Summary
يسمح التصوير الجزيئي مع الليزر ساعد مصفوفة على الامتزاز/التأين التصوير الطيف الكتلي (استخدام نظام الرصد الدولي) تعيين تحليلها متعددة متزامنة في العينات البيولوجية. نقدم هنا، بروتوكولا للكشف والتصور لبروتين بيتا اميلويد في أنسجة الدماغ من مرض الزهايمر وعينات أنجيوباثي اميلويد الدماغي استخدام استخدام نظام الرصد الدولي.
Abstract
أمراض الأعصاب مرض الزهايمر (AD) تتسم بالتراكم والتجميع من الببتيدات اميلويد بيتا (Aβ) إلى خارج الخلية لويحات الدماغ. الببتيدات Aβ، مؤلفة من 40 من الأحماض الأمينية، تتولد من بروتينات اميلويد السلائف (التطبيق) من سيكريتاسيس β و γ. وتودع Aβ ليس فقط في حمة الدماغي ولكن أيضا في ليبتومينينجيل وجدران الأوعية الدماغية، المعروف باسم أنجيوباثي اميلويد الدماغي (هيئة الطيران المدني). وبينما تم تحديد مجموعة متنوعة من الببتيدات Aβ، مفصلة إنتاج وتوزيع من الببتيدات Aβ الفردية في الأنسجة المرضية للإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات لم تعالج تماما. هنا، علينا وضع بروتوكول لليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-تعتمد التصوير الكتلي (استخدام نظام الرصد الدولي) في أنسجة المخ البشري تشريح الجثة للحصول على رسم خرائط شاملة البروتين. ولهذا الغرض، تم الحصول على العينات القشرية البشرية من البنك الدماغ في "معهد طوكيو متروبوليتان لعلم الشيخوخة". كريوسيكشنز المجمدة هي قطع ونقلها إلى الإنديوم-تين-أكسيد (إيتو)-المغلفة الشرائح الزجاجية. أطياف يتم الحصول عليها باستخدام نظام استخدام بدقة مكانية تصل إلى 20 ميكرومتر. حمض سينابينيك (SA) هو شكل موحد المودعة على الشريحة باستخدام بخاخ يدوي أو تلقائي. مع مزايا التقنية الحالية لاستخدام نظام الرصد الدولي، يمكن الحصول على مجموعة بيانات نموذجية من مختلف الأنواع Aβ داخل نفس المقاطع للعقول البشرية تشريحها دون تحقيقات محددة. وعلاوة على ذلك، عالية الدقة (20 ميكرومتر) تصوير الدماغ الإعلانية والالتهاب الجهاز المركزي للمحاسبات نموذج يبين بوضوح أن Aβ1-36 إلى Aβ1 41 ترسبت في سفن ليبتومينينجيل، بينما Aβ1-42 و Aβ1 43 أودعت في حمة الدماغي كلوحة خرف (SP). أنه من الممكن اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي باعتباره نهجاً موحدا في تركيبة مع الملاحظات الإكلينيكية والوراثية والمرضية في فهم علم الأمراض الإعلانية، والجهاز المركزي للمحاسبات، وغيرها من الأمراض العصبية استناداً إلى الاستراتيجية الحالية.
Introduction
لإجراء التشخيص وفهم الآلية المرضية لاضطرابات الأعصاب، هو تحديد دقة الجزيئية للرواسب المرضية الأساسية1. أثناء الإعلان، Aβ يتم إنتاجه لجعل الصحة والصحة النباتية في حمة الدماغي والمودعة في سفن قبل وقت طويل من المرض بداية2،3،4،،من56. بينما Aβ1-42 هو الببتيد الغالبة في SP للعقول الإعلانية، متغيرات Aβ الأخرى، مثل الطرفي ن أو ج-محطة اقتطاع أو تعديل Aβs، كما حددت في المتضررة الإعلانية العقول7،،من89، 10. صورة كاملة الأنواع طائفة واسعة من Aβ في العقول البشرية، لا سيما مع إعلان والدماغي سوف تساعد أنجيوباثي اميلويد (الجهاز المركزي للمحاسبات)11، العلماء على فهم إنتاج Aβ والايض، وترسب.
وقد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) كالنهج التقليدي لأمراض الأعصاب، الأسلوب الأكثر حاسمة لتحديد موقع Aβs في الدماغ الأنسجة12،13،،من1415. وبصفة عامة، لا يميز المدينة الجزيئات عندما [ابيتوبس] عدة تتعايش في نفس الوقت. على النقيض من ذلك، يتم تحليل البروتين البشري الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي ناشئة نهجاً قيمة خاصة بالنسبة لتحليل مجموعة متنوعة من أنواع Aβ في أنسجة المخ، الذي لا يمكن أن تكون متباينة مع الأجسام المضادة16،17. فشل الكشف طفيفة Aβ الببتيدات التحليل الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي التقليدي ليساتيس الدماغ وعينات عجلت المناعية ويفقد توزيع المعلومات Aβ في أنسجة المخ.
