Summary
ميكروجليا هي الخلايا المناعية الدماغ أن الدراسات الاستقصائية والرد على فسيولوجيا الدماغ غيرت من خلال تغييرات السمات التي يمكن تقييمها كمياً. هذه الخطوط العريضة للبروتوكول ImageJ على أساس تحليل بروتوكول لتمثيل مورفولوجيا microglia كبيانات مستمرة وفقا لمقاييس مثل الخلية تشعبت والتعقيد، والشكل.
Abstract
هي Microglia البالعات الدماغ التي تشارك في التوازن الدماغ ومسح بيئتها للخلل والإصابات والأمراض بشكل مستمر. كأول المستجيبين، microglia وظائف مهمة للتخفيف من حدة الخلل في الخلايا العصبية وإطلاق، وفي هذه العملية، فإنها تمر بمجموعة واسعة من التغييرات مورفولوجك. مورفولوجيس Microglia ويمكن تصنيف صفيا، أو بدلاً من ذلك، يمكن قياسها كمياً كمتغير مستمر للمعلمات مثل الخلية تشعبت والتعقيد، والشكل. بينما يتم تطبيق أساليب لقياس ميكروجليا للخلايا المفردة، تطبيق بعض التقنيات microglia متعددة في الصورة المجهرية كامل. والغرض من هذا الأسلوب لقياس متعددة وخلايا مفردة باستخدام بروتوكولات ImageJ متوفرة بسهولة. هذا البروتوكول موجز للخطوات والإضافات إيماجيج الموصى بها لتحويل الصور الثنائية والعظمية الممثل photomicrographs الأسفار ومشرق الميدان وتحليلها باستخدام برامج الإضافات أناليزيسكيليتون (2D/3D) وفراكلاك لجمع البيانات مورفولوجيا. تلخيص نواتج هذه الإضافات مورفولوجيا الخلايا من حيث نقاط النهاية عملية وتقاطعات، وطول فضلا عن التعقيد وشكل الخلية وواصفات حجم. بروتوكول تحليل هيكل عظمى الموضحة هنا أيضا مناسبة لإجراء تحليل إقليمي ل microglia متعددة داخل أسرة الصورة المجهرية أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI) بينما فراكلاك يقدم تحليلاً خلية فردية متكاملة. ويوفر البروتوكول جنبا إلى جنب، موضوعي وأداة التقييم الحساسة، والشاملة التي يمكن استخدامها التجهيزة بين مورفولوجيس microglia المتنوعة الموجودة في الدماغ صحية والجرحى.
Introduction
Microglia قد استجابة فورية ومتنوعة مورفولوجك إلى تغييرات في الدماغ الفيزيولوجيا1 على طول سلسلة متصلة إمكانيات التي تتراوح من مورفولوجيس فرط تشعبت ومعقدة للغاية لإزالة متشعب واميبيه مورفولوجيس2 . وقد يصبح Microglia الاستقطاب وعلى شكل قضيب3. تشعبت خلية Microglia عموما يعرف بأنه شكل تعقيداً وجود عمليات متعددة وغالباً ما تبلغ عن عدد نقاط النهاية كل خلية وطول عمليات الخلية. منذ microglia يتم ضبطها بدقة للدالة الدبقية والخلايا العصبية من خلال خلية-خلية مستمر عبر الحديث و في فيفو حركية4،5، مورفولوجيس microglia قد تخدم كمؤشرات لوظائف الخلية المتنوعة وأوجه الخلل في الدماغ. نهج كمي ضروري لوصف تنوع هذه التغييرات مورفولوجك على نحو كاف والتمييز بين الاختلافات بين الخلايا متشعب التي تحدث مع خفية الاضطرابات الفسيولوجية (مثل الصرع5،6 وارتجاج في الدماغ7) بالإضافة إلى الإصابات الجسيمة (مثل8من السكتة الدماغية). زيادة استخدام مورفولوجيا الكمي7،،من89،10،11،12،13،14 وسوف تكشف عن التنوع الكامل مورفولوجيس microglia أثناء الصحة والمرض. تفاصيل الدراسة الحالية استخدام التدرجي ImageJ الإضافات اللازمة لتلخيص مورفولوجيا microglia من photomicrographs الفلورية أو غير الفلورية من microglia المكتسبة في أنسجة القوارض الثابتة بعد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة).
المركزية لتحليل الأساليب الموصوفة هنا ImageJ الإضافات أناليزيسكيليتون (2D/3D)15، نمواً في عام 2010 لتحديد هياكل الثديية الكبيرة، وفراكلاك16، وضعت في عام 2014 دمج التحليل إيماجيج والنمطي هندسي متكرر إلى تحديد حجم الأشكال microglia الفردية. هذه الإضافات توفير إجراء تحليل سريع تشعبت microglia داخل أسرة photomicrographs أو microglia متعددة من عائد محدد داخل الصورة المجهرية. يمكن استخدام هذا التحليل وحدها أو يكمل التحليل النمطي هندسي متكرر. التحليل النمطي هندسي متكرر خلية واحدة (فراكلاك) يتطلب استثماراً للوقت ولكن يوفر نواتج مورفولوجيا متعددة فيما يتعلق بتعقيد ميكروجليا والشكل والحجم. استخدام كل أدوات ليست زائدة عن الحاجة، كخلية تشعبت مكملة إلى تعقيد الخلية، ويمكن استخدام مزيج معلمات متعددة للتمييز بين مورفولوجيس microglia المتنوعة داخل مجموعات البيانات12،17.
