Summary
Smittsomme lungebetennelse er blant de vanligste infeksjonene i menneskelig. En passende i vivo modell er avgjørende for forstå sykdom patogenesen og teste effekten av romanen therapeutics. Med denne murine orofaryngeal aspirasjon lungebetennelse modellen, kan en undersøke patogenesen og nye behandlinger mot disse dødelige infeksjoner.
Abstract
Murine infeksjon modeller er avgjørende for å forstå sykdom patogenesen og teste effekten av romanen therapeutics designet for å bekjempe forårsaker patogener. Smittsomme lungebetennelse er blant de vanligste infeksjonene presenteres av pasienter i klinikken og garanterer dermed en passende i vivo -modell. Typisk lungebetennelse modeller bruker intranasal vaksinasjon, som innskudd overdreven organismer utenfor lungene, forårsaker off-målet komplikasjoner og symptomer som sinusitis, gastritt, enteritt, fysiske traumer eller microparticle misting for å etterligne aerosol spre mer typisk for viral, tuberculous eller fungal lungebetennelse. Disse modellene gjenspeiler ikke nøyaktig patogenesen av typiske samfunnet eller helse-ervervet bakteriell lungebetennelse. I kontrast etterligner denne murine modellen av orofaryngeal aspirasjon lungebetennelse slippverktøy ruten i healthcare ervervet lungebetennelse. Suspensjon i oropharynx bedøvet mus vaksinere 50 µL av bakterier som forårsaker refleksiv aspirasjon, som resulterer i lungebetennelse. Med denne modellen, kan en undersøke patogenesen av lungebetennelse-forårsaker patogener og nye behandlinger for å bekjempe disse sykdommene.
Introduction
Lavere luftveisinfeksjon er verdens dødeligste smittsomme sykdommer og den vanligste årsaken til dødsfall i utviklingsland1. Globalt, utgjør disse infeksjonene mer enn 3,2 millioner dødsfall1. I tillegg nosocomial lungebetennelse er blant de vanligste og dødelige formene for helsetjenester ervervet infeksjoner, og er forårsaket av den mest antibiotika-resistente patogener2,3. Oppkjøpet av bakteriell lungebetennelse både markedsstøtte ervervet og nosocomial lungebetennelse typisk ruten blir orofaryngeal innhold i alveoler. Murine modeller brukes til å studere disse sykdommene ofte bruke intranasal inoculation4, innskudd mye av bakterier utenfor lungene, forårsaker off-målet komplikasjoner og symptomer som bihulebetennelse og fysiske traumer, som er incongruent med sykdommen fremdrift i mennesket som modellene var designet for å etterligne. Andre modeller kan bruke innånding kamre og micromisting enheter, som mer nøyaktig etterligne viral, tuberculous og fungal lungebetennelser, men ikke nøyaktig er recapitulate den vanlige ruten for kjøp for vanlig bakteriell lungebetennelser.
Murine orofaryngeal aspirasjon lungebetennelse modellen kan brukes til å simulere naturlig ruten og patogenesen ved bakteriell lungebetennelse. Av vaksinere 50 µL av bakteriell suspensjon i oropharynx bedøvet mus med en pipette, følger refleksiv aspirasjon, som resulterer i smittsomme lungebetennelse. Bruker denne modellen, kan en undersøke patogenesen av lungebetennelse-forårsaker patogener og nye behandlinger for å bekjempe disse sykdommene med en høyere fidelity modell, mer slik som aspirasjon lungebetennelse infeksjoner i mennesker. I tillegg, i motsetning til lignende modeller som infisere gjennom munnhulen5,6, sikrer denne modellen at hele inoculum når lungene i stedet for tarmen, kan forårsake off-site betennelser og infeksjoner, som gastritt og enteritt. Til slutt, i motsetning til en annen publiserte modell som krever en laryngoskop og inoculates gjennom spor7, denne modellen hindrer ikke luftveiene med en gavage nål og krever ikke injeksjon for inoculum levering. I stedet er inoculation avhengig av den naturlige aspirasjon refleks museklikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr må godkjennes av forskerens institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. utarbeidelse av bakteriell Inoculum
- Isolere bakteriell koloniene.
- Strek en bakteriell belastning (f.eks A. baumannii "HUMC1") på aktuelle sterilt agar medium (f.eksTryptic soya agar), være forsiktig å generere isolert kolonier.
- Ruge på riktig forhold (f.eksovernatting på 37 ° C).