في أعمال سابقة، تصور رواسب Aβ في أدمغة الفأر قد نجح باستخدام نموذج حيوانات المحورة وراثيا من الإعلان، مثل APP23. ومع ذلك، تحتاج هذه العملية لا يزال التقدم التقني لمقارنة نظام الرصد الدولي والمدينة فيما يتعلق بالقرار وحساسية18،،من1920. ينبغي دراسة أمراض الأعصاب الإعلانية على العقول البشرية، واستخدمنا تكنولوجيا استخدام نظام الرصد الدولي على أنسجة المخ البشري تشريح الجثة للحصول على رسم خرائط شاملة البروتين21. ولهذا الغرض، قمنا بتطوير بروتوكول لنوع متقدم من الطيف الكتلي له مزايا في سرعة وحساسية، وإمكانية تكرار نتائج.
Protocol
هنا، تم جمع عينات الأنسجة في مستشفى المسنين العاصمة طوكيو، الذي يوفر الخدمات الطبية المجتمعية للسكان المسنين في اليابان. وسجلت عينات تشريح الدماغ المستخدمة في الدراسة المصرف الدماغ لبحوث الشيخوخة (BBAR) بموافقة مستنيرة من أقارب المتوفى. BBAR هو أقرتها اللجنة الأخلاقيات مستشفى طب الشيخوخة في العاصمة طوكيو ومعهد علم الشيخوخة. لجميع العقول مسجلة في البنك الدماغ، حصلنا على الموافقات المستنيرة الخطية لاستخدامها في البحوث الطبية من المرضى أو أفراد أسرهم. ووضعت المرضى في غرفة الباردة (4 درجة مئوية) ضمن ح 2 بعد الإعدام تقليل التغييرات تشريح الجثة في الدماغ. جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة دوشيشا ومصرف الدماغ لبحوث الشيخوخة ومستشفى طب الشيخوخة في العاصمة طوكيو ومعهد علم الشيخوخة.
1. إعداد مقاطع الأنسجة لنظام الرصد الدولي
- تجهيز عينات أنسجة الدماغ البشري أوتوبسييد
ملاحظة: تأكد من أن الخطوة إعداد نموذج لنظام الرصد الدولي يحافظ على الحالة الأصلية للأنسجة. تجنب إجراء تغييرات على التلوث وبعد الوفاة. الخطوة التالية الحاسمة.- الحصول على العينات البشرية القشرية لنظام الرصد الدولي من العقول التي كانت إزالة ومعالجتها وتخزينها في-80 درجة مئوية داخل ح 8 تشريح الجثة. أخذ العينة المخ من قشرة والقفويه المرضى الإعلانية وعناصر مطابقة سن21.
- إعداد مقاطع الأنسجة المجمدة
- قطع المقاطع النسيج في كريوستات. ضع الشرائح الزجاجية مجهر المغلفة إيتو موصلة داخل كريوستات21.
- الحارة العينة الدماغ تشريح الجثة من-80 درجة مئوية إلى-22 درجة مئوية داخل كريوستات.
- إرفاق شفرة المتاح جديدة كريوستات لكل تجربة. دائماً في محاولة لاستخدام جزء نظيف من النصل.
- وضع العقول تشريح الجثة المجمدة على المسرح جنبا إلى جنب مع كمية صغيرة من أكتوبر مجمع (ما يكفي لتغطية المنطقة الوسطى في المرحلة؛ انظر الجدول للمواد).
- اختر شروط تمزيقها رقيقة. لنظام الرصد الدولي، استخدام سمك من 10-12 ميكرومتر لأقسام الدماغ البشري. لنظام الرصد الدولي، والمدينة، قطع خمسة إلى ستة أقسام من كل عينة الأنسجة.
- عندما النصل هو مجرد بداية لقطع الأنسجة، دورة عجلة القيادة و "الوجه" الكتلة حتى يتعرض لها كل من الأنسجة. إذا كان هناك أحد الانتصارات الصغيرة أو المسيل للدموع عبر المقطع، انتظر قليلاً أكثر في كريوستات حتى تعديل درجة الحرارة تلقائياً يصلح له. عد بضع ثوان قبل فتح لفة المضادة مع أنسجة تحتها.
- فورا مكان الشريحة الأنسجة على الجانب المغلفة إيتو من الشريحة الزجاجية. ذوبان الجليد شريحة الأنسجة عن طريق وضع إصبع تحت الشريحة على الجانب غير المغلفة إيتو. سوف تتمسك الأنسجة إلى الشريحة؛ ضمان أن الأنسجة مستوية قدر الإمكان مع لا التجاعيد. تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ارتداء القفازات والأقنعة ثوب مختبر للعينات البشرية التي قد تحتوي على ملوثات بيولوجية. عند كافة المقاطع أدخلت اليوم، نظيفة كريوستات، فرش، وتشكس مع المسحات المختبرية و 200 مل من الإيثانول 100%.