Protocol
جميع التجارب التي وافقت عليها وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة أريزونا مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة والمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وكان الحرص على التقليل من الحيوانات من الألم والانزعاج. وفقا لبروتوكول المعتمد أساليب القتل الرحيم وتتكون من قطع الرأس عنق الرحم تحت التخدير إيسوفلوراني.
1-إعداد الأنسجة
ملاحظة: إجراء تحليل مورفولوجيا microglia على عينات الأنسجة كريوبروتيكتيد الثابتة، للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا. التالي بروتوكول قياسي لإعداد وشريحة الأنسجة الثابتة للأسفار المدينة مباشرة.
- إزالة أدمغة الفأر أو الجرذ من حيوان euthanized بعد التجربة المطلوب ووفقا لبروتوكول مختبر قياسية. وضع الدماغ في قنينة 10 مل يحتوي على 5 مل حل بارافورمالدهيد 4% عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. ثم شطف والمكان إلى 5-10 مل فوسفات السكروز 30% مخزنة الحل ح 72 (PBS، 0.01 M) في 4 درجات مئوية. تخزين العقول كلها في-80 درجة مئوية حتى تقطيع الأنسجة مع كريوستات، أو عند 4 درجة مئوية إذا كان تقطيع مع مبضع.
ملاحظة: هذا البروتوكول لم يتم اختباره باستخدام أنسجة شرائح من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين. - قسم أنسجة المخ بسمك القسم المطلوب والتوجه باستخدام المقاطع التعويم الحر أما كريوستات أو مبضع ومخزن في حل كريوبروتيكشن (50 مم PBS، الإثيلين غليكول والغليسيرول) عند-20 درجة مئوية.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد تم تنفيذه بنجاح في أقسام الأنسجة الاكليلية تتراوح بين 50 ميكرون 200 ميكرومتر في سمك. أقسام الأنسجة أقل من 50 ميكرون قد لا التقاط فترة كاملة من العمليات microglia، بينما في أقسام الأنسجة سميكة، تلطيخ المدينة قد تكون ناقصة بسبب اختراق جسم الأنسجة. الأنسجة قد يكون اتجاه مقطعة أما في كرونال أو السهمي ويعتمد هذا الاختيار على region(s) الهدف والدماغ التجريبية دراستها.
2-إيمونوهيستوتشيميستري
ملاحظة: يمكن تطبيق أساليب تحليل هيكل عظمى والنمطي هندسي متكرر للأسفار أو 3, 3-ديامينوبينزيديني (DAB) المدينة. التالي هو بروتوكول قياسي الأسفار المدينة ويمكن الاستعاضة حسب الحاجة. الأسفار المدينة غلة التصور متفوقة لعمليات الخلية عند مقارنتها "المدينة الدأب".
- ضع مقاطع الأنسجة في قنينة زجاج مل 4 (الماوس تصل إلى 15، الدماغ الأقسام/فيال) واحتضان مع 1 مل من الحل الذي يتضمن يصل إلى 10% مصل الحصان، برنامج تلفزيوني (0.01 متر)، 0.5% تريتون، 0.04% نان3 في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) ح 1.
- أغسل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني (0.01 M) ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع جسم الابتدائي (Iba1، 1:1، 000) في درجة حرارة الغرفة ح 72 في 1 مل من محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني (0.01 متر)، 0.5% تريتون، نان 0.04%3، وغطت (للحفاظ على فعالية3 نان).
- أغسل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني (0.01 M) ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (المضادة أرنب 488، 1: 250) المشمولة في درجة حرارة الغرفة ح 4 في 1 مل محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني (0.01 متر)، 0.5% تريتون، 0.04% نان3
- أغسل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني (0.01 M) ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
- جبل المقاطع أنسجة المخ (عدد والتوجيه يستند إلى الأفضلية) للشرائح subbed وتطبيق متوسطة لينة-مجموعة متزايدة للشريحة ومكان ساترة أكثر من الأنسجة. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: مطلوب سمك زجاج 1.5 ساترة لتصوير [كنفوكل]. مجموعة لينة أنه وسط تصاعد مفضل لزوجة عالية لا ضغط الأنسجة وأفضل يحتفظ مورفولوجية عند مقارنتها بتصاعد هاردسيت وسائل الإعلام.
3-تصوير
- صورة Iba1 الخلايا إيجابية في المقطع أنسجة الدماغ استخدام مجهر مشرق الحقل أو [كنفوكل] التي لديها قدرة اكتساب z-مكدس استخدام 20 X موضوعية أو أكبر.
ملاحظة: تصوير المعلمات وإعداد البرامج يجب أن تكون ثابتة لجميع اقتناء الصورة المجهرية في تجربة. يتم الحصول على تفاصيل عملية ممتازة استخدام 40 X أو 63 X الهدف. فمن الممكن لتطبيق بروتوكول تحليل هيكل عظمى الموضحة هنا الصورة المجهرية كامل أو عائد متعددة خلايا داخل الصورة المجهرية أكبر.- الحصول على صور 8-بت باستخدام البرمجيات المناسبة إعدادات محددة لبرنامج المجهر.
ملاحظة: قد يشوه تحويل الملفات إلى 8-بت بعد اكتساب عملية جمع البيانات. - الحصول على الأقل 30 ميكرومتر z-مكدس مع لا أكثر من فاصل زمني 2 ميكرومتر بين الصور باستخدام إعدادات البرامج المناسبة محددة لبرنامج المجهر.