- Vokse over natten kultur.
- Velg en representant, isolerte koloni fra agar platen med en bakteriefri inoculating løkke og bruke den til å vaksinere 10 mL av aktuelle sterilt kjøttkraft medium (f.eks, Tryptic soya buljong).
- Kan prøve å nå den stasjonære fasen på de riktige forholdene (f.eks37 ° C med skjelvende på 200 rpm overnatter i ventilert-cap, 50-mL konisk ampuller).
- Vokse subkultur.
- Overføre 100 μL av natten kultur til 10 mL av fersk sterilt kjøttkraft bruker en pipette.
- La nå eksponentielle/log fase på de riktige forholdene (f.eks37 ° C med skjelvende på 200 rpm for 3t i ventilert-cap, 50-mL konisk ampuller).
- Vask subkultur.
- Fjern subkultur fra omgivelsene incubating.
- Sentrifuge på 4000 × g for 5 min til pellets bakterier.
- Sug opp og kast nedbryting.
- Legg til 10 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) pellets og vortex kraftig til fullt resuspended.
- Gjenta trinn 1.4.2 - 1.4.4 to ganger for totalt 3 vasker.
- Justere konsentrasjonen av bakteriell suspensjon.
- Bruker et spektrofotometer som måler optisk densitet ved 600 nm (OD600), måle den optiske densitet for bakteriell suspensjon.
- Legge til sterilt PBS bakteriell suspensjon før den optiske densitet for inoculum synker til et OD600 på 0,5, ved hjelp av formelen Cjeg× Vjeg = Cf× Vf, der "C" er konsentrasjon, "V" er bind, "jeg" er første, og "f" er endelig. * Cf bør alltid være 0,5; Vf er variabelen å løse.
- Hvis bakterielle suspensjon faller under et OD600 på 0,5, sentrifuge det 4000 × g i 5 min pellets bakterier og fjerne en passende mengde nedbryting å nå et OD600 på 0,5.
- Utføre føljetong fortynninger i sterilt PBS (f.eks, tre 1: 100 fortynninger å oppnå 1 × 10-6) og plate sterilt agar å bestemme korrelasjonskoeffisienten som avslører bakteriell konsentrasjonen i colony-forming enheter per mL (CFUs/mL) på et OD600 på 0,5.
Merk: Verdien av denne produktkorrekasjonskoeffisienten varierer for hver stamme av hver art og må bli fastsatt før inoculum forberedelse til en infeksjon. - Etter fastsettelsen korrelasjonskoeffisienten, bruke den til å opprette en inoculum av ønsket konsentrasjonen (f.eks, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Hvis den ønskede inoculum er større enn OD600 på 0,5, sentrifuge bakteriell suspensjon på 4000 × g i 5 min pellets bakterier og fjerne en passende mengde nedbryting å nå ønsket konsentrasjonen.
- Utføre i vivo pilotstudier for å fastslå virulens av hver bakteriell isolere i hver stamme av mus som disse verdiene varierer mellom bakteriell isolater av samme art og mus av ulik genetisk bakgrunn. For ulike Gram-negative arter er den LD100 mus vanligvis 1-5 × 108 CFUs/mus, selv om enkelte stammer er dødelig på lavere inocula.
- Fryse identiske dele for fremtidig bruk som behovsbetinget, presis inocula, som er publisert tidligere8 (valgfritt).
- Forberede 1 L bakteriell inoculum som beskrevet ovenfor, overføring til to 500 mL konisk ampuller og sentrifuge på 4000 × g for 5 min.
- Forkast 450 mL nedbryting fra hvert konisk hetteglass og resuspend pellets bakterier i gjenværende nedbryting.
- Overføre konsentrert bakteriell inoculum til en 250 mL kanne inneholder en magnetic røre bar og bland kontinuerlig over en rør plate på 300 rpm.
- Nøye overføre nøyaktig 600 μL konsentrert bakteriell inoculum (f.eks, 1 × 1010 CFUs/mL) bruker en pipette for 1.6-mL kryogene ampuller som inneholder nøyaktig 300 μL sterilt H2O og 300 μL sterilt glyserol; Bland og lagre på-80 ° C.
Merk: Glyserol nødvendig for lagring kan forvirre eksperimentelle resultatene og forårsake overflødig dødelighet så det er nødvendig å vaske det ut. - Når du er klar til bruk, tine utvalget for 10 min ved romtemperatur.
