Summary
Mikroglia er hjernen immunceller, der undersøgelse og reagere på ændrede hjernens fysiologi gennem morfologiske ændringer, som kan vurderes kvantitativt. Denne protokol beskriver en ImageJ baseret analyse protokol til at repræsentere mikroglia morfologi som løbende data ifølge målinger som celle forgrening, kompleksitet og form.
Abstract
Mikroglia er hjernen fagocytter, der deltager i hjernen homøostase og løbende undersøge deres miljø for dysfunktion, skade og sygdom. Som de første respondere, mikroglia har vigtige funktioner til at afbøde neuron og glia dysfunktion, og i denne proces, de gennemgår en bred vifte af morfologiske ændringer. Mikroglia morfologier kan kategoriseres deskriptiv, eller alternativt kan kvantificeres som en kontinuerlig variabel til parametre som celle forgrening, kompleksitet og form. Mens metoder til kvantificering mikroglia anvendes til enkelt celler, gælde få teknikker flere mikroglia i en hele photomicrograph. Formålet med denne metode er at kvantificere flere og enkelt celler ved hjælp af let tilgængelige ImageJ protokoller. Denne protokol er en oversigt over trinene og ImageJ plugins anbefales at konvertere fluorescens og lysfelt mikrofotografier til repræsentative binære og skeletteret billeder og til at analysere dem ved hjælp af software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) og FracLac for morfologi dataindsamling. Output af disse plugins opsummere celle morfologi proces slutpunkter, vejkryds, og længde samt kompleksitet, celle form og størrelse deskriptorer. Skelet analyse protokollen beskrevet heri er velegnet til en regional analyse af flere mikroglia i en hele photomicrograph eller en region af interesse (ROI), der henviser til, at FracLac giver en supplerende individuelle celle analyse. Kombineret, giver protokollen et mål, følsomme, og omfattende vurderingsværktøj, der kan bruges til at stratificere mellem forskellige mikroglia morfologier stede i raske og skadede hjernen.
Introduction
Mikroglia har en umiddelbar og forskelligartede morfologiske reaktion på ændringer i hjernens fysiologi1 langs et kontinuum af muligheder der spænder fra hyper-forgrening og meget komplekse morfologier til de-forgrenet og amoeboid morfologier2 . Mikroglia kan også blive polariseret og stang-formede3. Mikroglia celle forgrening defineres almindeligvis som en kompleks figur har flere processer og er ofte rapporteret som antallet slutpunkter pr. celle og længden af celle processer. Da mikroglia er fintunet til neuronal og glial funktion gennem kontinuerlig celle-celle cross-talk og i vivo motilitet4,5, kan mikroglia morfologier tjene som indikatorer for forskellige cellefunktioner og dysfunktioner i hjernen. En kvantitativ tilgang er nødvendigt at tilstrækkeligt beskriver mangfoldigheden af disse morfologiske ændringer og at skelne mellem forskelle blandt forgrenet celler, der opstår med subtile fysiologiske forstyrrelser (f.eks. epilepsi5,6 og hjernerystelse7) ud over brutto skade (såsom slagtilfælde8). Øget brug af morfologi kvantificering7,8,9,10,11,12,13,14 vil afsløre den fulde mangfoldighed af mikroglia morfologier under sundhed og sygdom. De nuværende undersøgelse detaljer trinvis brugen af ImageJ plugins nødvendigt at opsummere mikroglia morfologi fra fluorescerende eller ikke-fluorescerende mikrofotografier af mikroglia erhvervet i faste gnaver væv efter Immunhistokemi (IHC).
Central til analyseteknikker beskrevet her er de ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, udviklet i 2010 at kvantificere store brystkirtler strukturer, og FracLac16, udviklet i 2014 at integrere ImageJ og fraktal analyse til kvantificere individuelle mikroglia figurer. Disse plugins giver en hurtig analyse af mikroglia forgrening inden for hele mikrofotografier eller flere mikroglia af en defineret ROI indenfor en photomicrograph. Denne analyse kan bruges alene eller supplere med fraktale analyse. Encellede fraktal analyse (FracLac) kræver en investering af tid, men giver flere morfologi udgange vedrørende mikroglia kompleksitet, form og størrelse. Brugen af begge værktøjer er ikke overflødige, som cellen forgrening er et supplement til celle kompleksitet, og kombinationen af flere parametre kan bruges til at skelne mellem forskellige mikroglia morfologier inden for datasæt12,17.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinier ved University of Arizona institutionelle dyrs pleje og bruge udvalg og NIH retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Omhu at minimere animalske smerter og ubehag. Dødshjælp metoder er i henhold til en godkendt protokollen og består af cervikal halshugning under isofluran anæstesi.