ملاحظة: بالمجهر والبرامج ينبغي أن تسمح للحصول على الصور في محور X و Y و Z. يمكن زيادة كدسة z، وقد انخفض الفاصل الزمني لتقديم تفاصيل إضافية microglia. وفي المقابل، سيزيد التصوير وقت. استخدام العينات نايكست حيثما أمكن للفحص المجهري الأسفار.
- الحصول على صور 8-بت باستخدام البرمجيات المناسبة إعدادات محددة لبرنامج المجهر.
- حفظ كافة الملفات كملفات Tif أو كما هو مطلوب من قبل برنامج المجهر.
- فتح ملفات Tif في إيماجيج واستخدام شريط الأدوات لتقسيم القنوات بواسطة النقر فوق صورة | لون | تقسيم القنوات، وكومة الصور عن طريق النقر فوق صورة | مكدسات | × المشروع | أقصى "كثافة الإسقاط" عند الاقتضاء. حفظ كملفات.tif.
4-هيكل عظمى التحليل
- تحميل فيجي أو إيماجيج من < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. تحميل الوظائف الإضافية الفردية، AnalyzeSkeleton(2D/3D) من < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 وتحميل فراكلاك من < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
ملاحظة: يأخذ كامل عملية تحويل الصورة المجهرية صورة ثنائية العظمية إلى أقل من 1 دقيقة. - إذا كان استخدام الصورة المجهرية الأسفار، تأكد من الصورة 8 بت وتحويلها إلى درجات الرمادي لأفضل تصور تلطيخ إيجابية جميع. استخدام شريط الأدوات، وانقر فوق صورة | جداول البحث | غرايز. في حالة استخدام صورة مشرقة ميدان البث الإذاعي الرقمي، واستخدام أول ممر الموجه الاتحاد الفرنسي للتنس تصفية البرنامج المساعد (باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | الاتحاد الفرنسي للتنس | ممر الموجه مرشح) ومن ثم تحويل إلى تدرج الرمادي.
ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، إيماجيج الإعدادات الافتراضية لممر الموجه مرشح "الاتحاد الفرنسي للتنس" كافية (تصفية ما يصل إلى 3 بكسل، وصولاً إلى 40، لا قمع شريطية). تطبيق عامل تصفية "الاتحاد الفرنسي للتنس ممر الموجه" يزيل الضوضاء (ميزات الصغيرة) مع المحافظة على الجوانب عموما أكبر من الصورة. وهذا مفيد بشكل خاص في الصور الميدانية مشرق، حيث انشقاقات وتصدعات في الأنسجة يمكن أن تظهر كخلفية ومما يؤدي إلى تعقيد تحليل هيكل عظمى18. - ضبط السطوع والتباين إذا كانت الصورة قاتمة جداً ولا يمكن تصور عملية ميكروجليا. استخدام شريط الأدوات، وانقر فوق صورة | ضبط | السطوع/. ضبط المنزلق أو الحد الأدنى أو الحد الأقصى حسب الحاجة، تصل إلى حواف الرسم البياني ولكن ليس كذلك.
ملاحظة: في إيماجيج، السطوع والتباين يتم تغيير عن طريق تحديث جدول البحث للصورة (لوط)، حيث يتم تغيير قيم بكسل. منزلقات Max و min التحكم في حدود نطاق العرض، مع قيم بكسل أعلاه 255 الظهور أبيض وقيم بكسل أقل من 0 الظهور الأسود18السفلي والعلوي. وفي حالة photomicrographs الأسفار، ينبغي أن تستخدم المنزلق أقصى، بينما ستستخدم photomicrographs للبث الإذاعي الرقمي الملون microglia المنزلق الحد الأدنى. - تشغيل عامل تصفية الاستبدال لزيادة التباين باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | مرشحات | الاستبدال. لأغراض هذا البروتوكول، إيماجيج في الإعدادات الافتراضية (نصف قطرها 3 بكسل وقناع وزن 0.6) المستخدمة.
ملاحظة: قناع Unsharp يشحذ ويعزز ميزات حافة الصورة عن طريق طرح صيغة واضحة للصورة (الاستبدال) من النص الأصلي ومن ثم دمج الصورة الناتجة مع نسخة عالية على النقيض من الصورة الأصلية. ولذلك، مرشح تصحيح الاستبدال لا يقوم بإنشاء تفاصيل، ولكن بدلاً من ذلك وتوضح التفاصيل الموجودة في صورة. سوف يكون دائرة نصف قطرها إعداد التغييرات كيف ضبابية "الاستبدال" (وسيتم إزالتها وبالتالي طمس كم)، ووزن قناع إعداد التغييرات درجة التباين التي سيتم دمجها مع الاستبدال (وهكذا ضبط تباين الصورة النهائية). - القيام بخطوة ديسبيكلي لإزالة الضجيج سالتاندبيبير التي تم إنشاؤها بواسطة الاستبدال. استخدام شريط الأدوات، وانقر فوق عملية | ضجيج | تمويه داخلي.
ملاحظة: تمويه داخلي يزيل الضوضاء سالتاندبيبير بالاستعاضة عن كل بكسل مع القيمة الوسطية في حي 3 × 3. التأثير أن يتم استبدال القيم المتطرفة في كثافة بكسل متوسط دون التأثير على الحدة من حواف18. - تحويل الصورة إلى ثنائي باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق صورة | ضبط | عتبة.