- Overføre 1 mL til 50 mL konisk ampuller, legge til 9 mL steril PBS og sentrifuger på 4000 × g for 5 min til pellets bakterier. Sug opp nedbryting og resuspend forhåndsbestemt antall CFUs (1 mL × frosset lager konsentrasjon i CFUs/mL) i en passende mengde PBS nå ønsket konsentrasjonen for den smittsomme inoculum.
2. anesthetizing mus
- Ketamin/Xylazine
Merk: Anestesi med ketamin/xylazine har en lang varighet, som tilbyr nok tid for forskeren som er ny på denne teknikken å fullføre inoculation fremgangsmåten før musen våkner.- Forberede 10 mL av injiserbare løsning ved å kombinere 8,5 mL pharmaceutifcal klasse PBS, 1 mL av 100 mg/mL ketamin lagerløsning (siste konsentrasjon 10 mg/mL), og 0,5 mL 20 mg/mL Xylazine lagerløsning (siste konsentrasjon 10 mg/mL).
- Administrere 10 μL/g av intraperitoneal (IP)-injeksjon (f.eks, 250 μL for 25-g mus).
- Ophthalmica salve gjelde øynene til mus anesthetized med ketamin/Xylazine fordi øynene er utsatt for skade under lengre anestesi.
- Plasser musen i et bur og overvåke før det våkner opp fra anestesi.
Merk: Dyret må ikke forlates før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Isoflurane
Merk: Mus raskt våkne isoflurane-indusert bedøvelsen etter tilværelse fjernet fra induksjon kammeret, så denne metoden for anestesi bør bare brukes etter bli dyktigere på vaksinering prosedyren.- Plass naiv mus i en passende størrelse induksjon kammer med oksygen strømmer.
- Etter kammeret er forseglet stengt, bedøve mus med en presisjon vaporizer for å legge isoflurane på 4% (v/v) i minst 5 min; bekrefte anestesi ved å fjerne en mus fra induksjon kammeret og måle hvor lang tid det tar for å våkne fra anestesi (~ 60 s).
Merk: Vær oppmerksom på at anestesi ganger kan variere basert på institusjonelle retningslinjer og noen dyr kan kreve mer enn 5 min til bli fullt anesthetized. - Opprettholde anestesi for opptil 10 min ved å justere isoflurane konsentrasjonen til 2-3%. Hvis total varighet for anestesi > 15 min ophthalmica salve gjelder øynene til bedøvet mus.
- Plasser musen i et bur og overvåke før det våkner opp fra anestesi, som i trinn 2.1.
3. vaksinere/infisere mus
- Suspendere en bedøvet mus, henger den i sin øvre fortenner på en sterk, tynn snor (f.eks, tanntråd) sikret til et fast objekt i en høyde ca dobbelt musen er kroppens lengde (f.eks20 cm) over drift overflaten (f.eks laboratoriebenk).
- Trekk forsiktig musen er tungen ut av munnen med steril, Butt-slutt tang. Overføre tungen til en steril, hansker finger for å hindre utilsiktet crushing av musen er tunge. Holde tungen utenfor munnen, tilgang til oropharynx og hindre svelger inoculum til siden.
- Mens du holder musen er tungen, plassere 50 μL inoculum (bakteriell suspension) i oropharynx ved hjelp av brønnene; oropharynx ligger i krysset av munnhulen og pharynx mot baksiden av munnen.
Merk: Det er svært viktig å bare levere væske av pipettering til første stopp på av brønnene. Musen vil slutte å puste i noen få sekunder når inoculum er plassert i oropharynx; til slutt, vil refleksiv aspirasjon føre musen å inhalere bakteriell suspensjon, angitt av særegne knitrende støy væske inn i lungene, som resulterer i lungebetennelse infeksjon. - Hvis inoculum ikke er plassert langt tilbake nok til å blokkere normal åndedrett, klemme nares med tang tvinge refleksiv aspirasjon gjennom munnen og påfølgende innånding av inoculum.
- Etter vaksinasjon, frigi tungen, fjerne musen fra suspensjon strengen, plasserer den i et bur og overvåke før det våkner opp fra anestesi, som i trinn 2.1.
4. overvåking sykdomsprogresjon
Merk: På grunn av dyr lider,-ulike indikatorer, bør brukes til å angi når mus blir døende; Eutanasi skal utføres etter denne bestemmelse, i samsvar med en tidligere godkjent IACUC protokoll; ulike markører for moribundity inkluderer kroppstemperatur, vekttap, utseende, gangart og andre biomarkers som kan oppnås fra blod (f.eks via tlf)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Euthanize mus etter tidligere godkjente IACUC protokollen (f.eks, CO2 etterfulgt av cervical forvridning).