1. væv forberedelse
Bemærk: Foretage mikroglia morfologi analyse på fast, cryoprotected vævsprøver at bevare celle morfologi. Følgende er en standardprotokol til at forberede og direkte skær fast væv til fluorescens IHC.
- Fjerne mus eller rotte hjerner fra et aflivede dyr efter den ønskede eksperiment og efter en standard laboratorium protokol. Læg hjernen i et 10 mL hætteglas indeholdende 5 mL af en 4% PARAFORMALDEHYD løsning i 24 timer ved 4 ° C. Derefter skylles og sted i 5-10 mL af en 30% saccharose phosphat bufferet løsning (PBS, 0,01 M) i 72 timer ved 4 ° C. Gemme hele hjerner ved-80 ° C indtil væv skæring med en kryostaten eller ved 4 ° C, hvis skæring med en mikrotom.
Bemærk: Denne protokol har ikke endnu blevet testet ved hjælp af væv skåret fra paraffin-embedded væv. - Afsnit hjernevæv til den ønskede snittykkelse og orientering ved hjælp af enten en kryostaten eller mikrotomen og butik frit svævende sektioner i en cryoprotection løsning (50 mM PBS, ethylen glycol, glycerol) ved-20 ° C.
Bemærk: Denne protokol er blevet gennemført på koronale væv sektioner spænder fra 50 µm til 200 µm i tykkelse. Væv sektioner mindre end 50 µm ikke kan fange fuld span af mikroglia processer, mens i tykt væv sektioner, IHC farvning kan vaere svaert på grund af antistof indtrængen i væv. Væv kan være sektioneret enten i en koronale eller sagittal orientering og dette valg vil afhænge af den eksperimentelle mål og hjernen region(er) skal undersøges.
2. Immunohistokemi
Bemærk: Skelet og fraktal analysemetoder, der kan anvendes til enten fluorescens eller 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC. Følgende er en standard fluorescens IHC protokol og kan erstattes efter behov. Fluorescens IHC giver overlegen visualisering af celle processer i forhold til DAB IHC.
- Placere væv sektioner i en 4 mL hætteglas (op til 15 mus hjernen sektioner/vial), og der inkuberes med 1 mL af opløsning indeholdende op til 10% hest serum, PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 ved stuetemperatur (23 ° C) i 1 time.
- Vask for 5 min med PBS (0,01 M) tre gange ved stuetemperatur.
- Inkuber med det primære antistof (Iba1, 1:1, 000) ved stuetemperatur til 72 h i 1 mL af opløsning indeholdende PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3, og dækket (for at bevare NaN3 effektivitet).
- Vask for 5 min med PBS (0,01 M) tre gange ved stuetemperatur.
- Der inkuberes med den sekundære antistoffer (anti-kanin 488, 1:250) dækket ved stuetemperatur i 4 timer i 1 mL oploesning indeholdende PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3
- Vask for 5 min med PBS (0,01 M) tre gange ved stuetemperatur.
- Mount hjernen væv sektioner (antallet og orienteringen baseret på præference) til subbed dias, anvende en blød-sæt montering medium på diaset, og placere coverslip over væv. Gemme dias ved 4 ° C.
Bemærk: 1,5 glas coverslip tykkelse er nødvendig for Konfokal billeddannelse. Soft-sæt er en foretrukne montering medium fordi høj viskositet ikke komprimere væv og bedst bevarer morfologi i forhold til hard-set montering medier.
3. billedbehandling
- Billede Iba1 positive celler i afsnittet hjernen væv ved hjælp af en lyse-felt eller Konfokal mikroskop, der har en z-stakken erhvervelsen kapacitet ved hjælp af en 20 X objektive eller større.
Bemærk: Imaging parametre og software opsætning skal være konstant for alle photomicrograph erhvervelse i et eksperiment. Fremragende proces detaljer opnås ved hjælp af en 40 X eller 63 X mål. Det er muligt at anvende skelet analyse protokollen beskrevet heri en hele photomicrograph eller en multi celle ROI inden for en større photomicrograph.- Erhverve 8-bit billeder ved hjælp af passende softwareindstillinger specifikt til mikroskop-software.