ملاحظة: مستوى العتبة يقسم الصور الرمادية إلى ميزات للفائدة مقابل خلفية ويقوم بتحويل الصورة إلى ثنائي18. - تطبيق ديسبيكلي، الوثيق-، وإزالة المهام القيم المتطرفة: في الصورة الثنائية الناتجة عن ذلك، قد يكون هناك ضجيج الخلفية واحد بكسل والفجوات بين العمليات.
- تطبيق دالة despeckle استخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | ضجيج | تمويه داخلي.
ملاحظة: تطبيق التمويه الداخلي للملف الثنائي الصورة يزيل أي ضجيج واحد بكسل المتبقية. - تطبيق الدالة إغلاق باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | ثنائي | إغلاق.
ملاحظة: هذا البرنامج المساعد يتصل اثنين بكسل الظلام إذا أنها مفصولة بكسل يصل إلى 2. - تطبيق الدالة إزالة القيم المتطرفة باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | ضجيج | إزالة القيم المتطرفة.
ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، تستهدف القيم المتطرفة مشرق مع نصف قطرها 2 بكسل وحدا أدنى من 50. يستبدل هذا البرنامج المساعد الخارجة مشرقة أو مظلمة بكسل بكسل الوسيط في المنطقة المحيطة إذا أنه ينحرف بأكثر من قيمة (العتبة) معينة18.
- تطبيق دالة despeckle استخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية | ضجيج | تمويه داخلي.
- حفظ الصورة كملف منفصل لتحليل الاستخدام و/أو كسورية المستقبل والصورة باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق عملية سكيليتونيزي | ثنائي | سكيليتونيزي.
- قم بتحديد الصورة العظمية وتشغيل البرنامج المساعد AnalyzeSkeleton(2D/3D) باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق الإضافات | هيكل عظمى | تحليل هيكل عظمى، والتحقق من مربع "معلومات فرع".
ملاحظة: من المحتمل أن تتطلب معالجة الصورة الأمثل مع إضافة أو حذف الخطوات المقترحة أعلاه. في هذه العملية، يتم تقييم الصور العظمية للتأكد من دقتها عن طريق إنشاء تراكب للهيكل العظمى والصورة الأصلية. اتفاقات ينبغي أن تكون نقطة الأصل واحد مع العمليات الصادرة عن المركز؛ حسام دائرية الخلط بين البيانات وينبغي تجنبها من خلال تعديل البروتوكول. ويتضح مثال على نقطة الأصل واحد مقابل اتفاقات التعميم في الشكل 1.
المشاكل الشائعة الناتجة في الهياكل العظمية غير تمثيلية واقترح حلولاً:
- صورة قاتمة جداً: تحويل إلى اللون الرمادي، وضبط منزلق السطوع/، و/أو تطبيق الاستبدال
- الكثير الخلفية: ضبط منزلق السطوع/وتطبيق ديسبيكلي، و/أو إزالة القيم المتطرفة
- حسام التعميم في صورة العظمية (خاصة بالنسبة للصور الأسفار): تطبيق مرشح "الاتحاد الفرنسي للتنس ممر الموجه"، و/أو الاستبدال
- الشقوق في الأنسجة (خاصة بالنسبة لصور مشرقة الميدانية): تطبيق مرشح "الاتحاد الفرنسي للتنس ممر الموجه"، و/أو تمويه داخلي
- نسخ كافة البيانات من النتائج ونواتج فرع المعلومات ولصق البيانات في جدول بيانات Excel.
- في Excel، قم بقطع البيانات لإزالة أجزاء الهيكل العظمى التي تنتج من اكتساب المدينة والصورة.
- تكرار تجربة المصنف مع إخراج البيانات الخام من تحليل هيكل عظمى وإضافة تريم إلى اسم الملف. يجب أن تحدث جميع البيانات اللاحقة التشذيب في المصنف المكررة للحفاظ على البيانات الخام للاستخدام في المستقبل، ومرجع.
- تحديد طول الأجزاء التي سوف يتم اقتطاعها من dataset بفتح الصورة العظمية في إيماجيج وتحديد أداة الخط. قياس شظايا عديدة، وإذ تحيط علما بأن متوسط طول، واتخاذ قرار بشأن قيمة الانقطاع.
ملاحظة: لأغراض البيانات المعروضة هنا، مدة الانقطاع لأجزاء غير مرغوب فيه هو 0.5. هذه القيمة يجب أن يكون ثابتاً في dataset. - فرز مخصص جدول بيانات Excel بالنقر فوق فرز وتصفية | فرز مخصص. فرز حسب "فوكسيلس نقطة النهاية" من الأكبر إلى الأصغر، وفي مستوى جديد من "Mx فرع حزب العمال" من الأكبر إلى الأصغر.
- إزالة كل صف يحتوي على نقاط النهاية 2 بطول الحد أقصى فرع أقل من قيمة قطع (أي., 0.5). حساب مجموع البيانات في العمود نقاط النهاية لحساب العدد الإجمالي للنقاط النهائية التي تم جمعها من الصورة.
- تكرار للبيانات والمعلومات فرع: فرز حسب 'طول الفرع' من الأكبر إلى الأصغر. قم بالتمرير عبر البيانات وإزالة كل صف يحتوي على طول فرع من أقل من قيمة قطع(أي., 0.5). جمع القيم الموجودة في العمود طول فرع لحساب مجموع طول جميع الفروع التي تم جمعها من الصورة.
