 또한, 세 인간의 두뇌에 다양 한 neuropathology의 전반적인 병 인을 이해, 그것은 신경 질환에서 임상, 유전, 및 병 적인 관찰과 함께에서 표준 접근 방식으로 MALDI-IMS 채택 가능한 되어야 합니다. .
MALDI IMS의 또 다른 중요 한 단계가입니다 얻은 데이터 집합에서 데이터 마이닝 프로세스에서 항상 시간이 걸리는. 각 피크 배포의 수동 데이터 마이닝은 사용자가 모든 이미지를 통해 클릭 분석된 샘플의 형태 연관 수 있습니다 배포판을 찾고 필요 합니다. 자동 공간 분할은 데이터 마이닝, 데이터 집합에 대 한 개요를 제공 하 고 저명한 특징의 신속한 검출을 허용의 첫 번째 단계로 사용할 수 있습니다. 이 방법에서는, 주어진 영역의 스펙트럼 사이 유사점이 통계적으로 결정 하 고 유사한 스펙트럼 하나의 클러스터로 그룹화 됩니다. 모든 픽셀은 색으로 구분 된 그들의 클러스터 할당 (그림 5)에 따라. 현재 광고/CAA 연구에서 관심 분야는 parenchymal 패와 거미 막과 parenchymal 혈관 구조에서 Aβ 증언의 공간입니다. IHC 검증 추가 했다 2 개의 독특한 봉우리 Aβ1-40와 Aβ1-4221에서 m/z 값을 했다. 따라서, Aβ1-40와 Aβ1-42는 이미 추가 분석에 대 한 알 수 없는 펩 티 드로 서 N-및 C 터미널에 주석된 잘린된 Aβ colocalized m/z를 찾을 수 쉽습니다.
웰 러와 동료 Aβ 동맥 주위 혈관21보다 더 주위 혈관 벽에 축적 하는 것을 보고 있다. 또한, 그것은 제안 되었습니다 중간 유체 (ISF) Aβs는 림프절을 통해 혈관 주위 배수 통로22,,2324,25에 뇌 실질에서 배설을 포함 ,26. 20 µ m 해상도 MALDI IMS 데이터 집합에 따라 세분화 지도 생성 하기 위해 현재 프로토콜 지원 광고21 에 CAA에 크게 공헌 하는 (그림 5), 뇌의 혈관 주위 배수 경로의 가능한 실존 , 32. 또한, 우리 각 m/z 값의 상관 관계를 계산 하 여 플 라크와 거미 막 맥 관 구조 colocalized 마커 단백질을 발견할 수 있습니다. 세 인간 두뇌에 다양 한 neuropathology의 전반적인 병 인을 이해, 임상, 유전자의 설립된 IHC 데이터와 함께 강력한 접근으로 MALDI-IMS 및 신경에 병 적인 관측 채택 가능한 되어야 합니다. 질병입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 의해 부분적으로 지원는 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 분야 (뇌 단백질 노화와 치 매 제어 26117004; 미시건을 T.M.). 이 연구는 부분적으로 의료 연구 및 개발 (아메드) 일본 기관에서 뇌 과학에 대 한 전략적 연구 프로그램에 의해 지원. 모든 실험은 도착 지침에 따라 실시 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
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