Bemærk: Konvertering af filer til 8-bit efter købet kan fordreje dataindsamlingen. - Erhverve mindst en 30 µm z-stack med mere end 2 µm interval mellem billeder ved hjælp af passende softwareindstillinger specifikt til mikroskop-software.
Bemærk: Mikroskop og software skal tillade billede erhvervelse i en X, Y og Z akse. En z-stak kan forhøjes, og intervallet kan være nedsat for at give ekstra mikroglia detaljer. Til gengæld vil imaging tid stige. Bruge Nyquist prøveudtagningen om muligt til fluorescens mikroskopi.
- Erhverve 8-bit billeder ved hjælp af passende softwareindstillinger specifikt til mikroskop-software.
- Gemme alle filer, som Tif-filer eller som kræves af mikroskop software.
- Åbner Tif-filer i ImageJ og bruge værktøjslinjen til at opdele kanaler ved at klikke på billede | Farve | Split kanaler, og stak billeder ved at klikke på billede | Stakke | X projekt | Maksimale intensitet projektion hvor det er relevant. Gemme som .tif-filer.
4. skelet analyse
- Download FIJI eller ImageJ fra < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. For den individuelle plugins, download AnalyzeSkeleton(2D/3D) fra < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 og hente FracLac fra < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
Bemærk: Hele processen med at konvertere en photomicrograph til et binært skeletteret billede tager mindre end 1 min. - Hvis du bruger et fluorescens photomicrograph, sikre, at billedet er 8 bit og konvertere til gråtoner bedst visualisere alle positive farvning. Bruge værktøjslinjen og klik billede | Opslagstabeller | Grå. Hvis bruger en DAB lysfelt fotografi, første brug FFT bandpass filter plugin (ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | FFT | BANDPASS filter) og derefter konvertere til gråtoner.
Bemærk: Med henblik på denne protokol, ImageJ standardindstillingerne for en FFT Bandpass Filter er tilstrækkelig (filter op til 3 pixels, ned til 40, ingen stribe undertrykkelse). Anvender en FFT Bandpass filter fjerner støj (små features) samtidig med at de generelt større aspekter af billedet. Dette er især nyttigt i lysfelt billeder, hvor opdeler og revner i vævet kan vises som baggrund og dermed komplicere skelet analyse18. - Justere lysstyrke og kontrast, hvis billedet er for svagt og mikroglia proces kan visualiseres. Bruge værktøjslinjen og klik billede | Justere | Lysstyrke/kontrast. Justere skyderne minimums- eller, efter behov, indtil kanterne af histogrammet, men ingen yderligere.
Bemærk: I ImageJ, lysstyrke og kontrast er ændret ved at opdatere billedets opslagstabel (LUT), så pixelværdier er uændret. Max og min. skydere kontrol de nedre og øvre grænser for displayområde med pixelværdier over 255 vises hvide og pixelværdier under 0 vises sorte18. Ved fluorescens mikrofotografier, bør den maksimale skyderen anvendes, boer den mindste skyderen vil blive brugt til mikrofotografier af DAB farves mikroglia. - Køre en Uskarp maskning for at øge kontrasten ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Filtre | Uskarp maske. Med henblik på denne protokol, Imagejs standardindstillinger (en pixel radius af 3 og maske vægt på 0,6) anvendes.
Bemærk: Uskarp maske skærper og forbedrer funktionerne kanten af et billede ved at fratrække et sløret version af billedet (den Unsharp Mask) fra oprindelige, og derefter flette det resulterende billede med høj kontrast version af det oprindelige billede. Derfor filteret Uskarp maskning skaber ikke detaljer, men snarere præciserer de eksisterende detaljer i et billede. Radius indstilling ændringer hvor sløret Uskarp maskning vil være (og dermed hvor meget blur vil blive fjernet), og maske vægt indstilling ændringer graden af kontrast, Uskarp maskning flettes med (og dermed justerer kontrasten i det endelige billede). - Udføre despeckle trin for at fjerne ansjosgydebiomassen støj genereret af Uskarp maskning. Bruge værktøjslinjen og klik processen | Støj | Pletfjerning.
Bemærk: Fjern støj fjerner ansjosgydebiomassen støj ved at erstatte hver pixel med middelværdien i dens 3 × 3 kvarter. Effekten er, at outliers i intensitet er erstattet af den mediane pixel uden at påvirke skarphed kanter18. - Konvertere billedet til et binært tal ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på billede | Justere | Tærskel.