- Fjern lungene fra euthanized musen ved å kutte i luftrøret, lungearterien og pulmonary blodåre nær lungene.
- Mikroskopi
- Plass lungene (eller del) i en prøven mold.
- Fyll prøven mold med Optimal kutte temperatur (O.C.T.) sammensatte, helt submerging vevet.
- Fryse prøven på-80 ° C.
- Send prøven til en patologi lab delen og montere på lysbilder for mikroskopi.
- Bakterielle belastningen
- Veie lungevev på en analytical balanse.
- Overføre lungevev til 50 mL konisk ampullen inneholder 2-5 mL steril PBS (avhengig av vev).
- Homogenize lungevev med en vev homogenizer.
- Utføre føljetong fortynninger av homogenate i sterilt PBS å oppnå ca 1000 CFUs/mL, basert på forventede bakterielle belastningen i lungene.
- For eksempel, hvis 1 × 109 CFUs/mg er forventet, utføre tre 1: 100 fortynninger: overføre 100 μL homogenate til 9.9 mL PBS og vortex; Dette er den første 1: 100 fortynning. Overføre 100 μL første 1: 100 fortynning til 9.9 mL PBS og vortex; Dette er den andre 1: 100 fortynning. Overføre 100 μL andre 1: 100 fortynning til 9.9 mL PBS og vortex; Dette er den tredje og siste 1: 100 fortynning.
- Hvis bakterielle belastningen i lungene er ukjent, kan du utføre en rekke fortynninger å fange forventede området.
- Platen dilution(s) på sterilt agar.
- Forberede sterilt Tryptic soya kjøttkraft (TSB) med agar (TSA) plater: kombinere 30 g TSB, 15 g agar, 1 L vann, bland med en magnetisk rørestang og varme til koking ved ~ 100 ° C i 5 min. Tillat avkjøles og deretter autoklav på flytende syklus for 15 min. Tillat avkjøles til ~ 55 ° C, overføring 10 mL fersk autoklaveres TSA sterilt Petri retter, og la avkjøles til romtemperatur. La tørr på Borstemmaskin til 2-5 d eller avdekket under en biosafety regjering i 10 min.
- Overføre 100 μL fortynning til en Petriskål inneholder sterilt TSA og spredt over TSA bruker en spreder eller glass perler.
- Lagre Petriskål overnatting på 37 ° C i en fuktet inkubator (dvs., 37 ° C inkubator inneholder en avdekket 1-liters kanne fylt med vann)
- Bestemme CFUs/mL lunge homogenate basert på agar plating (f.eks100 CFUs på TSA plate med 100 μL tredje og siste fortynning beskrevet ovenfor ville være 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Beregne CFUs/mg lungevev basert ved CFUs/mL lunge homogenate av mg lunge vev/mL homogenate (f.ekshvis prøven beskrevet ovenfor brukt 100 mg av lungevev homogenisert i 5 mL av PBS, 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).
- Mikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å nøye følge protokollen, oppnås reproduserbare og robust enkelt. Det er kritisk til en tilpasset inoculum forberedelse protokoll for eksperimenter sammenlignes med en hverandre. Det er også viktig å håndtere mus under infeksjon prosedyren. Husk å plassere mus i en bedøvelse kammer uten isoflurane. Mus vil få panikk hvis de plasseres i et kammer som er pre fylt med isoflurane og erfarer overskytende stress, som kan muligens kompromittere eksperimentelle resultater. Etter å sikre beholder lokket, langsomt introdusere isoflurane ved å gradvis øke konsentrasjonen fra 0% til 4% (v/v); hast administrere isoflurane kan også forårsake mus å få panikk. Når mus blitt bevisstløs, redusere isoflurane konsentrasjonen til 2-3% (v/v), og tillate dem å være i kammeret i ytterligere noen minutter. På dette punktet, mus er klar til å bli infisert (figur 1).
Fjern en mus fra anestesi kammeret og stoppe den av sine topp fortenner til tungen (figur 2). Bruk blunt endte tang til trekk forsiktig ut tungen (Figur 3) deretter overføre tang holdt tungen til et sterilt, hansker fingre (Figur 4) å unngå traumer musen er tunge. Med tungen fortsatt utenfor munnen, overføre 50-µL inoculum til oropharynx (figur 5). Her er det svært viktig å bare levere væske av pipettering til første stopp på av brønnene. Fortsetter til andre stopp kan innføre en stor boble i inoculum som forstyrrer infeksjonen.