- أقسام الأنسجة الشطف
- تزج العينات في 40-100 مل إيثانول 70% لمدة 30 ثانية لإزالة الدهون الذاتية وأملاح غير عضوية. استخدام زجاج تلطيخ جرة.
- تغسل العينات مع 40 – 100 مل إيثانول 100% لمدة 30 ثانية، 40 – 100 مل من محلول في كارني 3 دقيقة، 40 – 100 مل من الإيثانول 100% لمدة 30 ثانية، 40 – 100 مل حامض trifluoroacetic 0.1% (تفا) لمدة 1 دقيقة، و 40 – 100 مل من الإيثانول 100% للاستخدام س. 30 كوب تلوين جرة.
ملاحظة: الحل في كارني مثبت تتألف من ستة أجزاء الإيثانول وحمض الخليك ثلاثة أجزاء كلوروفورم جزء واحد. - الجافة في فراغ لمدة 30 دقيقة.
- العلاج أقسام الأنسجة مع بخار حمض الفورميك لتأين أفضل من البروتينات Aβ من أنسجة المخ تشريح الجثة
- إعداد الشريحة زجاج الفرن وحضانة لاستخدامها للتبخر اللاحقة مع 5 مل من حمض الفورميك 100%. لتحقيق لعلاج حمض مرضية، والاحتفاظ بالرطوبة الجوية في صحن زجاج الحضانة على مستوى التشبع في جميع أرجاء هذه الخطوة والحفاظ على درجة الحرارة عند 60 درجة مئوية. ضع شرائح الأنسجة في صحن زجاج الحضانة مع تجنب غمر في حامض الفورميك، وعلاج لمدة 6 دقائق.
- أخذ صورة ضوئية من العينات استخدام الماسح الضوئي الفيلم، وجل الماسح الضوئي، أو المجهر الرقمي و ما إلى ذلك تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة. محاذاة الصورة الضوئية للعينات من الضروري عند وضع الهدف عينة داخل الصك. عادة، لن يمكن الاعتراف بقسم الأنسجة تحت الطبقة مصفوفة.
ملاحظة: الطريقة الأكثر ملاءمة التقاط صورة ضوئية استخدام ماسح ضوئي مكتب. أنها لفكرة جيدة حفظ الصورة في مجلد تخزين بيانات التصوير. - لربط الصور الضوئية بالعينات، جعل دليل علامات تظهر في الصورة الضوئية، وتحتها طبقة المصفوفة في البصريات الكاميرا. أسهل طريقة بقعة التصحيح على الأقل ثلاث علامات السوائل حول العينة قبل أخذ الصورة الضوئية.
- تطبيق مصفوفة
-
إعداد مصفوفة الحل
- في microtube متسامحة مع المذيبات عضوية، تعد 10 ملغ/مل الحل SA في 50% الاسيتو الانيتريل (ACN)، و 0.1% تفا. دقة حل مجمع فورتيكسينج أو سونيكيشن قصيرة لأدنى 10 مخزن الحل في درجة حرارة الغرفة حتى استخدام SA.
ملاحظة: وهناك ثلاثة خيارات مختلفة للرش مصفوفة: استخدام بخاخة، وبخاخ الموجات فوق الصوتية، أو بخاخ تلقائي.
- في microtube متسامحة مع المذيبات عضوية، تعد 10 ملغ/مل الحل SA في 50% الاسيتو الانيتريل (ACN)، و 0.1% تفا. دقة حل مجمع فورتيكسينج أو سونيكيشن قصيرة لأدنى 10 مخزن الحل في درجة حرارة الغرفة حتى استخدام SA.
-
رش المصفوفة مع البخاخة
- تنفيذ العملية في درجة حرارة الغرفة ثابتة (20 – 23 درجة مئوية) والرطوبة (40%-60%). وتشمل المعلمات لضبط الرش المثلى لحجم الحبرية، ومقدار الضباب، والزاوية والمسافة بين فوهة الرذاذ وقسم الأنسجة، ومختبر درجة الحرارة والرطوبة. ضبط هذه الشروط بالتحقق من نتائج الفحص المجهري.
ملاحظة: تشمل العوامل التي تحد حجم البلورة والتجانس لتغطية المصفوفة والهجرة/نشر غير مرغوب فيها لتحليلها، أصغر أفضل بالنسبة لحجم قطره. التجانس هو أيضا نقطة التفتيش.
- تنفيذ العملية في درجة حرارة الغرفة ثابتة (20 – 23 درجة مئوية) والرطوبة (40%-60%). وتشمل المعلمات لضبط الرش المثلى لحجم الحبرية، ومقدار الضباب، والزاوية والمسافة بين فوهة الرذاذ وقسم الأنسجة، ومختبر درجة الحرارة والرطوبة. ضبط هذه الشروط بالتحقق من نتائج الفحص المجهري.