Bemærk: Tærskel lagdeles af gråtonebilleder til funktioner af interesse versus baggrund og konverterer billedet til binære18. - Anvende despeckle, tæt-, og fjerne outliers funktioner: I den resulterende binært billede, der kan være single-pixel baggrundsstøj og huller mellem processer.
- Anvender funktionen despeckle hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Støj | Pletfjerning.
Bemærk: Anvender Pletfjerning til den binære fil billede fjerner enhver resterende single-pixel støj. - Anvend funktionen tæt ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Binære | Tæt.
Bemærk: Dette plugin forbinder to mørke pixel, hvis de er adskilt af op til 2 pixel. - Anvend funktionen Fjern outliers ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Støj | Fjerne afvigende.
Bemærk: Med henblik på denne protokol, lyse outliers er målrettet med en pixel radius af 2 og en tærskel på 50. Dette plugin erstatter en lyse eller mørke afvigende pixel af de mediane pixels i det omkringliggende område, hvis den afviger med mere end en bestemt værdi (tærskel)18.
- Anvender funktionen despeckle hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Støj | Pletfjerning.
- Gemme billedet som en separat fil til fremtidig anvendelse og/eller fraktal analyse og skeletonize billedet ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på proces | Binære | Skeletonize.
- Vælg den skeletteret billede og køre plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på Plugins | Skelet | Analysere skelet, og kontrol boksen gren oplysninger.
Bemærk: Det er sandsynligt, at billedbehandling vil kræve optimering med tilføjelse eller sletning af den ovenfor foreslåede foranstaltninger. I denne proces vurderes skeletteret billeder for nøjagtighed ved at oprette en overlejring af skelettet og det oprindelige billede. Svovldepositioner bør være enkelt oprindelse punkter med processer fra midten; cirkulær svovldepositioner forvirre data og bør undgås gennem protokollen justering. Et eksempel på en enkelt oprindelse punkt versus cirkulære svovldepositioner er illustreret i figur 1.
Fælles problemer resulterer i ikke-repræsentant skeletter og foreslået løsninger:
- Billede for svagt: konvertere til gråtoner, justere lysstyrke/kontrast skydere og/eller anvende Uskarp maske
- For meget baggrund: justere lysstyrke/kontrast skydere, anvende Despeckle og/eller fjerne outliers
- Cirkulær svovldepositioner i skeletteret billede (især for fluorescens billeder): anvende FFT Bandpass filter, og/eller Uskarp maske
- Revner i væv (især for lysfelt billeder): anvende FFT Bandpass filter, og/eller Pletfjerning
- Kopiere alle dataene fra resultaterne og gren oplysninger udgange og indsætte dataene i et Excel-regneark.
- I Excel, trim data for at fjerne skelet fragmenter, der skyldes IHC og image erhvervelse.
- Duplikere eksperiment projektmappen med rå data outputtet fra skelet analyse og tilføje TRIM til filnavnet. Alle efterfølgende data trimning bør forekomme i duplikerede projektmappen for at bevare de rå data for fremtidig brug og reference.
- Bestemme, hvilken længde af fragmenter beskæres fra datasættet ved åbning af skeletteret billedet i ImageJ og vælge værktøjet streg. Måle flere fragmenter, noterer den gennemsnitlige længde, og træffe beslutning om en cutoff værdi.
Bemærk: Med henblik på de data, der præsenteres her, den cutoff længde for uønskede fragmenter er 0,5. Denne værdi skal være konsekvent i hele et datasæt. - Custom sortere Excel regneark ved at klikke på sorter og Filtrer | Brugerdefinerede sorteringsrækkefølger. Sorter efter "slutpunkt voxels" fra største til mindste, og i et nyt niveau af "Mx gren pt" fra største til mindste.
- Fjern hver række, der indeholder 2 slutpunkter med en maksimal filial længde på mindre end skæringsværdien (dvs.., 0,5). Opsummere data i kolonnen slutpunkter til at beregne det samlede antal slutpunkter indsamlet fra billedet.
- Gentag for gren oplysninger data: sortere efter 'filial længde' fra største til mindste. Rulle gennem dataene og fjerne alle rækker, der har en filial længde på mindre end skæringsværdien(dvs.., 0,5). Sum værdierne i kolonnen filial længde til at beregne den summerede længde af alle grene indsamlet fra billedet.
- Gentag trin 4.11.3-4.11.5 for hvert billede/ark, indtil alle data er blevet trimmet og lægges sammen.