- كرر الخطوات 4.11.3-4.11.5 لكل صورة/ورقة حتى تم اقتطاعها وتلخيص كافة البيانات.
- تقسيم البيانات من كل صورة (لخص عدد من نقاط النهاية وقد لخص طول الفرع) على عدد من اتفاقات microglia في الصورة المقابلة. إدخال البيانات النهائية (النهاية/خلية & فرع طول/الخلية) في البرامج الإحصائية.
ملاحظة: قد تتطلب بيانات الطول/الخلية فرع summed التحويل من طول بالبكسل إلى ميكرون.
5. التحليل النمطي هندسي متكرر
ملاحظة: فراكلاك قادراً على تشغيل عدد من التحليلات الأشكال المختلفة التي لم تتم تغطيتها في هذا البروتوكول. للحصول على شرح أكثر تفصيلاً من فراكلاك في وظائف مختلفة، راجع دليل فراكلاك في < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> والمراجع المرتبطة بها 2،،من1619. ويستخدم التحليل النمطي هندسي متكرر الخطوات البروتوكول 4.1-4.7 الموصوفة أعلاه.
- تحديد حجم العائد على الاستثمار الذي سيتم استخدامه لكل من التحليل النمطي هندسي متكرر. استخدام الأداة مستطيل لرسم العائد على الاستثمار. تأكد من أن المربع كبيرة بما يكفي للقبض على الخلية بأكملها، ويمكن أن يبقى ثابتاً في dataset.
ملاحظة: استخدام التحديد المستطيل بدلاً من اختيار حر لضمان أن رويس كل مستطيل الحجم نفسه، وذلك، الخلايا على نفس المقياس. لا هذا سيكون الحال إذا استخدمت اختيار حر لأن إيماجيج سوف مقياس تلقائي عائد مربعا لتناسب مختلف windows مستطيلة الحجم الناتج في الخلايا التي تحتوي على نطاقات مختلفة. بينما الأشكال كسورية مقياس مستقل، فيعتمد على مقياس16عملية التحليل النمطي هندسي متكرر باستخدام فراكلاك إيماجيج. وبالتالي، هناك الحاجة لعائد حجم دائماً في جميع أنحاء جمع البيانات. - حدد microglia للتحليل النمطي هندسي متكرر عشوائياً في كل الصورة المجهرية والصورة الثنائية المقابلة. في إطار إدارة العائد على الاستثمار، حدد تحديث تلتحم دوروا الموقف للخلية. استخدم Ctrl + Shift + D لمضاعفة المساحة ضمن العائد على الاستثمار كنافذة جديدة، وقم بحفظ الخلايا المزروعة. في الصورة المقابلة ثنائي (من تحليل هيكل عظمى)، تكرار المنطقة مع نفس الخلية باستخدام إدارة العائد على الاستثمار. كرر حتى عدد كاف من الخلايا قد تم اختيارها عشوائياً للتحليل النمطي هندسي متكرر، وحفظ كافة الملفات.
ملاحظة: يمكن استخدام مولد رقم عشوائي وشبكة مرقمة شكل عشوائي تحديد الخلايا. - افتح صورة ثنائية مع الخلية الفردية. انقر نقراً مزدوجاً فوق أداة فرشاة الطلاء وتعيين اللون إلى الأسود، وقم بضبط عرض الفرشاة حسب الحاجة. استخدام الصورة المجهرية المطابقة كمرجع، استخدم في الرسام لإزالة عمليات الخلية المجاورة وتوصيل العمليات مجزأة وعزل الخلية للفائدة. حالما تم عزل الخلية ثنائية، احفظ الملف الثنائي.
ملاحظة: عقد 'البديل' سيتم التبديل في الرسام من اللون الأمامي (أسود) إلى لون الخلفية (أبيض). - تحويل الخلية الثنائية إلى مخطط تفصيلي باستخدام شريط الأدوات عن طريق عملية | ثنائي | مخطط.
ملاحظة: يمكن استخدام فراكلاك ي الصورة أما الأشكال الصلبة أو يوجز الشكل، بيد الاتفاقية الحالية لاستخدام الشكل يحدد16. - في شريط الأدوات، قم بفتح فراكلاك باستخدام شريط الأدوات عن طريق النقر فوق الإضافات | التحليل النمطي هندسي متكرر | فراكلاك وحدد قبل الميلاد (العد مربع). في إعدادات شبكة التصميم ، تعيين Num ز إلى 4. تحت خيارات الرسومات ، حدد المربع مقاييس لتحليل هال محدب ودائرة المحيط للخلية. عند الانتهاء، انقر فوق موافق.
ملاحظة: ز Num عدد مربع عد توجهات الشبكة المستخدمة أثناء الفحص وهو النطاق الموصى به ل Num ز 4-12. إعداد Num ز والنطاق المقترح هو استعراض دقيق في دليل فراكلاك16. زيادة Num ز يمكن أن يبطئ إلى حد كبير حساب مرات. إعدادات فراكلاك سوف تحتاج فقط إلى إنشاء مرة واحدة لكل دورة. حالما يتم إدخال الإعدادات، ستتوفر على زر المسح الضوئي. - حدد زر المسح الضوئي لتشغيل تفحص العد مربع على الصورة المحددة.