-
رش المصفوفة مع بخاخ الموجات فوق الصوتية
- إزالة الأنسجة رش من مجففة ووضعه في الدائرة. تأكد من الأنسجة لا يغطي الإطار الاستشعار.
- البدء في الإعداد بالضغط على زر التشغيل ؛ الإعدادية الوقت عادة حوالي 90 دقيقة. وسيجري تنظيم الإعداد تلقائياً عن طريق رصد سمك طبقة مصفوفة والرطوبة. بعد اكتمال الإعداد إزالة الشريحة وقم بتخزينها في مجففة لمدة 15 دقيقة قبل قراءته باستخدام أداة.
- تنظيف البخاخ مع 2 – 3 مل من 100 ٪ نظيفة ميوه حتى يظهر رئيس رذاذ.
ملاحظة: مسموح غرامة ضباب من قطرات مصفوفة تغرق في الأنسجة بورقة جاذبية. يتم إنشاؤها على حجم متوسط قطره من 20 ميكرومتر؛ جميع أقطار الحبرية أقل من 50 ميكرومتر.
-
رش المصفوفة مع بخاخ التلقائي
- رش محلول المصفوفة على سطح النسيج مع بخاخ تلقائي. وسيتم تسليم flow مستمر من غمد مدفأة الغاز (N2، تعيين في هذه المبادرة 10 و 75 درجة مئوية) مربوط برذاذ حل مصفوفة. استخدام نظام ضخ المذيبات (تعيين في 10 من هذه المبادرة وهي 0.15 مل/دقيقة) لتقديم حل المصفوفة.
ملاحظة: الأهم من ذلك، العمل في إطار سلامة مجلس الوزراء لتجنب أي استنشاق هباء مصفوفة. التحكم في درجة حرارة الغرفة والرطوبة إعادة بلورة مصفوفة متجانسة.
- رش محلول المصفوفة على سطح النسيج مع بخاخ تلقائي. وسيتم تسليم flow مستمر من غمد مدفأة الغاز (N2، تعيين في هذه المبادرة 10 و 75 درجة مئوية) مربوط برذاذ حل مصفوفة. استخدام نظام ضخ المذيبات (تعيين في 10 من هذه المبادرة وهي 0.15 مل/دقيقة) لتقديم حل المصفوفة.
-
إعداد مصفوفة الحل
2-استخدام نظام الرصد الدولي
-
أداء السرعة الطيف الكتلي.
- القيام بتجارب التصوير الفائق واستبانة مكانية عالية باستخدام نظام الرصد الدولي مجهزة nd: yag 10 كيلوهرتز (355 نانومتر) ليزر.
- لقياس الطيف الكتلي، تحديد مجالات الأنسجة باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة استخدام وبرامج تحليل البيانات.
- الحصول على الأطياف في وضع خطي إيجابية مع نطاق شامل من m/z 2,000 – 20,000 وقرار مكانية من 20 و 100 ميكرومتر.
- لإجراء المعايرة القياسية، حل الببتيد المعايرة القياسية ومعايرة البروتين القياسي بنسبة 1:4 مع حمض ألفا-سينو-4-هيدروكسيل-سيناميك (شكا) في حل TA30 (تفا ACN:0.1% = 30:70) وتمييع ثم 10 x. ضع 1 ميكروليتر من المعايرة القياسية على الشريحة في أربعة مواقع مختلفة.
- استخدام البرمجيات الأنسجة الجزيئية (انظر الجدول للمواد)، تراكب صور مفردة متعددة لإيجاد العلاقة المكانية للإشارات المختلفة، مثل الببتيدات Aβ مختلفة كولوكاليزينج في الصحة والصحة النباتية وجدران الشرايين.
3-معالجة البيانات
- لمحاذاة الطيفية، محاذاة كافة الأطياف إلى قائمة مختارة m/z من منشور سابق21.
- استيراد مجموعة البيانات باستخدام نظام الرصد الدولي إلى برنامج التحليل الإحصائي (انظر الجدول للمواد) مع الطرح خط الأساس.
-
تتبع المناطق ذات الاهتمام (رويس) استناداً إلى المعارف النسيجي.
- إجراء تحليل وحيد المتغير لكثافة يعني، الانحرافات المعيارية، كشف التمييزية m/z-علامات (تحليل ROC) واختبارات الفرضية، واكتشاف كولوكاليزيد قيم m/z.
-
إنشاء مخطط تجزئة.
- إجراء تحليل متعدد المتغيرات غير خاضعة للرقابة لتجزئة المكانية لمجموعات البيانات الكبيرة وتحليل مكونات لاستخلاص الاتجاهات الأساسية.
- حدد رويس التشريحية على أساس الخصائص النسيجي، مثل حمة والفضاء تحت العنكبوتية.
- تعيين الهياكل رويس الفردية وربط لهم مع البيانات MS المجهزة بغية تحديد الببتيدات المرتبطة بها التي يسمح بتجزئة الصورة من المنطقة.