- Opdele data fra hvert billede (opsummerede antal slutpunkter og opsummerede filial længde) med antallet af mikroglia svovldepositioner i det tilsvarende billede. Angiv de endelige data (slutpunkter/celle & filial længde/celle) i statistisk software.
Bemærk: Summeres filial længde/celle data kan kræve omlægning fra længde i pixel til mikron.
5. fraktal analyse
Bemærk: FracLac er i stand til at køre en række forskellige form analyser, der ikke er dækket i denne protokol. For en mere detaljeret forklaring af FracLac's forskellige funktioner, se FracLac manual på < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> og tilknyttede referencer 2,16,19. Fraktal analyse benytter protokollen trin 4.1-4.7 beskrevet ovenfor.
- Bestemme størrelsen af Investeringsafkastet, der vil blive anvendt for alle fraktal analyse. Brug rektangelværktøjet til at tegne ROI. Sikre, at kassen er stor nok til at fange hele cellen og kan være konsekvent i hele datasættet.
Bemærk: Brug rektangel udvalg snarere end frihånd udvælgelsen til at sikre, at alle ROIs er den samme størrelse rektangel, og cellerne har derfor samme skala. Dette ville ikke være tilfældet, hvis den freehand udvalg blev brugt fordi ImageJ vil auto-skala en firkantet ROI til at passe forskellige størrelse rektangulære vinduer resulterer i celler med forskellige skalaer. Mens fraktal figurer er skala-uafhængig, er fraktal analyse proces ved hjælp af FracLac for ImageJ afhængig af skala16. Der er således behov for en konsekvent størrelse ROI hele dataindsamlingen. - Tilfældigt vælge mikroglia for fraktal analyse i hver photomicrograph og tilsvarende binært billede. Vælg opdatering at låse ROI på cellens placering i vinduet ROI manager. Brug Ctrl + Skift + D til at duplikere området inden for ROI som et nyt vindue, og Gem derefter cellen beskåret. På den tilsvarende binært billede (fra det skelet analyse), skal du dublere området med den samme celle ved hjælp af ROI manager. Gentag indtil et tilstrækkeligt antal celler har været tilfældigt valgt for fraktal analyse og gemme alle filer.
Bemærk: En tilfældig nummer generator og et nummereret gitter kan bruges til at tilfældigt vælge celler. - Åbn den binært billede med den enkelte celle. Dobbeltklik på malerpenselværktøjet, indstille farven til sort, og Juster pensel bredde efter behov. Bruger de matchende photomicrograph som reference, brug pensel til at fjerne nabocellen processer, oprette en fragmenteret processer og isolere celle af interesse. Når cellen binær er blevet isoleret, Gem den binære fil.
Bemærk: Holde 'alt' vil skifte pensel fra forgrundsfarve (sort) til baggrundsfarven (hvid). - Konvertere binær cellen til en disposition, ved hjælp af værktøjslinjen via processen | Binære | Kontur.
Bemærk: FracLac for billedet J kan bruges på enten faste figurer eller figur skitserer, dog aktuelle konventionen er, at bruge figuren skitserer16. - I værktøjslinjen, åbne FracLac ved hjælp af værktøjslinjen ved at klikke på Plugins | Fraktal analyse | FracLac og vælg BC (boks tælle). I indstillingerne Gitter Design angive Num G 4. Under grafik indstillinger, Afkryds boksen målinger for at analysere den konvekse skrog og afgrænsningsrammen cirkel af cellen. Når du er færdig, skal du vælge OK.
Bemærk: Num G er antallet af boksen tælle gitter retningslinjer anvendes under scanningen, og det anbefalede område for Num G er 4-12. Indstillingen for Num G og det foreslåede område er grundigt gennemgået i FracLac manuel16. Stigende Num G kan betydeligt slow beregning gange. FracLac indstillinger vil kun skal oprettes én gang pr. session. Når indstillingerne er blevet indtastet, vil knappen Scan bliver tilgængelige. - Vælg knappen Skan at køre en box-counting scanning på det valgte billede.
Bemærk: Scanningen vil generere tre vinduer med data output: skrog og cirkel resultater, boks Count Resumé fil og scanne typer. Vinduet Skan typer indeholder en log over de indstillinger, der bruges, såvel som standard afvigelser for visse foranstaltninger. Med henblik på denne protokol, Skan typer vinduet kan bruges ikke og være lukket eller gemt til fremtidig reference. - I vinduet skrog og Cirkel resultater , kopiere alle ønskede data (dvs., tæthed, span ratio og cirkularitet) resultater. Kopier de ønskede data i vinduet Kasse Count Resumé (dvs., fraktal dimension og lacunarity) resultater. Overføre de kopierede data til en Excel-fil eller statistisk software.