ملاحظة: سوف تولد التفحص windows ثلاثة نواتج البيانات: هال ونتائج دائرة، والعد مربع ملخص ملف وأنواع المسح الضوئي. الإطار "أنواع المسح" يحتوي على سجل للإعدادات المستخدمة، والانحرافات، وكذلك معيار لبعض التدابير. لأغراض هذا البروتوكول، الإطار "أنواع المسح الضوئي" لا يستخدم، وقد تكون مغلقة أو حفظها للرجوع إليها في المستقبل. - في إطار هال و نتائج دائرة ، نسخ البيانات المطلوبة كلها (أي.، الكثافة، نسبة الامتداد، والتدوير) النتائج. في إطار موجز العد مربع ، نسخ البيانات المطلوبة (أي.، البعد كسورية ولاكوناريتي) النتائج. نقل البيانات التي تم نسخها إلى ملف Excel أو البرامج الإحصائية.
ملاحظة: قائمة كاملة فراكلاك إخراج البيانات المقدمة، ويفسر تفسيراً وافياً في فراكلاك ل دليل إيماجيج16.
Representative Results
مورفولوجيا microglia تحليل البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تلخيص خطوات مفيدة في معالجة الفلورسنت والدأب photomicrographs لتحليل شكلي. هذه الخطوات هي تلخيص بصريا في الشكل 2 ، و الشكل 3. والهدف من هذه الخطوات هو خلق صورة ثنائية والعظمية ممثل نماذج الصورة المجهرية الأصلي على نحو مناسب مثل أن تكون البيانات المتراكمة سارية المفعول. بعد تطبيق البروتوكول، فإن البرنامج المساعد أناليزيسكيليتون النتائج في صورة هيكل عظمى المعلمة التي عدد نقاط النهاية وفرع (أي.، وعملية) ويمكن تلخيص لينجثكان من ملفات الإخراج الناتجة. ثم يتم استخدام بيانات طول العملية ونقاط النهاية لتقدير مدى تشعبها microglia في الصورة المجهرية أو العائد على الاستثمار. الشكل 4 يلخص البيانات الناتجة (النهاية/الخلية وعملية الطول/خلية) التي تم جمعها مع أو بدون تطبيق البروتوكول. على الرغم من وجود اتجاهات مماثلة، هي البيانات الملخصة في 4F الشكل المتغير أقل من تلك الموجودة في الشكل 4E. بالإضافة إلى ذلك، توضح هذه البيانات زيادة الحساسية للكشف عن الاختلافات بين المجموعات عند تطبيق البروتوكول. وأخيراً، يجب الحرص فيما يتعلق بالتباين بين المستخدم في تطبيق البروتوكول. ويرد مثل هذه الاختلافات ب الشكل 5 حيث نفس مجموعة البيانات تم تحليلها من قبل اثنين من المستخدمين مستقل تطبيق بروتوكولا متطابقة على النحو الموجز أعلاه.
يتم جمع البيانات مورفولوجيا إضافية من خلايا مفردة معزولة عن الصور الثنائية التي تم إنشاؤها أثناء تطبيق البروتوكول. خطوات بروتوكول تحليل مورفولوجيا microglia قبل واستخدام البرنامج المساعد فراكلاك-ويرد في الشكل 6. يمكننا توضيح هذا التحليل في كلا يصب (الشكل 6A) وإصابة الأنسجة (الشكل 6B). صور الممثل ثنائي، أوجز، محدب هال/تغليف دائرة، وأمثلة العد مربع لكل خلية وحلل مع ودون البروتوكول التطبيق تظهر في الشكل 6–ف. هذه الصور التي تساعد على توضيح منشأ الاختلافات في البيانات مورفولوجيا الذي يرد في الشكل 6.
رقم 1. الرسوم توضيحية microglia العظمية مع سوما دائرية (الأمثل) مقابل من أصل واحد سوما (أمثل) وتراكب المقابلة بين الخلية العظمية والصورة المجهرية الأصلي- شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. بروتوكول التطبيق إلى photomicrographs نيون. الرسوم التوضيحية "تحليل هيكل عظمى" البروتوكول تنطبق الصورة المجهرية فلورسنت مع خلية واحدة اقتصاص لإظهار التفاصيل. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. تطبيق البروتوكول إلى الدأب مشرق الميدانية photomicrographs. الرسوم التوضيحية لبروتوكول "تحليل هيكل عظمى" تطبيق الصورة المجهرية دأب مشرق حقل مع خلية واحدة اقتصاص لإظهار التفاصيل. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. تحليل البيانات مع أو بدون تطبيق البروتوكول. (أ) الصورة المجهرية مثال المدينة الفلورسنت واقتصاص الخلية المقابلة للمربع الأصفر في (ب). الصور الثنائية والعظمية مثلاً مع (ج) ودون (د) البروتوكول تطبيقها كما هو موضح. بيانات موجزة microglia نقاط النهاية/الخلية وعملية الطول/خلية في يصب (أبيض) وإصابة الأنسجة القشرية (رمادي) مع (ه) ودون (و) تطبيق البروتوكول. التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب و n = 3، * * يدل ف < 0.01. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. الاختلافات المستخدم مع بروتوكول التطبيق. مثال تحويل الصورة والبروتوكول الأصلي إلى صور ثنائية وهيكل عظمى من المستخدم 1 والمستخدم 2. يتم إبراز الفروق بين الصورتين مع مطابقة دوائر ملونة. الرسوم البيانية لملخص لبيانات الطول/خلية النهاية/الخلية وعملية microglia في مناطق الدماغ يصب والمصابين من قبل المستخدم 1 والمستخدم 2. التحليل الإحصائي ANOVA وعينه هو حجم n = 3؛ ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. التحليل النمطي هندسي متكرر مع أو بدون تطبيق البروتوكول. مثال لاقتصاص photomicrographs من microglia في يصب (A) والجرحى (ب) اللحاء مع ثنائي المقابلة (ج)، والصور مخطط (د) التي تنتج مع أو بدون تطبيق البروتوكول. هال محدب المرتبطة بها (أزرق) وأرفق بها دائرة (الوردي) للأشكال مخطط المطابق (ه) تستخدم لحساب كثافة الشكل، وتغطي نسبة، والتدوير (ز). مربع عد الأسلوب المبين في (و)، وتستخدم للبعد كسورية (دب) وحسابات لاكوناريتي (λ) (ز). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