Representative Results
المرضى إعلانية متفرقة مع الجهاز المركزي للمحاسبات (n = 5؛ ومتوسط عمر = 83.2 y) والذين تتراوح أعمارهم بين المواضيع مع لوحة خرف الحرة (س س)، والجهاز المركزي للمحاسبات (n = 5؛ ومتوسط عمر = 77.2 y) كانت حلل (الجدول 1). تعمل هيئة الطيران المدني للمريض #3 كانت الأكثر بروزا في هذه الدراسة. وقد تصور توزيع Aβ1-40، ورواسب Aβ1-42 في أنسجة المخ من المريض #3 مع استخدام نظام الرصد الدولي (الشكل 1). كانت هناك لا إشارات هامة في مراقبة نونباثولوجيكال العقول (المرضى #9 و #10)، كما هو مبين في الشكل 1. هنا، تصور استخدام نظام الرصد الدولي ومن الواضح أن Aβ1-42 وأودع تفضيلي كالصحة والصحة النباتية في حمة الدماغي. على النقيض من ذلك، أودعت Aβs أقصر، مثل Aβ1-36 إلى 1-41، ترتبط بشكل تفضيلي في مجالات ليبتومينينجيل والأوعية الدموية (الشكل 1).
كذلك تم التحقق من صحة توزيعات Aβ40 و Aβ42 بالمدينة باستخدام المقاطع المجمدة المتاخمة للأنسجة. الأجسام المضادة Aβ40 تسمية الجهاز المركزي للمحاسبات (الأسهم في الشكل 2)، وفي تناقض واضح مع توزيع Aβ42 في حمة الدماغي كالصحة والصحة النباتية. Aβ1-41، ونحن الأول من كشف هذا الجزء في العقول البشرية، ونحن قد ولدت الأجسام المضادة المحددة التي يمكن أن تميز Aβ41 من Aβ40 andAβ4221.
عموما القرار المكانية لاستخدام--نظام الرصد الدولي هو أهم عامل تحسينه. في الشكل 1 و الشكل 2 إظهار استخدام نظام الرصد الدولي مع قرار الملعب 100 ميكرومتر والحصول على ملف تعريف توزيع الإجمالي ل منطقة واسعة نسبيا21. من الصعب تحديد الترسب اميلويد بالضبط في الفضاء تحت العنكبوتية، بما في ذلك بنية الأوعية الدموية. تصوير الأنسجة غرامة هياكل السفن تحت العنكبوتية وسطح القشرة، التصوير عالي الدقة باستخدام (40 ميكرومتر: الرقم 3؛ 20 ميكرومتر: الرقم 4 و الشكل 5) قد أنجز. كنتيجة لذلك، استخدام نظام الرصد الدولي أظهرت بوضوح أن Aβs أقصر، مثل Aβ1-36 إلى 1-41، وتوزع في جدران الشرايين، التي هي قابلة للمقارنة مع المدينة.
استخدام نظام الرصد الدولي أظهر توزيع مفصل Aβx-40 و Aβx 42 (x = 2، 4، 5، 6، 7، 8، 9، و 11pE) في الإعلان مصحوبا بالدماغ الجهاز المركزي للمحاسبات معتدلة. على سبيل المثال، في حين أظهرت الأنواع Aβx-40 صورة توزيع مماثلة إلى Aβ1-40، أظهرت الأنواع Aβx-42 نمط توزيع مختلفة مع Aβ1-4221. بالبروتوكول الحالي، يتم تعيين الصور أيون واحد من الببتيدات Aβ الفردية باستخدام نظام الرصد الدولي للأنواع Aβ. على النقيض من ذلك، اكتسبت الصورة البيانات يمكن أن يحقق استخدام الإحصاءات متعدد المتغيرات غير خاضعة للرقابة من أجل الحصول على صورة تجزئة المناطق التشريحية للاهتمام لمزيد من التحليل للبروتينات غير معرف. يبين الشكل 5 مخطط تجزئة الحصول عليها مع إجراء تحليل كوسائل بيسيكتينج ينطبق على الجزء نفسه من المريض #321. وحدد هذا أسلوب التجميع بنجاح هياكل شبيهة باللوحة في حمة (الأزرق في الشكل 5) وهياكل الأوعية الدموية في الفضاء تحت العنكبوتية (الأخضر في الشكل 5). أنها مثيرة للاهتمام لإيجاد مساحة دائرية صغيرة في حمة، التي يتم الكشف عنها فقط في جميع أنحاء أرتيريولي صغيرة في حمة، وكذلك في الفضاء تحت العنكبوتية (الأرجواني في الشكل 5). وهذا يمكن التحقق منه بالصور أيون واحد من هذه الببتيدات Aβ الفردية في الشكل 5-5F.