Bemærk: En komplet liste over FracLac output data er leveret og grundigt forklaret i FracLac for ImageJ manuel16.
Representative Results
Mikroglia morfologi analyse protokoller heri beskrevne opsummere trin nyttige i behandling af fluorescerende og DAB mikrofotografier for morfometrisk analyse. Disse trin er visuelt sammenfattet i figur 2 og figur 3. Målet med disse trin er at oprette et repræsentativt binære og skeletteret billede, der passende modeller den oprindelige photomicrograph, således at de akkumulerede data er gyldige. Efter protokollens anvendelse, AnalyzeSkeleton plugin resulterer i en mærket skelet billede som antallet slutpunkter og gren (dvs., proces) lengthcan sammenfattes fra resulterende outputfiler. Slutpunkter og proces længde data bruges derefter til at vurdere omfanget af mikroglia forgrening i photomicrograph eller ROI. Figur 4 opsummerer de resulterende data (slutpunkter/celle og proces længde/celle) indsamlet med og uden programmet protokol. Mens lignende tendenser eksisterer, er de data, der er sammenfattet i figur 4F mindre variabel end i figur 4E. Derudover disse data illustrere øget følsomhed for at opdage forskelle mellem grupperne når protokollen anvendes. Endelig skal udvises omhu vedrørende Inter bruger variabilitet i anvendelsen af protokollen. Sådanne forskelle er sammenfattet i figur 5 , hvor de samme data, der blev analyseret af to uafhængige brugere anvender en identisk protokol, som sammenfattet ovenfor.
Yderligere morfologi data er indsamlet fra enkelt celler isoleret fra de binære billeder oprettet under programmet protokol. Protokollen skridt til at analysere mikroglia morfologi forud for og ved hjælp af FracLac plugin er sammenfattet i figur 6. Vi illustrere denne analyse i begge uskadt (figur 6A) og såret (fig. 6B) væv. Repræsentative billeder af binær, skitserede, konvekse skrog/indkapsling cirkel, og afkrydsningsfeltet tælle eksempler for hver celle analyseret med og uden at protokollen ansøgning er vist i figur 6 c-F. Disse billeder hjælpe illustrere oprindelsen af forskelle i morfologi data, som er sammenfattet i figur 6 g.
Figur 1. Illustrationer af skeletteret mikroglia med en cirkulær soma (suboptimal) versus en enkelt oprindelse soma (optimal) og den tilsvarende overlay mellem den skeletteret celle og den oprindelige photomicrograph. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Protokol ansøgning til fluorescerende mikrofotografier. Illustrationer af skelet analyse protokollen anvendes på en fluorescerende photomicrograph med en enkelt celle beskåret for at vise detaljer. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Protokollen ansøgning til lysfelt DAB mikrofotografier. Illustrationer af skelet analyse protokollen anvendes en lysfelt DAB photomicrograph med en enkelt celle beskåret for at vise detaljer. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Dataanalyse med og uden programmet protokol. (A) et eksempel photomicrograph af fluorescerende IHC og beskåret celle svarende til den gule boks i (B). Eksempel binære og skeletteret billeder med (C) og uden (D) protokollen anvendes som beskrevet. Sammenfattende data af mikroglia slutpunkter/celle og proces længde/celle i uskadt (hvid) og såret (grå) kortikale væv med (E) og uden (F) protokollen anvendes. Statistiske analyser ved hjælp af student's t-test og n = 3, ** angiver p < 0,01. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Brugeren forskelle med protokollens anvendelse. Et eksempel på en original billede og protokollen konvertering til binære og skelet billeder af bruger 1 og bruger 2. Forskellene mellem de to billeder er fremhævet med matchende farvede cirkler. Sammenfattende grafer af mikroglia slutpunkter/celle og proces længde/celle data i uskadt og skadede hjerneregioner ved bruger 1 og bruger 2. Statistisk analyse med ANOVA og prøve størrelse er n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Fraktal analyse med og uden programmet protokol. Eksempel på beskåret mikrofotografier af mikroglia i uskadt (A) og sårede (B) cortex med tilsvarende binær (C), og kontur (D) billeder, som følge med og uden at protokollen anvendes. Den tilknyttede konvekse skrog (blå) og omslutter cirkel (pink) for tilsvarende kontur figurer (E) bruges til at beregne figur tæthed, span ratio og cirkularitet (G). Feltet Sammentælling metode er illustreret i (F), og anvendes til fraktal dimension (DB) og lacunarity (λ) beregninger (G). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mikroglia celler er fintunet til fysiologi og patologi inden for deres mikro-domæner og vise en bred vifte af morfologier2 i både subtile7,14 og grov skade8. Brugen af ImageJ protokoller gør mikroglia morfologi kvantificering tilgængelige for alle laboratorier som platform og plugins er en open source billedbehandling software. Mens den beskrevne protokol er fokuseret på billedbehandling og analyse ved hjælp af denne software, begynder konsistens dataindsamling, validitet og pålidelighed med fremragende IHC og mikroskopi. Denne protokol bruges til at forbedre binær, skelet og kontur repræsentationer af hele mikrofotografier og enkelt celler men kan ikke træde i stedet for fattige IHC farvning og mikroskopi, der resulterer i lav kontrast, sløret eller forvrænget billeder. Som en ekstra overvejelse, skal der udvises forsigtighed ikke at flade hjernevæv under opbevaring, før skæring, som uigenkaldeligt ændrer mikroglia morfologi. Endelig, inden for hvert eksperiment mikroglia skal være afbildet ved hjælp af den samme skala som den samme mikroskop. Instrumentering, mål og software varierer blandt mikroskoper, som vil resultere i forskellige størrelse mikrofotografier trods lignende mål og ændre detaljer samt antallet af celler i hver ramme. For eksempel, resulterer billede erhvervelse ved hjælp af en 40 X mål på en Leica SPII i to gange antallet af celler og mindre detaljeret end erhvervelse ved hjælp af en Zeiss 880. Dette er især vigtigt for celle forgrening data indsamlet fra hele rammen i stedet for en enkelt celle, som det bliver et spørgsmål om data prøveudtagning.
Generelt forud skelet analyse, som udnytter den hele photomicrograph enkelt celle fraktal analyse af to grunde. Afgørende celle forgrening af alle celler i en photomicrograph er hurtig, når sammenlignet med enkelt celle fraktal analyse og kan betragtes som en screeningsværktøj, hvis tid er en faktor. Derudover bruges binære billederne stammer under skelet analyse for fraktal analyse. Når afbildet, er der en række kritiske trin, der kan påvirke skelet analyseresultater og indføre bruger-indflydelse. Protokollen trinnene er de fleste variabel mellem brugere er trin 4.2 (øge billedets lysstyrke) og trin 4.5 (fastsættelse af tærsklen). Hvor det er muligt, er en optimal antallet at øge lysstyrken (maks eller min skyderen mellem 0-255) bestemmes og holdt konstant for alle billeder og brugere. Hvor billedet variation er stor, kan brugeren i stedet vælge en lysstyrke, som vil variere mellem billeder. Alternativt, hvis billeder er lyse og kontrast er høj, derefter øge lysstyrken kan udelades og tærskel kan være standardiseret ved hjælp af et speciale tærskel filter (fx., Huang) snarere end den mere variabel standard. Når optimeret, skal parametrene, der overholdes for at minimere yderligere brugerindflydelse.
Et eksempel på bruger variabilitet er præsenteret i figur 5. Dataværdier blev øget i bruger 1 og bruger 2 og derfor variabilitet ville øges, hvis bruger 1 og bruger 2 bidraget til dataindsamlingen. Et eksempel på forskellene i bruger 1 og bruger 2 binære og skeletteret billeder er fremhævet af farvede cirkler (figur 5). I dette tilfælde var begge brugere kortvarigt uddannet bachelor studerende med begrænset ekspertise i mikroglia. Regelmæssige tilsyn og mentorordninger af en ekspert samt øget protokol undervisning2 mikroglia kan reducere Inter bruger variabilitet. Selv om ikke vurderes her, er fraktal analyse mindre Inter bruger variabilitet, fordi binær cellerne manuelt og individuelt isoleret fra en photomicrograph i stedet for at stole udelukkende på tærskel til at bestemme mikroglia figurer. Men alle metoder besidder nogle variation mellem brugere. Derfor, en enkelt bruger (ideelt, trænet af nogle ekspertise i mikroglia celler) bør færdiggøre dataindsamling for en hele datasættet.