Når infeksjonen er fullført, finnes det en rekke alternativer for testing mus. For patogenesen studier, kan man sammenligne infisert til infiserte vev (figur 6). Hvis analysere effektiviteten av romanen therapeutics, kan fjerne lungene og har dem delt og farget. Dette kan gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon (figur 7).
Et annet alternativ er å vurdere bakterielle belastningen i lungene av infiserte mus. Dette gjøres ved å fjerne lungene, overføre til ampuller som inneholder et kjent volum av sterile PBS, deretter homogenisere med en vev homogenizer (skylling mellom hver prøve å forhindre). Kontaktflate føljetong fortynninger av lunge homogenate på næringsrike agar kan beregne CFUs/mL for hver lunge homogenate og senere CFUs/mg lungevev (Figur 8). Dette kan også gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon.
Det finnes utallige andre analyser som kan utføres, inkludert cytokin analyser (figur 9), sepsis biomarkers av tlf (Figur 10), flowcytometri å undersøke celle overflate markører, mobilnettet profilering, RNAseq, osv.
Figur 1 : Å bestemme LD100. Det er nødvendig å infisere mus med ulike inocula konsentrasjoner å bestemme LD100. Her inoculum 2 × 108 CFUs/mus er for høy, 5 × 107 og 2 × 107 er for lav, og 1 × 108 er riktig.
Figur 2 : Henger mus i øvre fortenner. Når mus er anesthetized, fjerne en mus fra induksjon kammeret, (A) Bruk tang til å trekke ut en løkke av streng sikret 20-30 cm over arbeidsflaten, (B) flytte strengen bak musen er øvre fortenner, (C) sikre strengen sikres bak øvre fortenner, og (D) la musen henger i sin øvre fortenner på loop strengen.
Figur 3 : Dra tungen ut av munnen med tang og overføring til hansker fingre. Etter henger musen i sin øvre fortenner, (A) Bruk tang til å forsiktig ta tak musen er tungen (B) trekk forsiktig ut tungen, (C) nøye overføre tungen fra tang til hansker fingre å unngå traumer musen er tungen, og (D) holde tungen på plass med hansker fingre. Husk å bruke nok press for å hindre at tungen gli tilbake i munnen, men ikke så mye press at traumer oppstår. Tungen bør holdes utenfor møll og til side å tillate brønnene tilgang i neste trinn. På dette punktet, er musen klar for infeksjon.
Figur 4 : Infisere musen. Opprettholde tungen utenfor munnen, bruk brønnene overføre 50-µL inoculum til oropharynx. Plassere Pipetter inn i munnen på baksiden av tungen og dispensere bakteriell suspensjon, bare gå til de første i brønnene; ikke gå til andre stopp som dette kan innføre en stor boble i inoculum som kan forstyrre komplett aspirasjon.
Figur 5 : Mikroskop-bilde av sunn (infisert) vs infisert lungevev. Hematoxylin og eosin (H & E) flekker av lunge deler før og etter orofaryngeal aspirasjon av A. baumannii, som viser ruten ventilator-assosiert lungebetennelse (VAP), resulterer i død vanligvis innen 1-3 dager og betydelig alveolar betennelse sett her.
Figur 6 : Vurdere bakteriell byrden; gjengitt og endret med tillatelse14 . Etter infeksjon mus, fjerne lungene ved disseksjon etter vellykket euthanasia i samsvar med gjeldende IACUC protokollen. Samle massen av lungevev, overføre til ampuller som inneholder et kjent volum (2-5 mL) av sterile PBS og homogenize med en vev homogenizer. Pass på å rense homogenizer med etanol og sterile PBS mellom hver prøve å forhindre. Utføre føljetong fortynninger av lunge-homogenate og plate ulike fortynninger på næringsrike agar og ruge hensiktsmessig for valgte patogen. Beregne CFUs/mL for hver lunge homogenate basert på CFUs/plate × fortynning, og deretter dele mg lunge vev/mL lunge homogenate. Dette kan gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon. Medians vises med feilfelt som representerer interquartile områder. p < 0,05 behandlet og ubehandlet gruppe.