رقم 1: استخدام نظام الرصد الدولي للمجمدة AD/الجهاز المركزي للمحاسبات الدماغ المقطع. ج-الطرفية المختلفة اقتطاع Aβ يتم تصور الببتيدات في الإعلانات المصاحبة للجهاز المركزي للمحاسبات شديدة (المريض #3) في اللوحة اليسرى والضوابط (المريض #9 على اليمين والمريض #10 على اليسار في جميع الصور) في اللوحة اليسرى. Aβ1--36 إلى Aβ1 41 تودع تفضيلي في الأوعية الدموية ليبتومينينجيل، بينما Aβ1-42 و Aβ1 43 تودع في حمة الدماغي لويحات خرف في حالة العقول #3، بينما كان هناك أي إشارة في مراقبة المرضى (الحالات #9 و #10). القرار = 100 ميكرومتر. شريط المقياس = 5 ملم. لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من كاكودا et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: استخدام نظام الرصد الدولي لتجميد AD/الجهاز المركزي للمحاسبات الدماغ الفروع والأقسام المتاخمة من قشرة والقفويه من العقول الإعلانية. (أ - ج) المجمدة أقسام الدماغ الإعلانية/الجهاز المركزي للمحاسبات والمقاطع المجاورة (د وه) من قشرة والقفويه من العقول الإعلانية كانت ملطخة بالمناعة وتركز على أرتيريولي وحمه الدماغية، استخدام أجسام مضادة ضد Aβ40 (d: BA27) أو Aβ42 (E: مكافحة-Aβ42 [بولكلونل]). كل التحاليل أثبتت أن Aβ40 تفضيلي يترسب في الأوعية الدموية ليبتومينينجيل (الأسهم الموجودة في لوحة د) والشرايين في الفضاء تحت العنكبوتية ولحمة الدماغي تشكيل الجهاز المركزي للمحاسبات. وفي المقابل، تودع Aβ42 أساسا في الصحة والصحة النباتية. لنظام الرصد الدولي، القرار = 100 ميكرومتر. شريط المقياس = 5 مم (أ وب وج) = 5 مم، 500 (دال و هاء). لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من كاكودا et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مالد--نظام الرصد الدولي لتجميد AD/الجهاز المركزي للمحاسبات الدماغ المقاطع (المريض #3) بدقة من 40 ميكرومتر. مختلف ج-الطرفية والطرفي ن اقتطاعها وتعديل الببتيدات Aβ في الإعلانات المصاحبة للجهاز المركزي للمحاسبات شديدة (المريض #3). Aβ1--36 إلى Aβ1 41 تودع تفضيلي في الأوعية الدموية ليبتومينينجيل، بينما Aβ1-42 و Aβ1 43 تودع في حمة الدماغي لويحات خرف. تغيير حجم أشرطة = 1 مم (أ-ب)، 2 مم (أعلى اليسار). القرار = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: استخدام نظام الرصد الدولي لتجميد AD/الجهاز المركزي للمحاسبات الدماغ المقاطع (المريض #3) بدقة من 20 ميكرومتر. يظهر هذا الفريق مختلف ج-الطرفية والطرفي ن اقتطاعها وتعديل الببتيدات Aβ في الإعلانات المصاحبة للجهاز المركزي للمحاسبات شديدة (المريض #3). Aβ1--36 إلى Aβ1 41 تودع تفضيلي في الأوعية الدموية ليبتومينينجيل، بينما Aβ1-42 و Aβ1 43 تودع في حمة الدماغي لويحات خرف. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر (أ، ب، ج)، 1 مم (أعلى اليسار). القرار = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خريطة تجزئة، والتي تم الحصول عليها باستخدام نظام الرصد الدولي لقسم الدماغ الإعلانية المجمدة، يكشف عن لوحة خرف المفترضة وهياكل السفن تحت العنكبوتية الكبيرة والصغيرة الشرايين متني. (أ) الحصول على خريطة تجزئة من تحليل صورة متعدد المتغيرات لبيانات نظام الرصد الدولي استخدام. (ب) بيسيكتينج كوسائل تحليل المجموعات استناداً إلى تحديد الهياكل الشبيهة باللوحة ومثل السفينة في قشرة والقفويه. يتم عرض المجموعات وهياكل فرعية وعلاقاتها كعقد (e.g.,1-0-0). (ج) Aβ متميزة الببتيد التعريب أنماط تشبه لويحات (أزرق)، سفن تحت العنكبوتية (الأخضر)، وهياكل arteriole (أحمر). علما أن بعض الكتل الحمراء وتوزع أيضا في الفضاء تحت العنكبوتية. وهذا يمكن التحقق منه بالصور أيون واحد من هذه الببتيدات Aβ الفردية بدقة 20 ميكرومتر: Aβ (د) 1-40 و Aβ (ﻫ) 1-41، و Aβ (و) 1-42. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| القضية | نوع الجنس | العمر عند الوفاة | براك SP | الجهاز المركزي للمحاسبات |
| 1 | M | 83 | ج | 0.5 |
| 2 | M | 88 | ج | 1 |
| 3 | M | 84 | ج | 2 |
| 4 | M | 78 | ج | 1 |
| 5 | M | 83 | ج | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
الجدول 1: البيانات السريرية والمرضية للإعلان مع حالات الجهاز المركزي للمحاسبات والذين تتراوح أعمارهم بين المواضيع س س. وتم الحصول على العينات البشرية القشرية لنظام الرصد الدولي، والمدينة من المصرف الدماغ في "معهد علم الشيخوخة العاصمة طوكيو". كل عينة الدماغ مأخوذة من قشرة والقفويه خمسة مرضى الإعلانية وخمسة عناصر مطابقة العمر. وعرف مدى ترسب اميلويد كما هو مبين بجسم [مونوكلونل] Aβ SP براك (اميلويد) على مراحل. في المرحلة س، هناك تقريبا لا لويحات خرف طوال إيسوكورتيكس. وفي المرحلة جيم، تتأثر تقريبا جميع مجالات إيسوكورتيكال. أدمغة الإعلانية ثابتة في المرحلة جيم وقد تم تعديل هذا الجدول بإذن من كاكودا et al.21.