يتم ضبطها بدقة لعلم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض داخل نطاقاتها الصغيرة Microglia الخلايا وعرض مجموعة متنوعة من مورفولوجيس2 في الدقيقة7،14 والضرر الإجمالي8. يجعل استخدام بروتوكولات ImageJ microglia مورفولوجيا الكمي متاحة لجميع المختبرات المنهاج والإضافات صورة المصدر المفتوح برامج معالجة. بينما البروتوكول وصف تركز على معالجة الصور وتحليلها باستخدام هذا البرنامج، تبدأ اتساق جمع البيانات وصحة وموثوقية ممتازة المدينة والفحص المجهري. هذا البروتوكول يستخدم لتحسين ثنائي، والهيكل العظمى، وتمثيلات مخطط photomicrographs كامل والخلايا المفردة، لكن لا يمكن أن تحل محل تلطيخ المدينة الفقيرة والفحص المجهري أن النتائج في التباين المنخفض، واضحة، أو تشويه الصور. كدراسة إضافية، يجب الحرص لا لشد أنسجة المخ أثناء التخزين، قبل تمزيقها، مما يغير مورفولوجيا microglia لا رجعة فيه. وأخيراً، داخل كل تجربة، microglia يجب تصويرها استخدام نفس النطاق، فضلا عن المجهر نفسه. الأجهزة، والأهداف والبرامج تختلف بين المجاهر الذي سينتج photomicrographs الحجم مختلفة على الرغم من الأهداف المماثلة وتغيير التفاصيل فضلا عن عدد الخلايا داخل كل إطار. على سبيل المثال، يؤدي استخدام هدفا X 40 في SPII إيكا الحصول على الصور مرتين العدد من الخلايا وأقل تفصيل من اقتناء استخدام 880 زايس. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للخلية تفرع البيانات المجمعة من كامل الإطار بدلاً من خلية واحدة، كهذا يصبح مسألة أخذ عينات البيانات.
وبصفة عامة، تحليل هيكل عظمى الذي يستخدم الصورة المجهرية كامل يسبق التحليل النمطي هندسي متكرر خلية مفردة لسببين. تحديد الخلية تشعبت من كافة الخلايا الموجودة في الصورة المجهرية يتم بسرعة عند مقارنة بالتحليل النمطي هندسي متكرر خلية واحدة فقط ويمكن اعتبارها كأداة لفحص إذا كان الوقت عامل. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم صور ثنائية مستمدة من خلال تحليل هيكل عظمى للتحليل النمطي هندسي متكرر. مجرد تصويرها، هناك عدد من الخطوات الهامة التي قد تؤثر على نتائج تحليل هيكل عظمى وإدخال المستخدم-التأثير. الخطوات البروتوكول غير متغير معظم بين المستخدمين هي خطوة 4.2 (زيادة سطوع الصورة) والخطوة 4.5 (تحديد العتبة). حيثما أمكن، مصممة عدد أمثل لزيادة السطوع (max أو min شريط التمرير بين 0-255) وعقد ثابت لجميع الصور والمستخدمين. حيث تقلب الصورة كبيرة، يمكن للمستخدم اختيار سطوع التي تتنوع بين الصور بدلاً من ذلك. بدلاً من ذلك، إذا كانت صور مشرقة وعالية التباين، ثم زيادة السطوع ويمكن إهماله والعتبة يمكن أن تكون موحدة باستخدام عامل تصفية عتبة تخصص (مثلاً.، هوانغ) بدلاً من القيمة الافتراضية أكثر من متغير. مجرد الأمثل، ينبغي التقيد بالمعلمات للتقليل من تأثير المستخدم الإضافية.
ويرد مثال لتقلب المستخدم في الشكل 5. زادت قيم البيانات في المستخدم 1 مقابل 2 المستخدم وذلك ستتم زيادة تقلب إذا كان المستخدم 1 والمستخدم 2 أسهم في جمع البيانات. هي أبرز مثال على الاختلافات في المستخدم 1 والمستخدم 2 ثنائي والعظمية صور دوائر ملونة (الشكل 5). وفي هذه الحالة، كان كلا المستخدمين الطلبة الجامعيين بإيجاز المدربين ذوي الخبرة المحدودة في ميكروجليا. المراقبة العادية والتوجيه قبل microglia خبراء جنبا إلى جنب مع بروتوكول زيادة التدريب2 يمكن أن تقلل من التباين بين المستخدم. على الرغم من عدم تقييم هنا، التحليل النمطي هندسي متكرر أقل عرضه للتقلب بين المستخدم لأن الخلايا ثنائي يتم يدوياً وفردياً معزولاً عن الصورة المجهرية بدلاً من الاعتماد فقط على مستوى العتبة لتحديد الأشكال microglia. ومع ذلك، تمتلك كافة أساليب بعض التباين بين المستخدمين. لذلك، مستخدم واحد (ومن الناحية المثالية، المدربين ببعض الخبرة في الخلايا microglia) ينبغي الانتهاء من جمع البيانات مجموعة البيانات كاملة.