Figur 7 : Mikroskop-bilde av infiserte lungevev, ubehandlet vs behandlet; gjengitt og endret med tillatelse14 . Etter infeksjon mus, fjerne lungene ved disseksjon etter vellykket euthanasia i samsvar med gjeldende IACUC protokollen. Riktig bevare vevet (f.eks, midt i Optimal kutte temperatur gel og frosset ved-80 ° C) deretter sende til patologi laboratorium eller andre dyktige individuelle for skjæring og flekker. Dette kan gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon.
Figur 8 : Cytokin analyse; gjengitt og endret med tillatelse14 . Analysere sirkulerende cytokiner, skaffe nok blod (f.eks, 50 µL via hale skår), la koagulere i 30 min ved romtemperatur, sentrifuge 1000 × g for 10 min ved 4 ° C, og samle serum supernatant. Serum kan deretter analyseres av Luminex multiplex for cytokiner. Dette kan gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon. Medians vises med feilfelt som representerer interquartile områder. p < 0,05 behandlet og ubehandlet gruppe på samme tidspunkt.
Figur 9 : Sepsis biomarkers, opptrykk og modifisert med14 . Analysere sepsis biomarkers, skaffe 75 µL blod (f.eksvia hale skår) og raskt overføre til en tlf kassett som tester ønsket analytter. Dette kan gjøres på ett tidspunkt eller flere tidspunkt å vise sykdomsprogresjon. Medians vises med feilfelt som representerer interquartile områder. p < 0,05 behandlet og ubehandlet gruppe på samme tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å være sikker, er mus ikke miniatyr mennesker. Resultatene fra musen modeller må vurderes i sammenheng og deretter tolkes for anvendelighet til mennesker, basert på forskjeller og likheter mellom de to arter6. Det er også viktig å velge riktig musen belastningen som enkelte er mer utsatt for noen infeksjoner enn andre. det samme gjelder patogen belastningen valg16.
Det er viktig å utføre infeksjoner i en krevende og svært reproduserbar måte. Inocula kan være dødelig for mus på én verdi, men ufarlig selv 90% av verdien. Derfor er det viktig at alle vilkårene i denne protokollen er gjengitt på nøyaktig samme måte, spesielt når forbereder inoculum og infisere. I tillegg vil hver patogen føre til sykdom på en unik inoculum. Derfor er det nødvendig å utføre piloten eksperimenter for å finne den riktige inoculum for hver stamme av patogen og i hver stamme av musen.
Med Gram-negative bakterier er en inoculum av ≤5 × 108 CFUs/mus tilstrekkelig til å forårsake død i virulente stammer. Det anbefales å ikke bruke stammer som ikke-dødelige ≤1 × 109 CFUs/mus fordi de foreslår tvilsomme relevans til patogenesen basert på ren mengde materiale blir plassert i lungene16.
Sammenlignet med andre, det er svært få teknisk komplikasjoner for orofaryngeal aspirasjon lungebetennelse modellen og reproduserbarhet er langt større. Bare ett mindre komplikasjon av modellen resultatene når overflatespenning rundt 50-µL inoculum plassert i oropharynx gir nasal åndedrett, utelukker aspirasjon-the årsak til infeksjon. I dette tilfellet tvinger bare klemme nares med tang refleksiv aspirasjon gjennom munnen og påfølgende innånding av inoculum å indusere smittsomme lungebetennelse. Dette er imidlertid en teknisk feil av teknikeren, som er lett unngått med minimal trening.
I form av dens relevans for menneskelig sykdom er en begrensning av denne modellen, som andre modeller av Gram-negative bakterielle infeksjoner, hurtighet i progresjon av sykdommen. Mennesker er sjelden infisert med store bolus av en bakteriell suspensjon derfor mus videre til sykdom så raskt. Likevel gjennomgå alle FDA-godkjent behandlinger slik translasjonsforskning visninger i dyremodeller å vurdere sitt terapeutiske potensial før den går til kliniske studier i mennesker. Ironisk nok, hurtighet i modellen er også en attraktiv funksjonen, siden det kan gi klarhet på terapeutiske effekten innenfor en kort tidsperiode.
Ingen murine modell er perfekt, men dette er en modell med evnen til å etterligne trofast ruten av infeksjon og patogenesen ved menneskelige sykdommer og vurdere effektiviteten av potensielle therapeutics, og dermed slik at for rask oversettelse av romanen terapi som desperat trengte i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer på National Institutes of Health [Grant tall R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 og R42 AI106375 til BS] og US Food and Drug Administration [kontrakt HHSF223201710199C til BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