Discussion
هنا أظهرنا بروتوكول مفصل ونتائج التصور Aβ وما إيسوفورمس من العقول أوتوبسيد عدة مع الإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات مع استخدام نظام الرصد الدولي. تم تغيير صورة Aβs ترسب جذريا من Aβ1-42 إلى الاختلافات الطرفي ن وج. Aβ1-41 للمرة الأولى تحديد وتصور في العقول البشرية مع البروتوكول الحالي وكذلك التحقق من صحة مع المدينة21. إذ ترى أن مورفولوجية Aβ المودعة بنظام الرصد الدولي بتحليل الاستبانة (20 ميكرومتر) يجب أن يكون في اتفاق جيد مع المدينة، نظام الرصد الدولي والمدينة على قدم المساواة تسهم في التمييز بين رواسب Aβ بمواقعها ومحتويات البروتين، وكذلك على مورفولوجيا. كما أجرى التجربة كامل الموصوفة هنا في قشرة والقفويه، سوف المعمم دراسة التعريب من مختلف الأنواع اميلويد بيتا في جميع المناطق الدماغ مع تجارب المستقبل باستخدام البروتوكول الحالي.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول خطوات إعداد الأنسجة للحصول على تاين فعالة من البروتينات مجمعة في أنسجة الدماغ البشري. مطلوب طبقة مصفوفة لامتصاص طاقة الليزر والحث على الامتزاز والتاين لتحليلها. في هذه العملية، هو البلوتينيوم المغلفة قسم أنسجة كاملة مع بلورات صغيرة. كوكريستاليزيشن متجانسة من أكثر مع المصفوفة حاسم بالنسبة للتصوير بحساسية عالية وخالية من القطع الأثرية. كل من الطرق الثلاث رذاذ مزاياه الخاصة. طلاء الرش اليدوي إحدى الطرق الأكثر استخداماً. بخاخة مناسب؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب عملية ماهراً. كما ضروري تقنية تجريبية دقيقة واستنساخه، يوصي باستخدام بخاخ الموجات فوق الصوتية و/أو بخاخ تلقائي كما هو موضح في البروتوكولات الحالية. فيما يتعلق ببخاخ الموجات فوق الصوتية، لن تتأثر بالرطوبة ودرجة حرارة الغرفة نظراً لأنه يتم رش في دائرة. وفي الوقت نفسه، مع بخاخ تلقائي، يتم الحصول على القرار المكانية نسبيا المحفوظة مع إمكانية تكرار نتائج جيدة. عموما، أن القرار المكانية التي تم الحصول عليها مع زيادة ثلاثة أساليب ترتيب 1) البخاخة، وجهاز 2) التلقائية وبخاخ 3) الموجات فوق الصوتية.
الأهم من ذلك، هذا البروتوكول تم إنشاؤها أصلاً لكشف وتصور Aβs في عينات المخ البشري تشريحها. في وقت سابق ذكرت تصور Aβs مع استخدام نظام الرصد الدولي للفئران APP23، التي يتم إنشاؤها كنموذج حيوان من الإعلانات استناداً إلى الطفرة السويدية-نوع من التطبيق البشرية، قبل الآخرين مع القائمة18،أسلوب19. ومع ذلك، البروتوكول السابق ينطبق على APP23 لم تكن كافية لتصور Aβ في قرارها الأفقي وحساسية. وناقش الأشغال السابقة أن تركيزات عالية Aβ خارج حدود الأنسجة هي وضوح التحف في APP23 التصوير مع18،البروتوكول على19. وهذا يعني أن ما يسمى 'الضبابية' بين الصحة والصحة النباتية حقيقية ونظام الرصد الدولي الصور بسبب الخطوة استخراج مصفوفة أمر لا مفر منه مع استخدام نوع التصوير. ومع ذلك، في البروتوكول الحالي، اختفى طمس وتمثل كل الطيف كل ليرة سورية واحدة في حمة الدماغ.