Yderligere ændringer kan gøres nemt i denne protokol og afhænger af billedkvaliteten, og bestræbelserne på taget for at reducere støj og sikre proces connectivity. For eksempel, hvis kontrast er tilstrækkelig, derefter Uskarp maske er ikke nødvendig og kan udelades. Det er fornuftigt at optimere og færdiggøre protokollen for et bestemt sæt af billeder, både eksperimentel tilfælde og kontrol, før indsamling af data fra en hele sæt. Endelig, yderligere plugins kan bruges i stedet for andre at afklare eller skærpe billeder, der ikke var beskrevet i denne protokol som spile eller skærpe.
Fordelene ved denne protokol er dens universel tilgængelighed og tilpasningsevne. Derudover er vurderer celle forgrening ved hjælp af AnalyzeSkeleton hurtig og gælder for en hel photomicrograph. En fordel ved multi celle analyse tilgang er fokus på en hel region i stedet for enkelte celler. Det er derfor muligt at hurtigt at vurdere den gennemsnitlige forgrening (i form af slutpunkter og proces længde) af alle mikroglia inden for billedet. Skelet analyse giver en analyse af flere celler: en data prøveudtagning i celle tal, der ikke kan matches af fraktal analyse på grund af den krævede tid investering at isolere enkelt celler fra mikrofotografier. En forekomst, hvor dette måtte være bedst egnet ville være i screening mikroglia morfologier i nærliggende til en fokal skade. En begrænsning er hele feltet image rendering at skabe skelet modeller af IHC mikrofotografier er ufuldstændig i forhold til den mere tidskrævende enkelt celle tilgang. Derudover en region analyse er ikke afpasset omstændighederne hvor mikroglia morfologier er drastisk anderledes inden for det samme felt. Endelig er denne analysemetode, der afhængige af celletal, en parameter, der kan variere mellem forsøgsbetingelser.
Fraktal analyse er udført på en enkelt celle og derfor supplerer den gennemsnitlige celle forgrening data output som følge af den skelet analyse. Selvom meget mere tid forbruge, denne investering giver en bred vifte af morfometrisk data. For eksempel celle tæthed, span ratio, og cirkularitet data beskrive størrelse, strækforlængelse og form af den celle kontur, henholdsvis. Fraktal dimension og lacunarity opsummere celle kompleksitet og figur heterogenitet, henholdsvis. En mere dybtgående Resumé af hvordan hver parameter er udregnet og hvordan data kan fortolkes er fastsat i den interaktive manuel16 og sådanne detaljer bør overvejes i forbindelse med den konkrete problemformulering. Den beskrevne protokol resulterer i følsomme værktøjer til at kvantificere små ændringer i 2D mikroglia morfologier, der kan opstå i fysiologiske og patologiske betingelser. Yderligere morfometrisk analyse som soliditet, Konveksitet og form faktor16,20 kan være muligt, hvis generering af 3D-figurer.
Protokollen udvikling og tilpasning er kontinuerlig og brugerdreven. Det er blevet udvidet fra fluorescens8 DAB/lyse-feltet billeder7 men ikke endnu paraffin indlejrede væv. Det tillæg, det kan bruges sammen med proprietære software som Imaris for yderligere analyse. Denne protokol kan anvendes til en bred vifte af fysiologi og er ikke begrænset til mikroglia men kan anvendes til celler eller væv med bestemt mønstre eller figurer, der kan identificeres ved hjælp af IHC metoder. Endelig, med tilstrækkelig stikprøvestørrelse, en flerdimensional eller cluster analyse kan anvendes til at stratificere mikroglia ifølge morfologi12,21; Dette er meningsfulde oplysninger som mikroglia morfologi er en vigtig indikator for mikroglia funktioner og svar hen til deres omgivelser. Påskønnelse for microglial morfologiske diversitet er voksende og vigtigt at fuldt ud forstå neuron-glia-vaskulære interaktioner under sundhed og sygdom. Vækst i feltet forstærkes af veludviklede, nem at bruge og reproducerbar protokoller til at kvantificere og opsummere mikroglia morfologi ved hjælp af flere løbende variabler.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse modtog økonomisk støtte fra NINR (F32NR013611). Vi ønsker at anerkende og takke udviklere af AnalyzeSkeleton(2D/3D) og FracLac (Arganda Carreras et al. og Karperien et al., henholdsvis) uden som analysen beskrevet heri vil ikke være muligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