تعديلات إضافية يمكن بسهولة جعل هذا البروتوكول، وسوف يعتمد على جودة الصورة، والجهود المبذولة للحد من الضوضاء، وضمان عملية الاتصال. على سبيل المثال، إذا كان التباين كافية، ثم الاستبدال غير ضروري ويمكن إهماله. فمن الحكمة أن الأمثل ووضع الصيغة النهائية للبروتوكول الخاص بمجموعة محددة من الصور والحالات التجريبية والضوابط، قبل جمع البيانات من مجموعة كاملة. أخيرا، يمكن استخدام ملحقات إضافية بدلاً من الآخرين لتوضيح أو شحذ الصور التي لم توصف في هذا البروتوكول مثل تمدد أو التوضيح.
مزايا لهذا البروتوكول هي التوفر العالمي والقدرة على التكيف. وباﻹضافة إلى ذلك، تقييم التبعات الخلية باستخدام أناليزيسكيليتون بسرعة وتنطبق الصورة المجهرية كامل. هناك فائدة نهج تحليل متعددة الخلايا هو التركيز على منطقة بأكملها بدلاً من خلايا مفردة. ولذلك، من الممكن لتقييم التبعات متوسط (من حيث نقاط النهاية وطول العملية) لجميع ميكروجليا داخل الصورة بسرعة. تحليل هيكل عظمى ويقدم تحليلاً لخلايا متعددة: عينة بيانات من حيث عدد الخلايا التي لا يمكن أن يقابله التحليل النمطي هندسي متكرر بسبب استثمار الوقت المطلوب لعزل الخلايا المفردة من photomicrographs. مثيل حيث هذا قد يكون من الأنسب سيكون في فحص مورفولوجيس microglia في التقارب لإصابة في تنسيق. حد واحد تقديم صورة الحقل بالكامل لإنشاء نماذج عظمى من المدينة photomicrographs ناقصة بالمقارنة مع نهج وحيد الخلية أكثر استهلاكاً للوقت. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليلاً لمنطقة ليست ملائمة للظروف حيث مورفولوجيس microglia تختلف جذريا ضمن الحقل نفسه. وأخيراً، يعد هذا الأسلوب تحليل اعتماداً على عدد الخلايا، معلمة التي قد تختلف بين الظروف التجريبية.
التحليل النمطي هندسي متكرر في خلية واحدة ويكمل ذلك تشعبت خلية متوسط بيانات الإخراج الناتجة عن تحليل هيكل عظمى. على الرغم من أن أكثر وقتاً طويلاً، وهذا الاستثمار غلة طائفة واسعة من البيانات شكلي. على سبيل المثال، الخلية الكثافة، نسبة الامتداد، والتدوير بيانات تصف حجم واستطالة، وشكل مخطط الخلية، على التوالي. البعد كسورية ولاكوناريتي تلخيص تعقيد الخلية وعدم التجانس في الشكل، على التوالي. ويرد موجز أكثر تعمقاً لكيفية حساب كل معلمة، وكيف يمكن تفسير البيانات في دليل تفاعلي16 وينبغي النظر في مثل هذه التفاصيل فيما يتعلق بمسألة إجراء بحوث محددة. ويؤدي البروتوكول وصف أدوات حساسة لقياس التغييرات الصغيرة في 2D microglia مورفولوجيس التي قد تحدث في الظروف الفسيولوجية وباثولوجي. تحليل شكلي إضافية مثل الصلابة والتحدب، وشكل عامل16،20 قد يكون ممكناً إذا كان توليد الأشكال ثلاثية الأبعاد.
تطوير البروتوكول والتكيف المستمر ويحركها المستخدم. قد مددت من الأسفار8 للبث الإذاعي الرقمي ومشرق-الميدان الصور7 ولكن ليس بعد البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. علاوة على ذلك، يمكن استخدامه بالتزامن مع البرمجيات الاحتكارية مثل إيماريس لتحليل إضافي. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من علم وظائف الأعضاء ولا يقتصر على microglia ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية أو نسيج مع أنماط معينة أو الأشكال التي يمكن تحديدها باستخدام طرق المدينة. أخيرا، مع حجم عينة كافية، يمكن تطبيقها على تحليل متعدد المتغيرات أو الكتلة على التجهيزة microglia وفقا مورفولوجية12،21؛ هذه معلومات ذات مغزى حيث مورفولوجيا microglia مؤشر حيوي وظائف microglia والردود على البيئة المحيطة بهم. تقدير للتنوع مورفولوجك microglial الآخذة في التوسع وهامة فهم التفاعلات الأوعية الدموية العصبية-إطلاق كامل أثناء الصحة والمرض. ويتعزز النمو في هذا المجال عن طريق بروتوكولات متطورة وسهلة الاستخدام، واستنساخه التحديد الكمي وتلخيص مورفولوجيا microglia استخدام عدة متغيرات مستمرة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تلقت هذه الدراسة دعما ماليا من نينر (F32NR013611). أننا نود أن تقر وشكرا للمطورين من AnalyzeSkeleton(2D/3D) وفراكلاك (كاريراس أرجاندا et al. وكاربيرين et al., على التوالي) دون فيها التحليل الموضحة هنا لن يكون ممكناً.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