كما هو موضح هنا، يمكننا تتبع Aβ1-41 للمرة الأولى في الإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات العقول مع استخدام نظام الرصد الدولي، وكذلك مع المدينة، مع جسم معين بمنطقتنا جيل21. وفقا لنموذج تجهيز Aβ، Aβ1-38 مستمد من Aβ1-45 عن طريق Aβ1-42، في حين Aβ1-41 مستمد من Aβ1-45 γ-سيكريتاسي الانقسام التدرجي27،،من2829،30،31 . وهذا يعني أن البروتوكول الحالي يدعم هذا الطراز. أما بالنسبة للقيود المفروضة من هذا الأسلوب، يجب أن ننظر إلى عدم تجانس العينات المأخوذة من الدماغ البشري تشريح الجثة. أن الخطوة الأكثر أهمية، بمعنى من المعاني، تقييم أنسجة المخ التشريح المؤهلين مع إثبات الأخلاقية. مع البروتوكول الحالي على أنسجة الدماغ تلك الجثة المؤهلين، يمكن استخدام نظام الرصد الدولي منفردة تتبع توزيع كله من جزيئات معقدة بعد عدة تعديلات، فضلا عن factor(s) غير معروف تنظيم الآلية المرضية للإعلان، التي لا يزال يتعين تعريف. وعلاوة على ذلك، في فهم الآلية المرضية الشاملة لمختلف أمراض الأعصاب في العقول البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين، يجب أن يكون ممكناً اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي باعتباره نهجاً موحدا، بالاقتران مع الملاحظات الإكلينيكية والوراثية والمرضية في الأمراض العصبية .
خطوة حاسمة أخرى من استخدام نظام الرصد الدولي هو عملية استخراج البيانات من مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها، ودائما مضيعة للوقت. ويتطلب التعدين البيانات يدوياً لكل توزيع الذروة للمستخدمين النقر فوق كل صورة وابحث عن التوزيعات التي قد ترتبط بالتشكل العينة التي تم تحليلها. يمكن استخدام التجزئة التلقائية المكانية كخطوة أولى للبيانات التعدين، وتقديم لمحة عامة عن مجموعة البيانات وتسمح الكشف السريع عن السمات البارزة. في هذا النهج، إحصائيا تحدد أوجه التشابه بين أطياف منطقة بعينها، وأطياف مماثلة يتم تجميعها في مجموعة واحدة. كل بكسل يتم ترميز وفقا لانتدابهم الكتلة (الشكل 5). في هذه الدراسة AD/الجهاز المركزي للمحاسبات، هو مجال اهتمام فضاء ترسبات Aβ في اللوحة متني وهياكل الأوعية الدموية تحت العنكبوتية ومتني. وكانت قمم مميزة اثنين وكذلك التحقق من صحة مع المدينة قيم m/z من Aβ1-40 و Aβ1 4221. وهكذا، فمن السهل العثور على كولوكاليزيد m/z مع Aβ1-40 و 42 Aβ1 التي تم بالفعل Aβ مبتوراً المشروح للطرفي ن وجيم، فضلا عن الببتيدات غير معروف، لمزيد من التحليل.
وأفاد ويلر والزملاء أن Aβ تتراكم في جدران الأوعية، أكثر حول الشرايين مما حول الأوردة21. وعلاوة على ذلك، فقد اقترح أن يشمل السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) Aβs تفرز من حمة الدماغي للعقدة الليمفاوية عن طريق ارتشاح صرف مسار22،،من2324،25 ،26. ويدعم البروتوكول الحالي لإنشاء مخطط تجزئة استناداً إلى مجموعة بيانات استخدام نظام الرصد الدولي بدقة 20 ميكرومتر احتمال وجود مسارات الصرف ارتشاح في المخ (الشكل 5)، التي تسهم إسهاما كبيرا في الجهاز المركزي للمحاسبات في الإعلان21 , 32-وعلاوة على ذلك، يمكننا اكتشاف البروتينات علامة كولوكاليزيد مع اللوحة والمفرج تحت العنكبوتية عن طريق حساب الارتباط لكل قيم m/z. في فهم الآلية المرضية الشاملة لمختلف أمراض الأعصاب في العقول البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين، يجب أن يكون ممكناً اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي كنهج قوية في تركيبة مع المنشأة المدينة البيانات السريرية، والوراثية، والملاحظات المرضية في الجهاز العصبي الأمراض.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (بروتين الدماغ الشيخوخة والخرف التحكم 26117004؛ لمي والخرائط). جزئيا أيده هذا البحث "برنامج البحوث الاستراتيجية" "علوم الدماغ" من وكالة اليابان "البحوث الطبية" والتنمية (AMED). أجريت جميع التجارب امتثالا للمبادئ التوجيهية سيصلون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
References
- Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
- Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
- Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
- Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
- Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
- Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
- Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
- Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
- Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
- Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
- Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
- Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
- Stoeckli, M., et al.
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
- Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
- Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
- Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
- Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
- Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
- Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
- Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
- Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
- Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
- Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
- Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
- Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).
